HSP90—eNOS在糖尿病大鼠胸主動(dòng)脈的表達(dá)及普羅布考干預(yù)實(shí)驗(yàn)

黃德斌+翟鑫+李曉行

摘要：目的 建立糖尿病大血管病變模型，觀察HSP90和eNOS在糖尿病大鼠胸主動(dòng)脈中的表達(dá)，以及普羅布考干預(yù)治療后的影響。方法 50只雄性SD大鼠分為正常對(duì)照組（N組）和模型組，模型組以高糖高脂喂養(yǎng)聯(lián)合腹腔注射STZ成模。以隨機(jī)血糖≥16.7 mmol/L并維持2 w者定為造模成功。成模大鼠隨機(jī)分為糖尿病組（DM組）和普羅布考干預(yù)組（PB組），PB組每日以普羅布考灌胃，N組和DM組以等體積檸檬酸鈉緩沖液灌胃。8 w后處死大鼠并分離胸主動(dòng)脈，光鏡下觀察胸主動(dòng)脈病變，免疫組織化學(xué)檢測(cè)血管組織HSP90、eNOS的表達(dá)。結(jié)果 ①DM組大鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞廣泛脫落，平滑肌排列紊亂。PB組大鼠胸主動(dòng)脈可見(jiàn)內(nèi)皮細(xì)胞灶狀脫落，平滑肌排列稍紊亂。N組大鼠內(nèi)皮細(xì)胞光滑平整，平滑肌排列整齊。②DM組大鼠較N組大鼠相比，胸主動(dòng)脈表達(dá)HSP90明顯升高（P<0.05）。PB組與DM組比較，胸主動(dòng)脈HSP90表達(dá)無(wú)明顯差異（P>0.05）。三組間胸主動(dòng)脈表達(dá)eNOS無(wú)明顯差異（P>0.05）。結(jié)論 ①高糖高脂喂養(yǎng)聯(lián)合腹腔注射STZ的糖尿病大鼠，胸主動(dòng)脈呈早期動(dòng)脈粥樣硬化改變；②HSP90在糖尿病大鼠胸主動(dòng)脈表達(dá)明顯升高，普羅布考干預(yù)治療后對(duì)其表達(dá)無(wú)明顯影響。

關(guān)鍵詞：HSP90；ENOS；糖尿病鼠；糖尿病大血管?。黄樟_布考

Expression of HSP90-eNOS in Thoracic Aorta of Diabetic Rats and Probucol Intervention

HUANG De-bin，ZHAI Xin，LI Xiao-xing

（Department of Endocrinology and Metabolism，Third Hospital of Changsha City，Changsha 410015，Hunan，China）

Abstract：Objective To establish diabetic model，observe the expression of HSP90 and eNOS in thoracic aorta in diabetic rats，and the effects of probucol treatment.Methods 50 male SD rats were divided into normal control group（N group）and model group，model group with high fat and high sugar feeding combined with intraperitoneal injection of STZ model.With random blood glucose≥16.7 mmol/L and maintained for 2 w as animal model.The rats were randomly divided into diabetic group（DM group）and probucol group（PB group），PB group daily with probucol gavage，N group and DM group with equal volume of citric acid sodium buffer intragastric.8 w rats were killed after separation and thoracic aorta，thoracic aortic lesions observed under light microscope，detection of vascular tissue by immunohistochemistry.The rats were sacrificed 8 w after separation and thoracic aorta，thoracic aortic lesions observed under light microscope，immunohistochemical detection of vascular tissue HSP90，eNOS expression. Results ①thoracic aorta endothelial cells in DM group rats off，smooth muscle derangement thoracic aorta of.PB rats showed focal loss of endothelial cells，smooth muscle cells arranged a little disorder of endothelial cells of rats in.N group is smooth，smooth muscle cells arranged in neat rows②the rats in the DM group than in N group rats compared to the expression of HSP90 in thoracic aorta（P<0.05）increased significantly in.PB group compared with DM group，the expression of HSP90 in thoracic aorta（P>0.05）.No significant difference between the three groups had no significant difference in eNOS expression in the aorta of diabetic rats（P>0.05）.Conclusion ①the high-fat feeding combined with intraperitoneal injection of STZ，thoracic aorta showed early atherosclerotic changes；②the expression of HSP90 in the chest the aorta of diabetic rats increased significantly，probucol treatment had no obvious effect on its expression.

