髓源性抑制細胞在妊娠過程中的變化及作用

張濤，許健，刁梁輝，李玉葉，文志偉，黃志超，曾勇*

(1. 深圳中山泌尿外科醫院生殖中心，深圳 518043；2. 香港中文大學威爾斯親王醫院婦產科，香港 999077)

髓源性抑制細胞在妊娠過程中的變化及作用

張濤1，2，許健1，刁梁輝1，李玉葉1，文志偉2，黃志超2，曾勇1*

(1. 深圳中山泌尿外科醫院生殖中心，深圳 518043；2. 香港中文大學威爾斯親王醫院婦產科，香港 999077)

目的 探索髓源性抑制細胞(MDSC)在妊娠過程中的變化以及免疫抑制作用，為母胎免疫耐受調控提供理論基礎。 方法 選取2014年1～12月在我院行產檢的正常妊娠婦女共106例作為研究對象，孕早、中、晚期孕婦分別為24、29、32例，產婦21例。對照組為于我院行孕前檢查的正常婦女，無流產史及其他基礎疾病，共34例。分別采集孕早期、中期、晚期外周血以及產婦生產時外周血、臍帶血、胎盤以及蛻膜組織、產后24 h外周血進行檢測。孕早、中、晚期孕婦分別為24、29、32例，產婦為21例。對照組為于我院行孕前檢查的正常婦女，無流產史及其他基礎疾病，共34例。采用流式細胞儀技術檢測MDSC的比例，分析MDSC的變化。采用流式分選、純化后的MDSC，與CD3+T細胞共培養，通過分析[3H]胸(腺嘧啶脫氧核)苷密度分析T細胞增殖能力。 結果 妊娠婦女外周血MDSC的比例(6.25±3.59)%顯著高于未妊娠正常女性(1.70±0.77)%(P<0.01)，而孕中期外周血MDSC比例(10.43±7.22)%顯著高于孕早期(3.88±1.67)%、晚期(5.25±1.91)%(P<0.01)；分娩后，外周血MDSC比例(1.81±1.08)%下降至妊娠前水平。臍帶血、蛻膜以及胎盤組織中MDSC的比例也維持在較高水平，臍帶血MDSC比例(17.15±6.00)%顯著高于蛻膜(8.65±3.67)%及胎盤(7.66±3.73)%(P<0.01)。MDSC顯著抑制外周血CD3+T細胞增殖能力(P<0.01)。 結論 MDSC可能參與了母胎免疫耐受的調節，抑制母體免疫排斥反應，有利于妊娠繼續維持。

髓源性抑制細胞(MDSC)； 母胎免疫耐受； 妊娠； 周圍血； 臍帶血

(JReprodMed2017，26(4)：357-361)

生殖免疫學觀點認為，妊娠是一種成功的同種半異體移植現象，正常妊娠取決于母胎界面免疫系統間精確的動態平衡[1]。但如果母胎雙方免疫耐受被打破，則會引起母體對胎兒的排斥而發生流產[2-3]。然而母胎界面免疫耐受的確切機制目前仍不清楚。多項研究證實，髓源性抑制細胞(myloiderived suppressor cells，MDSC)在腫瘤免疫逃逸以及器官移植免疫耐受中發揮了重要的作用。MDSC是由處于不同分化階段的不成熟的巨噬細胞、樹突狀細胞和中性粒細胞組成的異質性的細胞群體[4]，研究發現，MDSC可以促進腫瘤細胞逃避機體免疫監控[5-6]，避免移植器官被宿主免疫細胞排斥[7-8]。然而，MDSC是否也參與了母胎免疫耐受的調節，目前尚未明確。本研究探討MDSC與妊娠的關系，為母胎免疫耐受提供更多理論基礎。

資料和方法

一、臨床資料

選取2014年1～12月在我院行產檢的正常妊娠婦女共106例作為研究對象，分別采集孕早期、中期、晚期周圍血以及產婦生產時外周血、臍帶血、胎盤以及蛻膜組織、產后24 h外周血進行檢測，孕早、中、晚期孕婦分別為24、29、32例，產婦是21例。對照組為于我院行孕前檢查的正常婦女，無流產史及其他基礎疾病，共34例。排除標準：孕期高血壓、糖尿病、產前子癇、胎兒宮內生長受限、膽汁淤積綜合征等產科并發癥；孕前無基礎疾病：如肝炎、高血壓、糖尿病、肥胖等。本研究入選的所有患者均簽署知情同意書，實驗流程已經獲得香港威爾士醫院倫理委員會許可。

