注射用替加環素無菌方法適用性實驗的研究

陳偉娜　王燕清　陳嘉璐

[摘要]目的建立注射用替加環素無菌的方法適用性。方法用100mL 0.1%的MgCh溶液沖洗后，再用700mL pH 7.0含0.1%吐溫-80的0.1%無菌蛋白胨溶液沖洗，以消除替加環素樣品的抑菌活性，進行注射用替加環素的細菌及真菌的無菌驗證。結果采用上述方法進行驗證，6種菌的供試品與陽性對照生長狀況一致。結論注射用替加環素的無菌檢驗，需要用100mL 0.1%的MgCl2溶液沖洗后，再用700mL pH7.0含0.1%吐溫-80的0.1%無菌蛋白胨溶液沖洗。

[關鍵詞]注射用替加環素；無菌檢查；方法適用性；MgCh；吐溫-80

替加環素由惠氏（Wyeth）公司研發，美國FDA于2005年6月和2006年7月批準惠氏的替加環素（Tigecycline，商品名Tygacil注射用替加環素）為治療復雜腹腔內感染和復雜皮膚感染的一線藥物，其化學結構式見圖1。該品種是甘氨酰四環素類抗生素中獲得批準的第一個產品。替加環素對G+菌、G-菌、厭氧菌有廣譜抗菌活性，包括多重耐藥性的G+菌，如MRSA、MRSE、抗青霉素的肺炎鏈球菌、VRE。對不同耐藥機制的耐四環素致病菌同樣有效，但對銅綠假單胞菌無抗菌活性。替加環素是新型甘胺酰環素類抗生素，主要與細菌核糖體30S亞基結合，阻礙氨基酸肽延長，從而抑制細菌蛋白質合成來發揮抗菌活性。他克服或限制了很多抗菌藥物產生的兩種主要耐藥機制：外排泵和核糖體保護。避免了四環素類抗生素耐藥機制對其產生作用。

為消除本品的抑菌活性，在無菌方法學驗證中，本研究采用了多種樣品處理辦法，包括添加高錳酸鉀溶液、硫酸銅溶液、檸檬酸鈉溶液、氯化鎂溶液、0.1%吐溫-80等，結果表明：以高錳酸鉀溶液、硫酸銅溶液、檸檬酸鈉溶液處理樣品，均不能有效消除本品的抑菌活性；注射用替加環素進口注冊標準中采用的氯化鎂溶液及0.1M的HCl溶液處理樣品能消除樣品抑菌活性，但驗證表明，該操作中用到0.1M鹽酸，對試驗菌有滅活作用；0.1%吐溫-80處理樣品，能有效消除本品的抑菌活性，而且對試驗菌無滅活作用。因而最終采用薄膜過濾法，用100mL 0.1%的MgCl.溶液沖洗后，再用700mLpH 7.0含0.1%吐溫-80的0.1%無菌蛋白胨溶液沖洗。

1.材料

1.1實驗器材

HTY-SPA型無菌隔離倉（杭州泰林生物技術設備有限公司），BKF330型全封閉集菌培養器（杭州泰林生物技術設備有限公司），LRH-250A型生化培養箱（廣東醫療器械廠）。

1.2樣品

注射用替加環素（規格為40mg/瓶），由麗珠醫藥集團研究所提供。

1.3培養基及沖洗液

培養基：硫乙醇酸鹽流體培養基、胰酪大豆胨培養基、胰酪大豆胨瓊脂培養基、沙氏葡萄糖培養基、沙氏葡萄糖瓊脂培養基，均購自廣東環凱微生物有限公司。培養基適用性符合《中國藥典》2015版，四部（通則1101）規定。

