PRM1基因C321A、G197T單核苷酸多態性對體外受精結局的影響

李偉偉，閆婭妮，史鴻志，董麗霞，殷秀榮

(秦皇島市婦幼保健院生殖醫學科，秦皇島 066004)

PRM1基因C321A、G197T單核苷酸多態性對體外受精結局的影響

李偉偉，閆婭妮，史鴻志，董麗霞，殷秀榮*

(秦皇島市婦幼保健院生殖醫學科，秦皇島 066004)

目的 探討魚精蛋白1的C321A、G197T基因多態性與體外受精結局的關系。 方法 選取我院生殖中心進行常規IVF的182例(182個周期)，根據受精率分為3組：A組受精率<30%，43個周期；B組受精率在30%～65%之間，24個周期；C組受精率>65%，115個周期。提取授精后剩余精子的基因組DNA，采用聚合酶鏈限制性片段長度多態性(PCR-RFLP)方法檢測PRM1基因C321A和G197T 基因型頻率和分布，比較3組間基因型的分布差異及所有研究對象不同基因型間受精率的差異。 結果 3組間比較，PRM1基因C321A多態性位點的各基因型頻率無顯著性差異(P>0.05)，C321A多態性位點與IVF受精率無相關性(P>0.05)。在A組中，PRM1基因 G197T多態性位點GG、GT、TT基因型分布頻率分別為9.3%(4)、25.6%(11)、65.1%(28)；B組分別為8.3%(2)、25.0%(6)、66.7%(16)；C組分別為38.3%(44)、26.1%(30)、35.6%(41)。A組和B組的TT基因型頻率顯著高于C組(65.1% vs. 35.6%，66.7% vs. 35.6%)，差異均有統計學意義(P<0.05)，TT基因型增加了IVF受精失敗的風險。 結論 PRM1基因 C321A多態性與IVF受精率不相關；PRM1基因 G197T多態性改變與IVF受精率相關。

魚精蛋白1； 單核苷酸多態性； 體外受精

(JReprodMed2017，26(4)：362-365)

全世界大約15%的夫婦受到不孕不育的困擾，盡管輔助生殖技術能夠解決一部分男性患者的不育情況，但是仍有部分男性不育的問題未得到解決。近來有研究表明魚精蛋白(PRM)與男性不育顯著相關[1-2]。PRM在精子核中是主要的DNA結合蛋白，分為PRM1和PRM2，其在精子生成及受精等方面的功能越來越受到學者的重視。越來越多的學者從遺傳角度上對男性不育的原因進行分析，主要的遺傳異常包括：染色體畸變、染色體微缺失、單基因突變和遺傳多態性等[3]。單核苷酸多態性(SNP)是目前分布最廣泛且存在數量最多的一種遺傳多態性。PRM1基因SNP的研究熱點主要是rs35576928、rs737008和rs2301365這3個位點[4]。目前國內針對PRM1基因多態性與體外受精結局的研究尚不多，本文通過研究PRM1基因的C321A和G197T多態性與體外受精(IVF)結局的相關性，在基因多態性的水平上探討受精失敗的原因。

資料與方法

一、研究對象與分組

選取我院生殖中心2015年5月至2016年10月進行常規IVF的182例(182個周期)，納入標準：女方單純輸卵管性不孕，年齡24～37歲，男方年齡25～40歲，雙方染色體均正常，首次IVF。納入標準：近3個月內未使用過激素類藥物，既往無自然流產史，患者身體健康，無遺傳性疾病家族史，近期無泌尿生殖系統感染，基礎內分泌水平正常。該研究經本院倫理委員會批準，所有研究對象均簽署知情同意書。

根據受精率將182個IVF周期分3組，A組43周期，受精率<30%；B組24周期，30%≤受精率≤65%；C組115 周期，受精率>65%。

二、研究方法

1.精子制備和DNA提取：取卵日，采用密度梯度結合上游法處理精液，將授精剩余的精子進行DNA的提取。采用常規苯酚-氯仿法進行基因組DNA 提取，并對DNA含量進行分析、測定，-80 ℃保存，備用。

2.引物設計與合成：登陸Gen Bank 查詢PRM1基因全序列M60331，引物設計采用primer 5.0軟件完成，根據PRM1基因序列，C321A上游引物5’-cccctggcatctataacaggccgc-3，下游引物5’-tcaagaacaaggagagaagagtgg-3’，擴增片段為557 bp。G197T上游引物：5’-ttctcacagcccacagagtt-3’，下游引物：5’-ggcaacatttattgacaggcgg-3’，擴增片段為398 bp，引物合成由大連寶生物公司完成。

