遺傳性對稱性色素異常癥ADAR1基因剪切突變一例

湯莊力 王曉鵬 肖生祥

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·論著·

遺傳性對稱性色素異常癥ADAR1基因剪切突變一例

湯莊力 王曉鵬 肖生祥

目的： 檢測一例遺傳性對稱性色素異常癥散發病例ADAR1基因突變。方法： 提取患者及100名健康對照外周血DNA，采用聚合酶鏈式反應(PCR)擴增ADAR1基因的全部外顯子并測序。結果： 該患者ADAR1基因11號外顯子與11號內含子交界處檢測到一新的c.3091+1G>T剪切突變，家族成員及100例無關正常人中未發現突變。應用Mutation Taster進行剪切突變蛋白功能預測分析，提示該突變為致病剪切突變，可能導致編碼蛋白的催化結構域丟失。結論： 本例患者檢測到一個ADAR1基因新的突變位點，豐富了突變譜。

遺傳性對稱性色素異常癥； 剪切突變； ADAR1基因

遺傳性對稱性色素異常癥(dyschromatosis symmetrica hereditaria, DSH, MIM127400)是一種發病率較低的，具有高外顯率的常染色體顯性遺傳疾病。其臨床表現為發生在手足伸側的對稱性色素減退及色素沉著斑。部分患者顏面部位亦可受累，表現為雀斑樣改變。組織病理示：色斑處表皮棘層下部和基層內黑素增加，其下真皮上部嗜黑素細胞增多及少量淋巴細胞浸潤，而白斑處基層色素減少乃至消失[1]。2003年，Zhang等[2]將本病定位在1號染色體1q11～1q21區域內，同年日本學者Miyamura等[3]將致病基因確定為該區域內雙鏈RNA特異性腺苷脫氨酶(adenosine deaminase, RNA specific, ADAR1)基因。本研究運用PCR技術檢測1例散發患者ADAR1基因突變位點。

1 材料和方法

1.1 臨床資料 患者，男，27歲。父母非近親婚配。自3歲時手足背部出現散在針尖大小色素減退斑伴色素沉著斑，其間皮膚顏色正常(圖1)。皮損隨患者年齡增大逐漸增多增大，光照后皮損加劇，冬季有所減輕，患者既往未予重視，否認其他系統疾病史。家族中無類似病史。

1.2 標本收集 向患者及其直系近親充分闡明本研究目的及意義，獲取其知情同意后經肘正中靜脈采集外周靜脈血2 mL，EDTA抗凝，-80℃深低溫保存。募集100名健康志愿者(募集入選條件：男女不限，24～28歲，無系統疾病)，獲取知情同意后采集外周靜脈血2 mL作為對照，血樣編號后相同條件下保存。

1.3 DNA提取 凍存外周血樣完全融化后用全血基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技)提取基因組DNA備用。

圖1 患者手部皮損

1.4 聚合酶鏈式反應擴增ADAR1基因全部外顯子 采用Primer3.0軟件設計ADAR1基因15個外顯子共17對引物。擴增11號外顯子的上游引物為5’- TCCCATGGTAGGCCTTAGAA -3’；下游引物為5’- CTGTGCCCAGTGACTAATGG -3’。擴增目的片段長度約為358 bp。PCR體系為20 μL，上下游引物各1 μL 、DNA模板3 μL、DEPC水5 μL、PCR mix 10 μL，反應條件為預變性95℃，5 min；35個擴增循環，每個循環由變性(94℃，30 s)、復性(56℃，30 s)、延伸(72℃，1 min)；72℃延伸5 min。PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠/紫外線以了解產物情況。

1.5 DNA序列分析 PCR產物純化后經ABI3730XL型全自動熒光DNA測序儀(Applied Biosystems, CA, USA)測序。將測序所得序列與Gen Bank中人類ADAR1基因序列進行比對，分析SNP及突變情況。

2 結果

2.1 基因測序結果 該患者基因組DNA經PCR、DNA測序后在第11外顯子與第11內含子交界處檢測到一新的c.3091+1G>T剪切突變(圖2)，導致第11號內含子剪切受體發生改變。正常的100人對照及患者直系近親均未見此剪切突變。其余外顯子及內含子均未見突變。

2.2 剪切突變功能預測分析 應用Mutation Taster軟件進行剪切突變蛋白功能預測分析[4]，以該突變點兩側各6 bp范圍的DNA序列為目標序列進行檢索，結果提示該突變為致病剪切位點突變，可能影響正常剪切并使得蛋白質功能受到影響。檢索序列共有兩個限制性內切酶識別位點，分別為c.3091+3位點的GAGT以及c.3091+1位點的GTGA，兩者的突變型較野生型對蛋白質功能的影響均顯著增加。

