現(xiàn)時(shí)金銀花與山銀花比較鑒別分析

高珊　郭月秋　劉斯亮

[摘要]目的 對(duì)市售金銀花與山銀花真?zhèn)闻c種類鑒別的方法進(jìn)行研究同時(shí)考察商品質(zhì)量。方法 采用體視顯微、薄層色譜、液一質(zhì)聯(lián)用、標(biāo)識(shí)成分（綠原酸、木犀草苷、灰氈毛忍冬皂苷乙、川續(xù)斷皂苷乙）含量測(cè)定等方法對(duì)獲得的27批樣品進(jìn)行了比較檢定。結(jié)果 花表面腺毛非腺毛的有無及形態(tài)、花萼特征、是否檢出灰氈毛忍冬皂苷乙可作為鑒別金銀花與山銀花的依據(jù)；27批樣品中，16批為金銀花，其中1批摻有加重粉；11批為山銀花，其中7批灰氈毛忍冬、2批紅腺忍冬、1批華南忍冬、1批黃褐毛忍冬。結(jié)論 體視顯微特征和薄層色譜法可鑒別金銀花與山銀花，結(jié)合高效液相測(cè)定結(jié)果實(shí)現(xiàn)了對(duì)27批樣品的質(zhì)量考察與比較鑒別研究。

[關(guān)鍵詞]金銀花；山銀花；灰氈毛忍冬皂苷乙；體視顯微特征；薄層色譜

金銀花是我國傳統(tǒng)的花類中藥材，最早記載在明代的《救荒本草》中，具有清熱解毒、疏散風(fēng)熱的功效，作為藥食同源品種，在我國種植面積廣、品種多，需求量逐年增加，近年出現(xiàn)了金銀花與山銀花培育新品種，同時(shí)也有較多現(xiàn)代加工方法，如烘房烘干、殺青烘干、蒸制干燥、微波干燥等，其商品花蕾較飽滿，色澤較綠、表面毛茸少、質(zhì)地緊實(shí)飽滿、頂手等特征，摻偽主要為金銀花摻加重粉及用“山銀花”混充“金銀花”。為考察現(xiàn)時(shí)金銀花和山銀花商品質(zhì)量情況和真?zhèn)巍⒎N類鑒別，筆者收集了市場(chǎng)流通使用的“金銀花”及“山銀花”商品27批，采用體視顯微特征、薄層色譜法、液一質(zhì)聯(lián)用法與高效液相色譜法進(jìn)行了比較鑒別研究。

1.儀器與試藥

CAMAG Scanner-3薄層照相系統(tǒng)（瑞士卡瑪公司），OLYMPUS SZ61體視顯微鏡（日本Olympus公司），Waters e2695/2489高效液相色譜儀（美國Waters公司），Agilent 1100 series LC/MSD Trap SL（美國Agilent公司），Sartofius BP211D分析天平（德國Sartorius公司），超聲波清洗器（上海科導(dǎo)超聲儀器公司）。

綠原酸（批號(hào)110753-201314）、木犀草苷（批號(hào)110720-201402）購自中國食品藥品檢定研究院，川續(xù)斷皂苷乙（批號(hào)20120330）、灰氈毛忍冬皂苷乙（批號(hào)ZM0510BCl3）購自上海源葉生物科技有限公司，27批樣品均購于藥材市場(chǎng)、藥房，甲醇、乙腈為色譜純，其他化學(xué)試劑均為分析純，水為超純水，硅膠G薄層板（青島譜科分離材料有限公司）。

2.方法與結(jié)果

2.1金銀花與山銀花體視顯微特征鑒別

體視顯微鏡觀察27批樣品花蕾表面的非腺毛、腺毛、萼筒、萼齒形態(tài)，歸納體視顯微特征，其中1批樣品觀察到表面黏附不同程度的白色半透明顆粒狀物，為摻加重粉金銀花；其余見圖1、表1。

2.2薄層色譜鑒別

取供試品粉末1g，加甲醇25mL，超聲處理30min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状糽mL使溶解，作為供試品溶液。另取灰氈毛忍冬皂苷乙對(duì)照品，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。吸取上述兩種溶液各2uL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水（6：4：1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置日光及紫外光燈（365nm）下檢視，見圖2。

從圖2可以看出，金銀花未檢出灰氈毛忍冬皂苷乙，山銀花中灰氈毛忍冬、紅腺忍冬檢出灰氈毛忍冬皂苷乙，而黃褐毛忍冬和華南忍冬薄層色譜未檢出（與高效液相色譜分析結(jié)果一致）。

2.3HPLC-ELSD法含量測(cè)定

2.3.1色譜條件 色譜柱：DiamomilC18（4.6mm×250mm，5um），流動(dòng)相：乙腈（A）-0.4%醋酸溶液（B）梯度洗脫：0～10min，9%A；10～12min，9%A-29%A；12～20min，29%A-33%A；20～25min，33%A-45%A。柱溫：30℃，流速：1.0mL/min。

2.3.2對(duì)照品溶液的制備 精密稱取綠原酸、灰氈毛忍冬皂苷乙、川續(xù)斷皂苷乙、木犀草苷對(duì)照品加50%甲醇分別制成每1ml含綠原酸0.5mg、灰氈毛忍冬皂苷乙0.6mg、川續(xù)斷皂苷乙0.2mg、木犀草苷0.04mg的混合對(duì)照品溶液，色譜順序見圖3。

2.3.3供試品溶液的制備 按《中國藥典》2015年版山銀花（含量測(cè)定）項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備。