3.PCR產物擴增：應用 DNA作為模板，建立25 μl聚合酶鏈反應(PCR)體系，模板DNA 1 μl，d NTPs 1 μl，10× PCR Buffer 2.5 μl，PRM1基因5’引物0.5 μl，PRM1基因3’引物 0.5 μl，Taq酶0.5 μl，加去離子水至終體積25 μl。PCR反應條件，94℃預變性2 min，94℃變性50 s，60℃退火50 s，72℃延伸50 s，共35個循環，最后72℃延伸10 min，降至4℃保溫。PCR產物均用1%瓊脂糖凝膠電泳觀察結果。

4.聚合酶鏈限制性片段長度多態性(PCR-RFLP)分析及電泳檢測：BstuI和BseR I分別酶切557 bp和398 bp PCR產物，BstuI酶切反應體系為15 μl，其中擴增產物為10 μl，限制性內切酶為5 U，37℃恒溫過夜；Bse R I酶切體系為12 μl，其中擴增產物為6 μl，限制性內切酶1 μl，37℃恒溫過夜。酶切產物分別用1.5%和2%瓊脂糖凝膠電泳觀察結果。

三、統計學分析

采用 SPSS 13.0統計軟件進行數據分析，χ2檢驗用來檢測 SNP 位點在檢測人群中的分布是否符合哈迪-溫伯格定律并檢測基因型在各組中的分布頻率，單因素方差分析用于比較不同基因型對受精率的影響，P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、PCR-RLPF檢測結果

PRM1基因C321A多態性PCR產物長度為557 bp，經BstuI酶切后，1.5%瓊脂糖凝膠電泳，基因型結果顯示見圖1。PRM1基因G197T多態性PCR產物長度為398 bp，2%瓊脂糖凝膠電泳，基因型結果顯示見圖2。

1：1 000 bp marker；2：PRM1 DNA；3：CC基因型；4：CA基因型；5：AA 基因型圖1 BstuI酶切557 bp PCR產物結果1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果

1：2 000 bp marker；2：GG基因型；3：GT基因型；4：TT 基因型；5：PRM1 DNA圖2 BseRI酶切 398 bp PCR產物結果2%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果

二、PRM1基因C321A多態性位點的基因型分析

所有研究對象均符合哈迪-溫伯格平衡定律。A組中CC、CA、AA基因型樣本例數分別為13、11、19例，B組中CC、CA、AA基因型樣本例數分別為7、6、11例；C組中CC、CA、AA基因型樣本例數分別為31、33、51例；3組間比較，基因型CA、AA及CA+AA分布無顯著性差異(P>0.05)(表1)。

三、PRM1基因G197T多態性位點的基因型分析

在A組中GG、GT和TT基因型樣本例數分別為4、11、28例；在B組中GG、GT和TT基因型樣本例數分別為2、6、16例；在C組中GG、GT和TT基因型樣本例數分別為 44、30、41；A組和B組TT基因型及GT+TT基因型分布頻率顯著高于C組，差異有統計學意義(P<0.05)。GT基因型在3組間的分布無統計學差異(P>0.05)(表2)。

表1 PRM1基因C321A位點的基因型在3組間的分布頻率

表2 PRM1基因G197T位點的基因型在3組間的分布頻率

注：與C組比較，▲P<0.05

四、PRM1基因C321A、G197T多態性位點對受精率的影響

C321A多態性位點不同基因型間受精率無顯著性差異(P>0.05)；G197T多態性位點不同基因型間受精率有顯著性差異(P<0.05)，TT基因型受精率低于GT和GG基因型，差異有統計學意義(P<0.05)(表3)。

表3 PRM1基因 C321A、G197T多態性位點不同基因型對IVF受精率的影響(x-±s)

注：與GT和GG基因型比較，★P<0.05

討 論

目前，人們對SNPs的研究越來越廣泛，涉及到各種多基因疾病和一些復雜性疾病。近年來，更多學者專注于男性不育與相關基因SNPs關聯性的研究[5-6]，研究結果發現一些基因的SNP與男性不育存在一定的相關性，它們可能參與細胞增殖和抗氧化過程，與精子發生過程相關。但這些研究主要見于國外，國內相關報道尚少。IVF-ET是治療不孕的最有效方法，即使ICSI技術日趨成熟，仍有部分精液分析正常的男性無法在IVF中使卵母細胞受精，甚至ICSI也可能出現卵母細胞不受精的現象，所以研究精卵受精失敗具有重要意義。