Key words：HSP90；ENOS；Diabetic rats；Diabetic macrovascular disease；Probucol

糖尿病大血管病變占糖尿病患者致死原因的75%，其突出的特點(diǎn)是加速的動(dòng)脈粥樣硬化。近年研究發(fā)現(xiàn)熱休克蛋白90（heat shock protein 90，Hsp90）作為蛋白折疊的輔助因子，介導(dǎo)內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）活性，調(diào)節(jié)NO和超氧化物的產(chǎn)生，對(duì)血管內(nèi)皮起重要作用。糖尿病高血糖狀態(tài)下，HSP90和eNOS是否介導(dǎo)了糖尿病大血管病變的發(fā)生機(jī)制，目前無(wú)相關(guān)報(bào)道。

普羅布考是一種調(diào)脂藥，臨床應(yīng)用廣泛，其抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用近年被較多關(guān)注。普羅布考抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用是否有HSP90介導(dǎo)，目前尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)建立糖尿病大鼠模型，誘導(dǎo)大血管病變發(fā)生，觀察糖尿病大鼠胸主動(dòng)脈HSP90、eNOS表達(dá)的變化及普羅布考干預(yù)治療對(duì)糖尿病大鼠胸主動(dòng)脈HSP90、eNOS表達(dá)的影響，實(shí)驗(yàn)旨在進(jìn)一步為糖尿病大血管病變及普羅布考抗動(dòng)脈粥樣硬化提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康8周齡SD雄性幼鼠50只，體重180～250g。由長(zhǎng)沙市東創(chuàng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技公司提供[SCXK（湘）2009-0012]。

1.2動(dòng)物分組及處理 SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組（N組，n=10）和模型組（n=40）。模型組予高糖高脂飼料喂養(yǎng)聯(lián)合腹腔注射STZ（30 mg/kg）造模，72h后測(cè)隨機(jī)血糖≥16.7 mmol/L并維持2 w為模型成功。對(duì)照組予以普通飼料喂養(yǎng)并等量檸檬酸鈉緩沖液腹腔注射。共30只大鼠造模成功。

將造模成功的大鼠隨機(jī)分為糖尿病組（DM組，n=15）和普羅布考組（PB組，n=15）。喂養(yǎng)8周高糖高脂飼料，PB組每天以普羅布考500 mg/（d·kg）灌胃，N組和DM組以等容量羧甲基纖維素鈉溶液灌胃。至全部實(shí)驗(yàn)結(jié)束，N組、DM組、PB組有效大鼠數(shù)分別為7、8、7只。

1.3標(biāo)本采集 至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，全部大鼠禁食不禁水12 h，眼眶靜脈取血，離心分離血清，檢測(cè)血糖。取血后以水合氯醛腹腔注射麻醉，分離胸主動(dòng)脈，-80℃冰箱保存。第2 d胸主動(dòng)脈經(jīng)常規(guī)固定、脫水、透明、浸蠟、包埋等步驟制成蠟塊。

1.4指標(biāo)觀察和檢測(cè)

