人卵泡壁層顆粒細胞源性非整合誘導多能干細胞的制備

蔡炳，脫穎，李宇彬，麥慶云，劉新顏，徐艷文，周燦權*

(1. 中山大學附屬第一醫院生殖醫學中心，廣州 510080；2. 廣東省生殖醫學重點實驗室，廣州 510080；3.中山大學附屬第一醫院病理科，廣州 510080)

人卵泡壁層顆粒細胞源性非整合誘導多能干細胞的制備

蔡炳1，2，脫穎3，李宇彬1，2，麥慶云1，2，劉新顏1，2，徐艷文1，2，周燦權1，2*

(1. 中山大學附屬第一醫院生殖醫學中心，廣州 510080；2. 廣東省生殖醫學重點實驗室，廣州 510080；3.中山大學附屬第一醫院病理科，廣州 510080)

目的 探索將卵泡液中壁層顆粒細胞誘導為非整合的誘導多能干細胞(iPS細胞)，并檢測其顆粒細胞方向的分化能力。 方法 在取卵的操作過程中，收集廢棄的壁層顆粒細胞，在顆粒細胞培養至第4天時，加入iPS仙臺病毒，經過20余天的維持，挑取iPS細胞克隆，并擴增培養。對其多能基因表達情況、外源基因整合情況、自然分化能力、顆粒細胞定向分化能力進行鑒定，并與皮膚細胞來源的iPSC系進行平行分化能力比較。 結果 成功建立了壁層顆粒細胞來源的iPS細胞系，其通過了類似胚胎干細胞的多能性檢測及體外三胚層的分化能力檢測，尤其在定向分化為顆粒細胞時，分化出了大量FOXL2、CYP19A1和FSHR陽性的細胞，經ELISA試劑盒檢測，發現該分化細胞可以分泌AMH并且能夠將雄激素轉化成雌激素；且顆粒細胞源iPS系較皮膚細胞源的iPS系在顆粒細胞方向的分化效率更高。 結論 提供了一種從人顆粒細胞建立iPSC的方法，并驗證了其顆粒細胞方向分化的優勢。該系統不僅可以用于建立生殖不孕疾病的iPSC庫，還為顆粒細胞功能障礙不孕的患者提供了一種細胞治療的新思路。

非整合誘導多能干細胞； 壁層顆粒細胞； 分化效率

(JReprodMed2017，26(4)：313-319)

誘導多能干細胞(induced pluripotent stem cells，iPS細胞)技術是一種經由過表達 Oct4/Sox2/Klf4/c-Myc等重編程因子，使成體細胞發生基因重編程而獲得類似于胚胎干細胞生物學特性的技術[1]。經過重編程得到的iPS細胞具有和胚胎干細胞相似的形態、生長特性、基因表達模式和多向分化能力。該技術避免了胚胎干細胞制備的倫理學問題，且可以實現目的細胞的分化和移植，不具有免疫排斥問題。

在iPS技術發展的領域繼采用Yamanaka的四基因病毒體系建立iPS細胞系之后，鑒于癌基因的介入和病毒介導的潛在危險，人們開始追求更為安全的制備方法，如腺病毒[2]、質粒[3]、蛋白小分子[4-5]、人工合成的mRNA[6]等方法，上述方法可以去除外源性基因對宿主基因組的影響并獲得iPS細胞系，但制備效率都很低。相較于這些非整合的制備方式，仙臺病毒法序列最終并不會殘留于基因組，安全性高，且重編程效率高，是一種非常穩定的非整合的iPS誘導方法[7]。

目前已經有不同類型的原代細胞如皮膚細胞、上皮細胞等成功制備了iPS細胞系，對于這些不同類型原代細胞來源的iPS細胞系分化能力的區別，目前認為重編程后的細胞依舊攜帶了之前原代細胞的部分印記基因特點，即在分化時會更傾向于原代細胞類型的方向進行分化[8]，這也提示我們去建立不同類型原代細胞來源的iPS細胞，為未來的細胞移植治療提供更穩定的種子細胞。