沖洗液：pH7.0含0.1%吐溫80的0.1%蛋白胨水溶液。

1.4試驗用菌種

金黃色葡萄球菌（staphvlococcus aureus）[CMCC（B）26003]；枯草芽孢桿菌（bacillus subtilis）[CMCC（B）63501]；銅綠假單胞菌（pseudomonas aeruginosa）[CMCC（B）10104]；生孢梭菌（clostridium sporogenes）[CMCC（B）64941]；白念珠菌（candida albicans）[CMCC（F）98001]；黑曲霉菌（aspergillus niger）[CMCC（F）98003]。菌種均來自中國食品藥品檢定研究院醫學菌種保藏中心。

2.方法與結果

參照2015版《中國藥典》方法及注射用替加環素進口注冊標準。

2.1菌液制備

參照《中國藥典》2015版四部通則1101無菌檢查法操作，取30～35℃培養24h的銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的胰酪大豆胨培養物和生孢梭菌的硫乙醇酸鹽流體培養物，用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋得到10～100CFU/mL的菌懸液，備用。取20～25℃培養48h的白色念珠菌的沙氏葡萄糖培養物，用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋得到10～100CFU/mL的菌懸液，備用。取20～25℃培養6d黑曲霉的新鮮培養物，加入0.05%聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液4mL洗下孢子，吸出轉移至空試管作為原液，用含有0.05%聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋，得到10～100CFU/mL的孢子懸液，備用。

2.2試驗步驟

因為替加環素對真菌沒有抑菌活性，所以在方法學摸索的過程中只選取細菌及厭氧菌進行驗證，而且，為了降低工作量，細菌先用枯草芽孢桿菌做代表，待方法確定后，再進行6種菌的驗證，具體步驟如下。

2.2.10.1%MgCI2溶液消除抑菌能力的考察參考注射用替加環素進口注冊標準，同時為了保證濾膜的沖洗體積不超過800mL，將0.1%MgCL2溶液的體積由750mL改為100mL，0.1M的HCL溶液的體積由750mL改為400mL，具體方法如下：取供試品10瓶/菌，以約50mL無菌氯化鈉溶液溶解并轉移至全封閉集菌培養器中，每菌用0.1%MgCL，溶液lOOmL沖洗后，用0.1M的HCL溶液400mL沖洗，最后用300mL的0.1%無菌蛋白胨溶液沖洗，沖洗后在濾膜上加lmL 10～100CFU/mL的菌懸液，過濾后取出濾膜，于胰酪大豆胨瓊脂培養基中30～35℃培養。同時，分別用0.1%高錳酸鉀溶液、0.1%硫酸銅溶液、0.1%檸檬酸鈉溶液代替0.1%MgCL2溶液，方法同上，考察其他中和劑抑菌作用，見表1。

結果可見，唯有0.1%MgCl溶液能夠消除注射用替加環素的抑菌作用。

為了考察處理用溶液對菌液的影響，我們用10～IOOCFU的菌液代替供試品溶液，方法同上，由表2結果可知，0.1M的HCl溶液對細菌的生長有抑制作用。

2.2.2沖洗液的確定 參考我們在做該產品原料微生物限度驗證時的經驗，并結合以上試驗結果，擬對試驗進行調整：取供試品10瓶/菌，以約50mL無菌氯化鈉溶液溶解并轉移至全封閉集菌培養器中，每菌分別用700mLpH 7.0含0.1%及0.3%的吐溫80的0.1%無菌蛋白胨溶液沖洗后，在濾膜上加1mL 10～100CFU/mL的菌懸液，過濾后取出濾膜，于胰酪大豆胨瓊脂培養基中30～35℃培養。同時為了考察處理用溶液對菌液的抑菌作用，用10～100CFU的菌液代替供試品，同法操作（注：最后過濾后不再加菌液），由表3可知，用700mL的0.1%及0.3%的吐溫80的0.1%無菌蛋白胨溶液替代400mL 0.1MHCL溶液和300mL 0.1%無菌蛋白胨溶液組合作為沖洗液，能夠符合無菌驗證的要求，而且，為了試驗方便，最終選擇0.1%的吐溫80的0.1%無菌蛋白胨溶液。