二、主要儀器和試劑

儀器設備主要包括FACS Canto II型流式細胞儀和FACS Aria分選儀(BD，美國)、組織分解儀(Miltenyi Biotec，德國)、β粒子計數儀(Perkin Elmer，美國)。主要試劑包括直標單抗Lineage-FITC、CD3-FITC、CD11b-PE、CD33-PE/Cy5、HLA-DR-APC及紅細胞裂解液(BioLegend，美國)，CD3、CD28抗體、Ficoll分離液(BD，美國)，透明質酸酶、膠原蛋白酶1a、DNAse I、牛血清蛋白、[3H]胸(腺嘧啶脫氧核)苷(Sigma，美國)，RPMI 1640培養液、鏈霉素青霉素(Invitrogen，美國)，重組人IL-2細胞因子(R&D，美國)。

三、方法

1. 血液標本的采集及制備方法：采集入組人群肘正中靜脈血、產婦臍帶血1 ml，肝素抗凝，裂解紅細胞后，調整細胞濃度為1×107/ml。取100 μl加入Lineage-FITC、CD11b-PE、CD33-PE/Cy5、HLA-DR-APC各20 μl，4℃避光靜置30 min，加1 ml 5% BSA/PBS洗滌，離心5 min，棄上清，加0.5 ml 5% BSA/PBS重懸細胞混勻，上機分析。

2. 胎盤、蛻膜組織單細胞制備方法：經剖宮產術或陰道分娩出胎盤后，取中間部位組織，采用刮匙刮取1.5～3 g蛻膜組織。用PBS清洗2次后，用刀片將組織切成1 mm×1 mm×1 mm大小，在37℃消化液(200 U/ml透明質酸酶、1 mg/ml膠原蛋白酶1a、0.2 mg/ml DNAse I、1 mg/ml 牛血清蛋白)中消化40 min，每20 min用組織分解儀中速攪拌2次。脫落細胞用50 μm濾網過濾，用PBS洗滌1次后加紅細胞裂解液裂解紅細胞，PBS洗滌兩次后將細胞濃度調整為1×107/ml，加入抗體孵育。

3. T細胞增殖實驗：采集正常婦女周圍血10 ml，加入Ficoll分離液梯度離心，獲取單核細胞，利用流式分選儀分選CD3+T細胞。臍帶血經過同樣處理，分選Linlow/negHLA-DRlow/negCD33+CD11b+MDSC細胞。將純化CD3+T細胞加入96孔板(每孔含2×105細胞)，每孔加入20 μl CD3、CD28抗體和IL-2(100 U/ml)刺激T細胞增殖。按照1 000∶1，100∶1，10∶1，1∶1的比例加入純化的MDSC，在37℃，5%CO2，95%空氣濕度培養箱培養72 h后加入[3H]胸(腺嘧啶脫氧核)苷5 μl，12 h后收集細胞，利用β粒子計數儀測量[3H]胸(腺嘧啶脫氧核)苷含量。

四、統計學分析

使用SPSS 16.0進行統計學分析，應用One-wayANOVA檢驗評估各時期MDSC表達水平的變化，P<0.05為差異具有統計學意義。

結 果

一、一般資料分析

正常對照組婦女平均年齡(33.8±4.7)歲，孕早期孕婦平均年齡為(35.2±5.4)歲，孕中期孕婦平均年齡為(34.5±4.9)歲，孕晚期孕婦平均年齡為(36.1±3.9)歲，各組間年齡無統計學差異(P>0.01)。所有入組人群無合并高血壓、糖尿病、甲亢、甲減等疾病。

二、不同孕期及分娩、分娩后周圍血MDSC比例的變化

妊娠期周圍血MDSC表達水平(6.52±3.59)%顯著高于非妊娠婦女(1.70±0.77)%(P<0.01)，妊娠中期MDSC表達量高達(10.43±7.22)%，顯著高于妊娠早(3.88±1.67)%及晚期婦女(5.25±1.91)%(P<0.01)。而產后周圍血MDSC開始下降，產后24 h 基本達妊娠前水平(圖1、2)。