顆粒細胞在卵泡發生的過程中對卵泡的生長和發育起到重要作用。它提供了卵母細胞發育必需的營養成分并堆積了卵母細胞分泌的代謝產物，還負責了卵泡生長中雌激素的合成和排卵后孕激素的分泌[9]。在輔助生殖的胚胎培養室中，顆粒細胞會出現在超聲引導取卵手術得到的卵泡液中，但由于其并不被IVF周期所使用，故在日常操作中基本被丟棄。因此，本文擬利用人顆粒細胞結合非整合iPS的誘導技術，建立人卵泡壁層顆粒細胞源性非整合iPS細胞系(Granulosa cell iPSC，GC-iPSC)，并將其與皮膚成纖維細胞來源的iPS細胞(Skin fibroblast iPSC，SF-iPSC)進行顆粒細胞方向的分化，比較其分化效率，探討該細胞系的特殊性。

材料與方法

一、材料

1.涉及的組織細胞標本：顆粒細胞來自于本生殖中心廢棄卵泡液；非整合的仙臺病毒誘導的人皮膚成纖維細胞來源的SF-iPSC細胞系為本實驗室已建立細胞系；H1胚胎干細胞來自于ATCC細胞庫(美國)。

2.相關試劑：胚胎干細胞E8培養基(Invitrogen，美國)、顆粒細胞培養基(Invitrogen，美國)、仙臺病毒誘導非整合iPS細胞試劑盒(Invitrogen，美國)、免疫組化染色試劑盒(Invitrogen，美國)、BD胞漿蛋白流式檢測專用試劑盒(BD Biosciences，美國)、雌激素(Cayman Chemical，美國)及AMH(Beckman Coulter，美國)分析試劑盒。

二、方法

1.顆粒細胞的原代制備：利用本生殖中心的撿卵操作時機械切割獲取ICSI方案女性患者的壁層顆粒細胞，細胞團塊使用DPBS(Gibco，美國)不斷清洗，使用紅細胞裂解液(BD Biosciences，美國)去除紅細胞，后使用I型膠原酶處理10 min，1 500 rpm離心，種植于M199培養基中(含10% FBS)進行貼壁培養，隔2 d換液，在傳代前完成iPS誘導，故不進行傳代操作。

2.仙臺病毒誘導的非整合人壁層顆粒細胞源iPS細胞系的建立：重編程采用CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit (Life Technologies，美國)。六孔板一孔種植大約1 ×105的顆粒細胞，培養液為 M199(含10% FBS)；病毒感染日按照病毒說明書計算病毒用量，加入到培養基中感染12 h，后換回正常培養液培養；6 d后將感染后的細胞按1.5 ×105的密度種于經過照射的不增殖的小鼠胚胎皮膚細胞上(irMEF)，培養液換為胚胎干細胞的培養液[80% DMEM/F-12 (Life Technologies，美國)、20% KSR(Life Technologies，美國)、Glutamax (Life Technologies，美國)、0.1 mM β-巰基乙醇 (Sigma，美國)和1%非必需氨基酸(Life Technologies，美國)]。完全重編程克隆挑至無飼養層培養體系，換用E8和matirgel進行培養，全程37℃、5% CO2。重編程完成后檢測細胞中仙臺病毒序列的存在情況，并對所建立的細胞系進行iPS多能性的檢測，如Oct4、Nanog和Tra-1-60等多能性基因的表達、體內外三胚層的分化實驗等。

3.iPS細胞系向顆粒細胞的體外分化：iPS細胞使用機械傳代至低粘附性板，使用擬胚體(EB)培養液成胚體(80% DMEM/F12、20%KSR、4 ng/ml bFGF、0.1 mmol/L β-巰基乙醇和1%非必須氨基酸)培養2 d。隨后添加BMP4培養24 h，繼而添加BMP4、WNT3A、activin-A和bFGF (R&D Systems，美國)維持3 d，后轉入明膠包被的孔板貼壁培養，培養基中加入BMP4、bFGF和follistatin(R&D Systems，美國)再維持6 d，進行相關鑒定。

4.熒光定量PCR(RT-PCR)：使用RNA提取試劑盒(Qiagen，美國)提取相關細胞系的總RNA，使用逆轉錄試劑盒(Roche，美國)合成cDNA，并使用Sybr Green(Roche，美國)和特定引物配置體系在7500 Fast Real-Time PCR(Applied Biosystems，美國)機器上對基因表達水平進行檢測。GAPDH作為內參基因，使用△△CT法計算相對表達量。