對蛋白特征改變進行預測提示，除了下游蛋白質序列可能發生改變外，所編碼蛋白的催化結構域可能丟失。通過與ExAC及1000G數據庫進行比對，未發現已報道的相關突變。

c.3091+1G>T mutation in Intron11 of ADAR1 gene in the patient

3 討論

遺傳性對稱性色素異常癥發病率至今少見報道，該病曾被普遍認為是罕見病且僅發生于東亞尤其是日本和中國[5]，但近年歐美國家關于該病的報道亦可見諸筆端[6]。一般認為由于色減斑或色沉斑與白種人或黑種人膚色相近，易被患者忽視或錯診、漏診及誤診。同時該病無礙患者生存，且非增齡性疾病，輕癥僅對患者生活質量造成影響，部分患者因此不愿就診。

該病目前仍無特效療法，可通過避免日光直接暴曬減慢疾病進展。患者于40歲左右后有自行緩解的趨勢，但無法痊愈[1]。

ADAR1基因編碼的雙鏈RNA特異性腺苷脫氨酶全長1226個氨基酸，分為6個結構域，分別為2個Z-DNA結合結構域(Zα, Zβ)，3個dsRNA結合結構域(DRBM1,DRBM2,DRBM3)，1個催化結構域[7]。該酶廣泛分布于全身各組織器官，通過將mRNA前體靶位點的腺嘌呤催化為次黃嘌呤完成RNA編輯[8]。當該基因發生剪切突變時，突變位點不能被限制性核酸內切酶正確識別并催化，可能造成片段插入或出現提前終止密碼子(premature termination codons)，造成基因轉錄翻譯異常進而導致疾病發生[9]。在已報道的可能致病突變中，剪切突變所占比例最小，累計報道12例(T1601+2G,A1935-2G,G2080-1A,T2270+2G,A2271-3G,T2668+2A,G2763-1T,A2886-2C,c.3020-2A>T,G3202+5A,A3203-2G,G 3315+1 A)[10-19]，約占現有所有突變報道的7%，且其中僅3例報道通過進一步實驗明確了理論的蛋白質改變。

從基因結構上分析，ADAR1基因11號外顯子位于催化結構域中，其c.3089位點至c.3090位點是限制性內切酶Psp1406 I的酶切位點(AACGTT)，而在其下游c.3091+14至c.3091+15位點是潛在的限制性核酸內切酶Nsp I的酶切位點(ACATGC)，當c.3091+1位點發生突變而不能被酶特異性識別時，下游的潛在酶切位點就可能被識別并被剪切，進而造成下游mRNA及蛋白質產物結構和功能的改變。同時由于該位點無法被內切酶識別，繼續轉錄可能會出現提前終止密碼子，導致該基因編碼的蛋白不完整甚至通過泛素化等細胞自我保護途徑降解。本例患者拒絕進一步提供血樣以供realtime-PCR明確該突變的具體剪切方式，因而無從得知最終的蛋白改變。蛋白質作為生物功能的執行者，該層面的改變有助于更好地理解該病的生物學行為。

遺傳性對稱性色素異常癥至今機制仍不明，通過基因測序手段獲得的大量突變數據有助于為后續的蛋白組學研究、基因型與表型關聯、發病機制及治療等進一步研究提供幫助。

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(收稿：2016-10-12 修回：2016-10-26)

Splice-site mutation in ADAR1 gene in a patient with dyschromatosis symmetrica hereditaria

TANGZhuangli,WANGXiaopeng,XIAOShengxiang.

TheSecondAffiliatedHospitalofXi'anJiaotongUniversity,DepartmentofDermatology,Xi'an710004,ChinaCorrespondingauthor:WANGXiaopeng,E-mail:wangdctor@163.com

Objective: To detect the mutations in ARAD1 gene in one sporadic patient with dyschromatosis symmetrica hereditaria. Methods: Genomic DNA was extracted from peripheral blood of patient and 100 healthy controls. All exons of ADAR1 gene were amplified by polymorphism chain reaction (PCR) and the products were purified and directly sequenced to detect mutations. Results: A novel splice-site mutation c.3091+1G>T was identified in the junction of exon 11 and intron 11, which was not detected in controls. Potential protein function changes of the altered DNA sequence was detected by Mutation Taster and the result showed the splice-site mutation was a pathogenic mutation which might lead to the loss of catalytic structural domain. Conclusion: One novel splice-site mutation was identified, which further expand the database of ARAD1 mutations.

dyschromatosis symmetrica hereditaria; splice site mutation; ADAR1 gene

國家自然科學基金(編號：30800991)

西安交通大學第二附屬醫院，陜西西安，710004

王曉鵬，E-mail: wangdctor@163.com