三、臍帶血、蛻膜、胎盤MDSC的表達水平

臍帶血、脫膜以及胎盤組織中MDSC的比例也維持在較高水平，分別為(17.15±6.00)%、(8.65±3.67)%、(7.66±3.73)%。臍帶血MDSC比例顯著高于蛻膜及胎盤(P<0.01)，而蛻膜及胎盤組織之間MDSC比例差異無統計學意義(P>0.05)(圖3)。

四、孕期周圍血MDSC抑制CD3+T細胞增生分離孕中期周圍血MDSC及CD3+T細胞，檢測MDSC對T細胞的抑制作用，結果顯示孕期MDSC可以顯著抑制CD3+T細胞增殖(P<0.01)，不同濃度CD3+T細胞與MDSC(1 000：1，100：1，10：1，1：1)共培養后，[3H]胸(腺嘧啶脫氧核)苷含量分別為(125 288.83±14 014.58)，(79 335.72±8 809.11)，(65 622.67±8 917.23)，(34 963.07±6 650.96)(圖4)。

圖1 妊娠中期周圍血MDSC比例變化

注：與對照組比較，*P<0.01；與妊娠早期比較，#P<0.01圖2 妊娠期外周血MDSC的變化

注：與臍帶血比較，*P<0.01圖3 胎兒臍帶血、蛻膜、胎盤組織MDSC表達水平

注：與單純T細胞增殖相比較，*P<0.01圖4 MDSC顯著抑制CD3+T細胞增生

討 論

MDSC是一群表型異質細胞群，來源于骨髓祖細胞和未成熟髓細胞，是樹突狀細胞、巨噬細胞和粒細胞的前體，根據細胞表面標記物以及形態的不同，可分為粒細胞型MDSC(G-MDSC)和單核細胞型MDSC(M-MDSC)[9]。MDSC主要通過高表達精氨酸酶1、誘導性一氧化氮合酶(iNOS)和活性氧(ROS)，抑制抗原特異性以及非特異性T細胞增殖及功能，這也被視為鑒定MDSC生物活性的重要特征之一[9]。另外，MDSC對其他免疫細胞也發揮調節作用。已有研究顯示，MDSC有利于促進巨噬細胞向M2型巨噬細胞分化[10]，分泌更多的IL-10和TGF-β，使免疫應答向有利于腫瘤的方向發展。MDSC還可以通過下調NK細胞表面激活性受體(NKG2D)來抑制NK細胞對腫瘤細胞的殺傷性[11]。此外，一些學者發現在腫瘤微環境中MDSC通過分泌IL-10、INF-γ和Arginase促進調節性T(Treg)細胞分化[12]，Treg細胞進一步抑制抗腫瘤免疫反應。妊娠過程中，母體免疫學特征改變與腫瘤患者具有相似性，表現為T細胞增殖、殺傷功能減退[2]，Th細胞因子處于抑制狀態[3]，NK毒性降低[3]，M2型巨噬細胞[13]、Treg細胞增加[14]。這些改變共同參與母胎免疫耐受的調節，維持妊娠進行，母胎免疫耐受一旦失衡，則會導致流產、產前子癇、早產、胎兒宮內生長受限[15]。然而，引起這些免疫抑制的原因尚不清楚，MDSC是否在妊娠過程中發揮了介導腫瘤細胞免疫逃逸的類似作用至今未明。

本實驗觀察了妊娠不同時期周圍血MDSC比例的變化，結果表明妊娠期婦女中、晚期MDSC比例顯著高于正常未孕婦女，而妊娠中期MDSC比例最高，分娩后MDSC降至孕前水平，這一研究與K?stlin等[16]的研究結果相一致，這些發現均提示孕中期MDSC升高可能對妊娠的維持發揮了至關重要的作用。至今，導致妊娠婦女MDSC升高的原因并不清楚，妊娠期的生理改變，如血液系統的改變，以及血管生成因子，促、抑炎因子、人類淋巴細胞抗原的改變都可能是誘導MDSC聚集的原因，但這一推測仍需要更多的研究加以證實。