PRM是人精子細胞核中含量最豐富的核蛋白，在精子發生和DNA凝聚過程中，睪丸生精細胞內核蛋白組型由組蛋白轉化為PRM。PRM根據其氨基酸的組成和序列分為兩類，PRM1和 PRM2。PRM促使精子中的核基質與核蛋白之間的結合更緊密，從而使核內染色質高度富集濃縮，防止精子基因組因內部或外部因素而誘發突變[7-8]。國外學者Iguchi等[9]發現并報道PRM1上第一個SNP位點是c.197G>T。該位點破壞PRM1與DNA結合所必須的高度保守的富含精氨酸區域，從而影響精子的發生障礙，進一步影響受精。關于PRM基因多態性與受精率和胚胎發育的研究國內報道較少，魚精蛋白影響受精率和胚胎發育的機制有待進一步研究。本文針對PRM1基因C321A和G197T多態性位點與IVF受精結局之間的相關性展開研究，從基因多態性的水平上研究PRM1基因多態性與受精率的相關性。結果表明PRM1基因C321A多態性位點與IVF受精率之間不相關；PRM1基因G197T多態性位點TT基因型顯著增加了受精失敗的風險，與IVF的受精率相關。

余慶峰等[10]報道PRM1基因SNP位點-190C->A多態性可能與中國漢族畸形精子癥男性不育存在相關，該位點可能導致精子形態異常。近期，一項小樣本GWAS(genome-wide analysis study)研究[11]報道了PRM1基因和PRM2基因3個標簽SNPs(rs2301365、rs35576928和rs3177008)與非梗阻性無精子癥和嚴重少弱精子癥有關。李俊等[12]研究結果表明，PRM1基因SNP位點C321A與男性不育具有相關性，而Tanaka等[13]和Siasi等[11]均報道PRM1基因C321位點多態性與男性不育不存在相關性，國內外報道存在爭議。本研究選取C321 snp位點進行研究，探討此位點多態性與IVF受精率的相關性，結果表明C321多態性位點與IVF受精結局之間不存在相關性，與Tanaka和Siasi的研究相一致。lguchi 等[9]曾首次提出PRM1基因G197T多態性位點與男性不育可能相關，本研究結果表明G197T位點多態性是受精失敗的風險，更進一步證實其與男性不育的相關性。

本研究選取首次IVF的182個周期的患者作為研究對象，結果表明PRM1基因G197T snp位點 TT基因型是IVF受精失敗的風險因素，但是由于研究病例有限，仍需要擴大樣本量進一步驗證。盡管目前已知此位點是風險因素，但是其具體機制尚不清楚，進一步研究其導致受精失敗的機制變得十分重要，為臨床提供更多的治療方案，改善或者避免受精失敗的發生。

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[編輯：侯麗]

Association between C321A & G197T polymorphism of PRM1 gene and IVF fertilization rate

LIWei-wei，YANYa-ni，SHIHong-zhi，DONGLi-xia，YINXiu-rong*

Departmentofreproductivemedicine，MaternityandchildcarecenterofQinhuangdao，Qinhuangdao066004

Objective：To explore the association between single nucleotide polymorphism (SNP) loci C321A & G197T in protamine 1 (PRM1) gene and IVF fertilization rate.Methods：A total of 182 IVF-ET cycles in our reproductive center were collected. The cycles were divided into three groups by the fertilization rate：the cycles with fertilization rate<30% in group A (n=43)，30% to 65% in group B (n=24) cycles，and>65% in group C (n=115). The genomic DNA of residual sperm after insemination was extracted，and the frequency of C321A and G197T in PRM1 was detected by PCR-RFLP analysis. The differences in genotype and IVF fertilization rate were compared among the three groups.Results：There was no any significant difference in the genotype frequency of C321 polymorphism in PRM1 gene among the three groups(P>0.05). C321A polymorphism in PRM1 gene was not associated with IVF fertilization rate(P>0.05). The frequency of genotype GG，GT and TT of G197T in PRM1 gene was 9.3%(4)，25.6%(11)，and 65.1%(28)in group A；the frequency of genotype GG，GT and TT was 8.3%(2)，25.0%(6)，and 66.7%(16)in group B；and the frequency of genotype GG，GT and TT was 38.3%(44)，26.1%(30)，and 35.6%(41)in group C respectively. The frequency of genotype TT of G197T in group A and group B was significantly higher than that of group C(65.1% vs. 35.6%，66.7% vs. 35.6%)(P<0.05). Genotype TT of PRM1 G197T increased the risk of fertilization failure.Conclusions：The SNP of C321A in PRM1 is not associated with IVF fertilization rate. The SNP of G197T in PRM1 is associated with IVF fertilization rate.

Protamine 1； Single nucleotide polymorphism； IVF

10.3969/j.issn.1004-3845.2017.04.014

2016-11-06；

2016-12-03

李偉偉，女，河北秦皇島人，碩士研究生，主管檢驗師，生殖醫學專業.(*

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