2.3.4樣品測(cè)定 分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液10uL，按色譜條件測(cè)定，見表2。從表中可以看出，金銀花與山銀花均含有綠原酸和木犀草苷成分，傳統(tǒng)與現(xiàn)代加工方法的金銀花綠原酸和木犀草苷含量無明顯差異；山銀花的綠原酸含量除1批華南忍冬未檢出、1批黃褐毛忍冬不符合規(guī)定外，其余2批紅腺忍冬、7批灰氈毛忍冬均高于金銀花；金銀花木犀草苷含量均符合藥典規(guī)定（0.050%），山銀花相對(duì)金銀花含量低，但標(biāo)準(zhǔn)未做規(guī)定，上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致。金銀花不含灰氈毛忍冬皂苷乙和川續(xù)斷皂苷乙；山銀花中商品來源占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的灰氈毛忍冬皂苷含量均符合藥典規(guī)定（5.0%），而市場(chǎng)較為少見的紅腺忍冬2批中有1批不符合規(guī)定、1批黃褐毛忍冬只檢出川續(xù)斷皂苷乙、1批華南忍冬未檢出。

2.4HPLC-MS聯(lián)用法鑒別

2.4.1色譜條件 色譜柱：Diamonsil C18（4.6mm×150mm，5um）；流動(dòng)相同2.3.1；流速：0.8mL/min；柱溫：35℃。

2.4.2質(zhì)譜條件 離子化方式：電噴霧離子化（ESI）；掃描方式：負(fù)離子掃描，采用全掃描一級(jí)質(zhì)譜、選擇離子二級(jí)質(zhì)譜（MS/MS）；質(zhì)荷比范圍：50～1500；干燥氣溫度350℃；干燥氣流速：8L/min，霧化器壓力：206.7kPa；分流比為1：1。

2.4.3樣品溶液的制備 分別吸取2.3項(xiàng)下的對(duì)照品、供試品溶液稀釋10倍。

2.4.4最低檢出限 取對(duì)照品溶液以不同比例稀釋后測(cè)定，信噪比為3時(shí)，最低檢出限分別為灰氈毛忍冬皂苷乙10ng，川續(xù)斷皂苷乙2ng。

2.4.5樣品測(cè)定 分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液1uL，按色譜條件測(cè)定，結(jié)果見圖4。

從圖4可以看出，灰氈毛忍冬皂苷乙分子離子[M-H]--m/z1397.7，川續(xù)斷皂苷乙分子離子[M-N]-m/z10736，忍冬、華南忍冬供試品色譜中均未檢出與灰氈毛忍冬皂苷乙和川續(xù)斷皂苷乙相同的分子離子峰，灰氈毛忍冬和紅腺忍冬供試品色譜中均檢出與灰氈毛忍冬皂苷乙和川續(xù)斷皂苷乙保留時(shí)間相同的分子離子峰，其一、二級(jí)質(zhì)譜均與對(duì)照品一致，黃褐毛忍冬檢出與川續(xù)斷皂苷乙保留時(shí)間相同的分子離子峰，其一、二級(jí)質(zhì)譜均與對(duì)照品一致。

3.討論

通過藥材市場(chǎng)調(diào)查，有以山銀花偽充金銀花及金銀花摻加重粉的現(xiàn)象。山銀花絕對(duì)主流商品為灰氈毛忍冬，其次為紅腺忍冬，而華南忍冬和黃褐毛忍冬市場(chǎng)上較難見到。通過觀察腺毛、非腺毛及花萼形態(tài)等體式顯微特征，可以鑒別金銀花與山銀花、摻加重粉金銀花及不同品種山銀花，是一種快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的檢定方法。根據(jù)灰氈毛忍冬皂苷乙成分薄層色譜的檢出與否，可以作為金銀花與山銀花的區(qū)別手段之一。但要注意的是未檢出灰氈毛忍冬皂苷乙，不要誤認(rèn)為都是金銀花（本文收集到的黃褐毛忍冬和華南忍冬樣品薄層色譜未檢出灰氈毛忍冬皂苷乙），還需結(jié)合性狀、體視顯微特征綜合判斷。含量測(cè)定結(jié)果提示：25批樣品的綠原酸含量結(jié)果均高于藥典規(guī)定值，由于綠原酸在金銀花與山銀花的花梗及葉片中廣泛存在，不是其特征性成分，日常監(jiān)督檢驗(yàn)中應(yīng)注意是否摻有非藥用部位及其所占比例的情況。由于黃褐毛忍冬和華南忍冬市場(chǎng)上很難搜集到樣品，每種只搜集到一批樣品，未能有更多樣品數(shù)據(jù)證實(shí)。需要說明的是華南忍冬樣品是在花末期采摘的鮮花的干燥品，未檢出灰氈毛忍冬皂苷乙是否與花期有關(guān)？有待進(jìn)一步探討。山銀花與金銀花功能主治相同、外觀性狀上較相似，由于山銀花價(jià)格便宜，有的企業(yè)將山銀花代替金銀花投料，建立的LC-MS聯(lián)用方法，通過比較供試品色譜中，是否檢出與灰氈毛忍冬皂苷乙和川續(xù)斷皂苷乙相同保留時(shí)間的色譜峰，其一級(jí)質(zhì)譜與二級(jí)質(zhì)譜是否與對(duì)照品一致，判斷市售含金銀花制劑中是否摻山銀花投料。

綜上所述，鑒別金銀花與山銀花以及不同種來源山銀花時(shí)，可根據(jù)具體情況選擇性狀鑒別的同時(shí)結(jié)合體視顯微特征、薄層色譜法及液一質(zhì)聯(lián)用法確證，可達(dá)到快速準(zhǔn)確的目的。