5.包膜和胞漿內蛋白的流式細胞檢測：細胞培養物使用0.5%胰蛋白酶消化收集，并使用流式細胞固定液(R&D Systems，美國)固定，用流式細胞穿透和10%的人和驢血清封閉(包膜組無需穿透)。使用到的一抗如下：胞漿抗體 CYP19A1(Bioss，美國)、FOXL2(Bioss，美國)；包膜抗體FSHR(Bioss，美國)。陰性對照組使用相對應的Isotype對照組。流式樣品在 BD Influx 細胞分析儀(BD Biosciences，美國)上檢測，使用FlowJo軟件分析。

6.免疫組織化學：貼壁培養細胞用0.01 mol/L PBS洗2次，每次10 min；4%的多聚甲醛固定20 min，0.01 mol/L PBS洗3次，每次10 min；用0.2% Triton X100室溫穿透及1% BSA封閉 30 min，吸棄血清后，加入一抗4℃孵育過夜；胞膜分子標記檢測組則直接使用1% BSA 封閉30 min，吸棄血清后，加入一抗4℃孵育過夜；0.01 mol/L PBS洗3次，每次10 min；二抗(Alexa Fluor 488 或 Alexa Fluor 594)室溫孵育1 h；0.01 mol/L PBS洗3次，每次10 min；1 g/ml DAPI 復染細胞核；熒光顯微鏡下觀察拍照。

選用胚胎干細胞標志：Nanog、Oct4、SSEA4、Sox2、Tra-1-60和TRA1-81；三胚層分化標志：Tuj1、Fibronectin、AFP；選用顆粒細胞的標志：FOXL2、CYP19A1及FSHR。

7.相關激素測定：芳香化酶活性檢測是通過在培養基中加入睪酮，然后檢測其中雌激素的水平。種植4×105的未分化的iPS細胞及分化后的顆粒細胞樣細胞分別于六孔板不同孔內。在24 h內，這些細胞均進行50 ng/ml睪酮(Sigma-Aldrich，美國) 的處理。收集各孔的培養液，使用雌激素分析試劑盒(Cayman Chemical，美國)進行檢測。該試劑盒標準曲線的跨度為6.6～4 000 pg/ml，雌激素檢測吸光度為405 nm。

AMH的檢測為上述密度細胞收集其更換培養基后48 h的培養液，使用AMH-EIA (Beckman Coulter，美國)按照說明書步驟進行檢測。標準曲線范圍為1 pM～150 pM，吸光度為450 nm。

所有實驗平行重復三次。

三、統計學方法

應用SPSS 13.0軟件進行數據處理和統計分析。計量資料采用均數±標準差(±s)表示，組間比較采用方差分析檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、人卵泡壁層顆粒細胞源性非整合iPS細胞(GC-iPSC)的制備

使用仙臺病毒法過表達顆粒細胞OCT3/4、SOX2、KLF4和c-MYC的轉錄水平建立非整合的誘導多能干細胞系，在轉染后20 d挑取胚胎干細胞樣克隆，使用無飼養層培養(圖1)。并通過免疫組化、體內外分化等手段，證明其表達多能性標志(圖2)，且具有體內外三胚層多向分化的能力(圖3)。

二、GC-iPSC向顆粒細胞的體外定向分化

經過成擬胚體懸浮培養轉貼壁培養，并在相關誘導因子的處理下，誘導12 d的細胞出現顆粒細胞樣的外觀，通過流式檢測和免疫組化發現分化后的細胞大量表達顆粒細胞特異標志CYP19A1、FOXL2和FSHR(圖4)。

三、不同原代細胞來源iPS細胞系向顆粒細胞體外分化效率的比較

顆粒細胞源性iPS和皮膚成纖維細胞源性iPS平行進行顆粒細胞方向的定向分化，檢測定向分化12 d時的細胞。發現顆粒細胞源性組具有更高水平的相關顆粒細胞標志基因(FSHR、FOXL2、CYP19A1)的轉錄水平(P<0.01)，且具有更強的芳香化酶的活性，即將睪酮轉化為雌激素的能力(P<0.05)，具有更強的分泌AMH的能力(P<0.05)(圖5)。