蛻膜、胎盤組織中MDSC的含量也很高，分別占組織免疫細胞的(8.65±3.67)%，(7.66±3.73)%，這說明MDSC在母胎界面可能發揮了保護作用，使胎兒避免受到母體免疫細胞的攻擊。臍帶血中MDSC的比率顯著高于蛻膜、胎盤組織，已有研究顯示臍帶血以及新生兒血中MDSC含量顯著高于成人，并可抑制T細胞增殖和炎癥因子產生以及降低NK細胞毒性[17]，以上研究發現均表明MDSC參與調控母胎免疫耐受。

本研究發現純化MDSC可以抑制周圍血抗原非特異性CD3+T細胞的增殖，這說明妊娠過程中MDSC的大量聚集對妊娠期全身免疫抑制發揮了重要作用，而母胎界面MDSC對局部免疫耐受發揮調控作用。Nair等[18]的研究發現復發性流產患者周圍血MDSC的含量顯著低于正常對照組人群，而復發性流產的免疫學特征表現為T細胞增殖、殺傷功能增加，促炎因子升高，NK毒性增高等。Kang等[19]的研究也發現MDSC可以通過上調Treg細胞Foxp3表達量促進母胎免疫耐受。這些研究進一步證實了MDSC參與母胎免疫耐受的調節。

國內至今尚無關于妊娠期MDSC變化的報道，本實驗揭示了MDSC在妊娠過程中的變化趨勢，結合功能學研究證實了MDSC可能參與母胎免疫耐受的調節。妊娠期MDSC與其他免疫細胞、細胞因子的交互作用以及與流產、早產等的關系仍需要更多研究進行探索，為母胎免疫學的發展提供更多的理論知識。

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[編輯：侯麗]

The change and role of myeloid derived suppressor cells during pregnancy

ZHANGTao1，2，XUJian1，DIAOLiang-hui1，LIYu-ye1，WENZhi-wei2，HUANGZhi-chao2，ZENGYong1*

1.AssistedReproductiveTechnologyCenter，ShenzhenZhongshanUrologyHospital，Shenzhen518043； 2.DepartmentofObstetricsandGynecology，theChineseUniversityofHongKong，HongKong999077

Objective：To investigate the changes of myeloid derived suppressor cells (MDSC) and its immune-suppressive function during pregnancy for providing more evidence for the maternal-fetal immune tolerance.Methods：A total of 106 women with normal pregnancy who were admitted to our hospital from January to December in 2014 were selected as subjects. The number of the pregnant women in the early，middle and late stage were 24，29，32 respectively，and 21 women were after delivery. Thirty four normal women without abortion history and other basic diseases were as control group. The peripheral blood from the normal pregnancy women at the first，second and third trimester，and cord blood，deciduas and placenta，as well as peripheral blood after 24 hours postpartum were collected for the analysis of MDSC percentage by flow cytometry. The effect of isolated pure MDSC on T cell proliferation was analyzed by the density of [3H] thymidine.Results：The percentage of peripheral MDSC in pregnancy women(6.25±3.59%)was significantly increased compared with non-pregnant healthy women(1.7±0.77%)(P<0.01)；while the percentage of MDSC in the second trimester(10.43±7.22%)was significantly higher than that in the first(3.88±1.67%)and third trimester(5.25±1.91%)(P<0.01). MDSC was rapidly decreased after delivery(1.81±1.08%)to non-pregnancy level. Besides，MDSC percentage in cord blood，deciduas and placenta were also higher. The percentage of MDSC in cord blood (17.15±6.00%)was significantly higher than that in deciduas(8.65±3.67%)and placenta(7.66±3.73%)(P<0.01). The proliferation of T cells was significantly inhibited by MDSC (P<0.01).Conclusions：MDSC may play a critical role in maternal-fetal immune tolerance，suppress immune response and contribute to the maintenance of pregnancy.

Myeloid derived suppressor cells (MDSC)； Maternal-fetal immune tolerance； Pregnancy； Peripheral blood； Cord blood

10.3969/j.issn.1004-3845.2017.04.013

2016-11-10；

2016-12-18

【基因項目】 深圳市科技計劃基礎研究項目(JCYJ20160427113429186)；國家自然科學青年基金(8160060585)

張濤，女，山西長治人，博士，婦產科學專業. (*

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