1.4.1血清血糖檢測(cè) 血糖采用強(qiáng)生穩(wěn)步倍加型血糖儀測(cè)定。

1.4.2主動(dòng)脈病理組織學(xué)觀察 取胸主動(dòng)脈，HE染色光鏡下觀察血管的病理情況。

1.4.3 HSP90和eNOS在胸主動(dòng)脈壁的表達(dá) 應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色原理進(jìn)行，具體操作參照試劑盒說(shuō)明。結(jié)果判定：陽(yáng)性信號(hào)為胞漿內(nèi)出現(xiàn)染色為黃色或棕黃色顆粒。采用Motic Fluo 1.0 圖像分析系統(tǒng)對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行分析：高倍鏡下（×400）每張切片隨機(jī)選取5個(gè)互不重復(fù)的視野，獲得每個(gè)圖像的積分光密度（integal optieal density，IOD）和總?cè)旧?yáng)性面積（SUM）。蛋白表達(dá)量越大，染色越深，IOD值越大。每個(gè)圖像的IOD值乘以陽(yáng)性染色面積即為總?cè)旧?yáng)性面積。二者結(jié)合判斷目的蛋白的實(shí)際表達(dá)和分布。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)經(jīng)正態(tài)分布檢驗(yàn)后用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩樣本均數(shù)的比較用t檢驗(yàn)，多樣本均數(shù)比較用單因素方差分析。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1各組干預(yù)8 w后血糖比較 PB組、DM組較N組相比，血糖升高。PB組和DM組相比，血糖無(wú)明顯差別。

2.2胸主動(dòng)脈HE染色 胸主動(dòng)脈HE染色顯示，DM組大鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞廣泛脫落，平滑肌細(xì)胞增生，排列紊亂，可見(jiàn)少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，未見(jiàn)泡沫細(xì)胞及斑塊形成。PB組可見(jiàn)內(nèi)皮細(xì)胞灶狀脫落，平滑肌細(xì)胞排列稍紊亂。N組內(nèi)皮細(xì)胞光滑平整，平滑肌細(xì)胞排列整齊。

2.3胸主動(dòng)脈HSP90免疫組化 免疫組織化學(xué)檢測(cè)顯示，HSP90在動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞均有表達(dá)，且DM組和PB組明顯高于N組，見(jiàn)圖2。Motic Fluo 1.0 圖像分析系統(tǒng)對(duì)染色結(jié)果分析，總?cè)旧?yáng)性面積結(jié)果顯示：N組、DM組、PB組三組總陽(yáng)性染色面積分別為（23.97±8.41）μm2、（58.38±8.41）μm2、（50.47±7.36）μm2，DM組和PB組與N組比較均明顯增高（P<0.001），而DM組和PB組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。提示HSP90在糖尿病大鼠胸主動(dòng)脈中表達(dá)明顯升高，PB治療對(duì)胸主動(dòng)脈的HSP90的表達(dá)無(wú)明顯影響。

2.4胸主動(dòng)脈eNOS免疫組化 免疫組織化學(xué)檢測(cè)顯示，eNOS僅在動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)，平滑肌細(xì)胞無(wú)表達(dá)，各組之間eNOS的表達(dá)無(wú)明顯差別，見(jiàn)圖3。Motic Fluo 1.0 圖像分析系統(tǒng)對(duì)染色結(jié)果分析，N組、DM組、PB組三組總陽(yáng)性染色面積分別為（2.74±0.71）μm2、（3.50±0.71）μm2、（2.65±0.83）μm2，總?cè)旧?yáng)性面積顯示各組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用高糖高脂飼料喂養(yǎng)聯(lián)合腹腔注射STZ方法制造糖尿病動(dòng)物模型并檢測(cè)胸主動(dòng)脈粥樣硬化程度，觀察到糖尿病組大鼠胸主動(dòng)脈呈早期動(dòng)脈粥樣硬化改變；糖尿病組大鼠較N組大鼠相比，胸主動(dòng)脈表達(dá)HSP90明顯升高；普羅布考治療組與糖尿病組比較，胸主動(dòng)脈HSP90表達(dá)無(wú)明顯差異；三組間胸主動(dòng)脈表達(dá)eNOS無(wú)明顯差異。