A：撿卵操作中收集的顆粒細胞(培養前)；A1：顆粒細胞培養4 d后；B：轉染仙臺病毒4 d后；B1：B高倍像，誘導后細胞形態發生變化，增殖變快；C：誘導20 d出現胚胎干細胞樣克隆；C1：C高倍像；Bar=100 μm圖1 顆粒細胞原代培養及iPS誘導過程

A：克隆白光、堿性磷酸酶染色及多能基因SSEA4/OCT4/NANOG/SOX2/TRA-1-60/TRA-1-81的免疫熒光染色；Bar=200μm； B：RT-PCR檢測顆粒細胞源iPS(GC-iPSC)多能基因的表達情況 圖2 顆粒細胞源iPS的多能性鑒定

A～C：擬胚體的懸浮及貼壁白光；D～F：免疫組化鑒定三胚層分化標志,Tuj1(外胚層,D)、FN(中胚層,E)、 AFP(內胚層,F)；G～I：畸胎瘤的內部形成內(G)、中(H)、外(I)胚層組織形態；Bar=100 μmF：RT-PCR檢測顆粒細胞源iPS擬胚體(GC-iPS EB)分化基因的表達情況圖3 顆粒細胞源iPS分化能力的鑒定

A：擬胚體的形成及貼壁12 d后白光；B：免疫組化鑒定定向分化細胞顆粒細胞標志FSHR、FOXL2、CYP19A1；Bar=100μm； C：流式細胞儀鑒定定向分化細胞顆粒細胞標志FSHR、FOXL2、CYP19A1圖4 顆粒細胞源iPS向顆粒細胞定向分化的鑒定

A：Real-time PCR比較顆粒細胞源性iPS(GC-iPSC)和皮膚成纖維細胞源性iPS(SF-iPSC)在顆粒細胞(GC)標志基因FSHR、FOXL2、CYP19A1的表達差異；B：GC-iPSC和SF-iPSC將睪酮(50 ng/ml)轉化為雌激素的能力比較；C：GC-iPSC和SF-iPSC分泌AMH的能力比較。*P<0.05,**P<0.01圖5 顆粒細胞源性iPS和皮膚成纖維細胞源性iPS體外顆粒細胞定向分化能力比較

討 論

iPS細胞可以作為疾病的細胞模型，在體外模擬疾病的發病過程，從而能夠深入研究相關疾病的發病機制；另一方面，誘導分化的有缺陷的靶細胞可以為基因修復治療、藥物篩選、毒理評價提供細胞工具。目前已有很多人類遺傳病被報道建立了疾病iPS細胞系，并成功完成了體外的疾病模擬。Lee等[10]首次建立了家族性自主神經功能異常(FD)患者體細胞來源的iPS細胞系，發現在FD iPS往神經方向分化時具有大量異常蛋白，并具有神經元分化能力缺陷，而當細胞加以激動素處理后該缺陷得以修復，該實驗為使用激動素進行長期治療可能有益于FD患者的觀點提供了最好的證據。本生殖中心在植入前遺傳診斷(PGD)方面一直處于全國前列，集合了大量遺傳病標本資源，通過取遺傳病患者的顆粒細胞，可以因此而建立大量遺傳疾病的iPS 庫，并開展疾病的體外模擬，研究發病機制。

同時經大量研究發現顆粒細胞亞群中存在干性的細胞類型[11]。這個現象首次由 Kossowska-Tomaszczuk等[12]發現，該研究組證實了IVF實驗室獲取的顆粒細胞能夠分化成其他組織類型的細胞，如神經元、軟骨細胞、成骨細胞。Mao等[13]發現小鼠顆粒細胞不表達分化細胞標志Lamin A，內源性表達Sox2和c-Myc轉錄因子，并使用2因子法(O/S)建立了小鼠顆粒細胞來源的iPS細胞系，因此人顆粒細胞來源的iPS細胞應該有更高的誘導效率。但本文并沒有在誘導效率這一點進行深入探討。