2.2.3方法適用性實驗的確定 用以上確定的方法，進行細菌、真菌的驗證。細菌驗證采用薄膜過濾法，取供試品10瓶/菌，以約50mL無菌氯化鈉溶液溶解并轉移至全封閉集菌培養器中，每菌用100mL 0.1%的MgCL2溶液沖洗后，再用700mL pH7.0含0.1%吐溫-80的0.1%無菌蛋白胨溶液沖洗，沖洗后注入100mL硫乙醇酸鹽流體培養基，并加入1mL試驗菌菌液，搖勻；另取一裝有同樣體積培養基的濾筒，加入等量的試驗菌，搖勻，作為對照菌液。置30～35℃生化培養箱中培養48h，結果見表4。霉菌、酵母菌驗證采用薄膜過濾法，按上述同法操作，沖洗后注入100mL沙氏葡萄糖培養基，并加入1mL試驗菌菌液，搖勻；另取一裝有同樣體積培養基的濾筒，加入等量的試驗菌，搖勻作為對照菌液。置23-28℃生化培養箱中培養72h。見表4。

2.3試驗結果

驗證結果表明：與陽性對照比較，含供試品各容器中的試驗菌均生長良好。以該法操作，能夠消除替加環素樣品的抑菌活性，方法可行。

即采用薄膜過濾法，取供試品10瓶/菌，以約50mL無菌氯化鈉溶液溶解并轉移至全封閉集菌培養器中，每菌用lOOmL 0.1%的MgCl.溶液沖洗后，再用700mL pH 7.0含0.1%吐溫-80的0.1%無菌蛋白胨溶液沖洗，沖洗后注入100mL硫乙醇酸鹽流體培養基或沙氏葡萄糖培養基，并加入lmL試驗菌菌液，分別培養。

3.討論

因替加環素對G+菌、G-菌、厭氧菌有廣譜抗菌活性，包括多重耐藥性的G+菌，如MRSA、MRSE、抗青霉素的肺炎鏈球菌、VRE，所以不能使用常規方法進行無菌的方法適用性實驗。注射用替加環素的進口注冊標準JX20100227已有無菌驗證方法，但其存在一定的問題：（1）沖洗液體積過多，其采用750mL 0.1%的MgCL.溶液沖洗后再用750mL的0.1M的HCL溶液，最后再用300mL的0.1%無菌蛋白胨溶液沖洗，總沖洗體積達到1800mL；（2）0.1M的HCL溶液對試驗菌有抑菌活性，陰性對照實驗中，菌液不生長。

在藥品無菌、微生物限度檢查等實驗中，對于抑菌性供試品可以使用適宜的中和劑消除抑菌成分，使用的中和劑不應與培養基發生反應，不應改變培養基原有性狀，不應對結果判斷產生影響。MgCl.溶液作為無菌驗證中的中和劑，在有抑菌作用的藥物應用廣泛。在稀釋液、沖洗液添加Mg2+作為中和劑，與培養基中的添加應用不同。稀釋液、沖洗液為一過性使用，即樣品制備、作用一定時間后，可以采用適宜的方法去除，從而消除其可能對實驗帶來的影響。實驗結果顯示，Mg2+作為小分子的無機化合物，極易通過濾膜，稍加沖洗，即可去除。

當藥品本身具有抗菌活性時，應當首先消除其抗菌活性，才能保證檢驗結果的真實性和有效性。對于一些抑菌活性較強的抗生素，要消除其抑菌活性，可在沖洗液中加入一定濃度的吐溫80。本研究參考了原料微生物限度驗證時的經驗，對吐溫80的濃度進行了摸索，確定了該產品驗證時的吐溫濃度為0.1%。

本方法結合了進口注冊標準中的MgCl2溶液的中和作用，同時增加了pH 7.0含0.1%吐溫-80的0.1%無菌蛋白胨溶液作為沖洗液，該方法驗證6種菌均符合規定，方法可行。