顆粒細胞在卵泡發生的過程中對卵泡的生長和發育起到重要作用。目前認為女性生殖細胞的丟失和卵巢顆粒細胞的衰減是早衰的根本原因。已發現卵巢早衰患者的顆粒細胞的凋亡率較正常人要高，因此補充顆粒細胞是一種預期可以改善卵巢功能的方法。且目前已經有從大鼠、小鼠和人iPSC向卵巢顆粒細胞分化的較成熟方案[14-15]，且發現該類細胞當移植入小鼠體內會出現歸巢效應，將會圍繞在卵母細胞的周圍[16]。目前臨床主要以雌/孕激素替代療法來治療卵巢早衰，但目前這些治療方法尚不能從根本上修復受損的卵巢功能，且長期應用激素還可能會引起一些副作用，甚至可能還存在增加乳腺癌等惡性腫瘤、心臟病和中風的風險[17]。所以，怎樣提前預防和恢復衰退的卵巢功能，尋求新的治療方法，從而恢復患者的生育功能是生殖醫學領域面臨的一個挑戰。結合iPS印記基因的效應，顆粒細胞來源的iPS細胞系可能是最理想的一種種子細胞，可以高效地分化為更接近于本體的顆粒細胞，可能會對卵巢環境的修復產生正面影響。

綜上所述，建立人卵泡壁層顆粒細胞源性非整合iPS的技術將會推進生殖中心利用本中心的遺傳疾病顆粒細胞這個標本資源建立一系列的具有生殖細胞印記的iPS細胞，該類細胞可以高效分化為顆粒細胞樣細胞，可能對卵巢損傷后微環境的改善具有一定作用，而使用仙臺病毒非整合基因組的誘導特點也將為未來的細胞移植治療的安全性提供一定的保障。

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[編輯：羅宏志]

Derivation of integration-free iPSCs from human mural granulosa cells

CAIBing1，2，TUOYing3，LIYu-bin1，2，MAIQin-yun1，2，LIUXin-yan1，2，XUYan-wen1，2，ZHOUCan-quan1，2*

1.ReproductiveMedicineCenter，theFirstAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity，Guangzhou510080 2.GuangdongKeyLaboratoryofReproductiveMedicine，Guangzhou510080 3.DepartmentofHistopathology，theFirstAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity，Guangzhou510080

Objective：To induce human mural granulose cells to integration-free induced pluripotent stem cells(iPSC)，and test the differentiation potential of granulosa cell-like (GC-like) cells.Methods：Human mural granulosa cells were collected during oocyte retrieval process from women undergoing infertility treatment. iPS Sendai virus was added to the 4thday of granulosa cell cultured. After 20 days of maintenance，iPS cell clones were picked and cultured. The ability of pluripotent gene expression，the integration of foreign genes，and the ability of differentiation of GC-like cells were identified and compared with the iPSC derived from skin cells.Results：mGC-iPSCs were successfully generated，and passed the tests of similar pluripotency of embryonic stem cells and differentiation ability of three germ layers in vitro. The differentiated GC-like cells expressed the granulosa cell specific marker FOXL2，CYP19A1 and FSHR. These GC-like cells were also capable of producing AMH and aromatizing testosterone to estradiol，which suggested that they were biologically functional. mGC-iPSCs have higher differentiation` efficiency thanbroblast-iPSCs.Conclusions：The study provides a safety method for generating human iPSCs from human mural granulosa cells，and finds that mGC-derived iPSCs reveal higher differentiation efficiency thanbroblast-derived iPSCs. The system can not only be used to establish the iPSC library for reproductive infertility，but also to provide a new idea for cell therapy for the infertile patients with granule cell dysfunction.

Integration-free iPSCs； Mural granulosa cells； Differentiation efficiency

10.3969/j.issn.1004-3845.2017.04.004

2017-02-05；

2017-02-28

國家自然青年基金(31401269)；廣東省公益研究基金(2014A020211012)；廣州市生殖醫學轉化中心項目(201508020006)

蔡炳，男，浙江寧波人，博士，干細胞與組織工程專業.(*

，Email：zhoucanquan@hotmail.com)