實(shí)驗(yàn)采用高糖高脂飲食聯(lián)合STZ腹腔注射建立糖尿病大血管病變的大鼠模型，其機(jī)制是：①高糖高脂飲食促進(jìn)胰島β細(xì)胞凋亡，加重胰島素抵抗，加速動(dòng)脈粥樣硬化，對(duì)血管形成“糖脂毒性”，符合目前糖尿病大血管病變的致病學(xué)說(shuō)。②STZ腹腔注射打擊胰腺功能，并繼續(xù)喂以高糖高脂飼料致胰腺失代償分泌，最后誘發(fā)高血糖癥，符合人類糖尿病的演變進(jìn)程。但本實(shí)驗(yàn)制造的糖尿病大血管模型僅表現(xiàn)為早期動(dòng)脈粥樣硬化，沒(méi)有出現(xiàn)典型的主動(dòng)脈內(nèi)膜下大量泡沫細(xì)胞聚集，中膜增生的變化，考慮與下列因素有關(guān)：①鼠類為抗血管病變動(dòng)物，雖易出現(xiàn)血脂增高及外周胰島素抵抗，但不易形成動(dòng)脈粥樣病變。②喂養(yǎng)時(shí)間不夠。糖尿病大血管病變的形成是一個(gè)比較漫長(zhǎng)的過(guò)程，如在人類一般需要經(jīng)歷5～10年的高血糖時(shí)期，才能形成較明顯的大血管病變。但對(duì)動(dòng)物，若是過(guò)度延長(zhǎng)觀察時(shí)間，動(dòng)物死亡率也將明顯增高，因此改進(jìn)造模的方法可能提高實(shí)驗(yàn)的效率。有報(bào)道，在上述方法的基礎(chǔ)上飼料中添加膽酸鈉及甲巰咪唑和配合維生素D3灌胃的方法能顯著提高糖尿病大血管病變大鼠的成模率[1]。

Hsp90是與應(yīng)激保護(hù)密切相關(guān)的一類分子蛋白，研究發(fā)現(xiàn)它在心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展和血流動(dòng)力障礙中也起到重要的作用[2]。HSP90的作用主要是通過(guò)調(diào)節(jié)eNOS活性而實(shí)現(xiàn)，eNOS產(chǎn)生NO可以保護(hù)內(nèi)皮功能，若產(chǎn)生超氧化物則損傷內(nèi)皮功能。氧化應(yīng)激是高血糖引起組織損傷的共同基礎(chǔ)[3]，參與了微血管和大血管并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)觀察到糖尿病組大鼠胸主動(dòng)脈HSP90表達(dá)明顯升高，可能原因?yàn)椋簯?yīng)激情況下，機(jī)體為了抵抗損傷帶來(lái)的不可逆性傷害，內(nèi)皮細(xì)胞HSP90分泌水平代償性增高。但這一代償因素在動(dòng)物整體情況下并沒(méi)有多大積極意義，因?yàn)楦咛且灿绊慔SP90-eNOS的結(jié)合和eNOS的磷酸化，導(dǎo)致HSP90和eNOS解偶聯(lián)，產(chǎn)生大量的活性氧自由基，提高了氧化應(yīng)激水平，加速了大血管病變的發(fā)生和發(fā)展[4-5]。本實(shí)驗(yàn)同時(shí)檢測(cè)的eNOS蛋白總量在糖尿病和正常大鼠中未存有差異，可能與本實(shí)驗(yàn)所采用的eNOS抗體類型有關(guān)。實(shí)驗(yàn)是針對(duì)所有eNOS蛋白的抗體，包括聚合型和解離型，而高糖情況下，僅是聚合型eNOS的比例減少，而總eNOS的量并無(wú)變化。因此，若能分別采用針對(duì)聚合型和解離型的差異性蛋白抗體，有望得出eNOS在糖尿病與正常大鼠組間存在顯著性差異。

本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，經(jīng)普羅布考干預(yù)治療后，糖尿病大鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)HSP90的表達(dá)無(wú)明顯改變，提示普羅布考可能不影響HSP90與eNOS的相互作用途徑。普羅布考抗氧化作用主要來(lái)自氧離子捕捉和斷鏈抗氧化的特性，而HSP90參與eNOS活性調(diào)節(jié)可能是通過(guò)影響小窩蛋白（caveolin-1）、酶的活化、成熟和轉(zhuǎn)移及接下來(lái)的蛋白激酶（Akt）的活性、Serine的磷酸化[6]，二者作用途徑之間可能沒(méi)有必然的共同通路。另外，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物例數(shù)較少可能也是結(jié)果陰性的原因所在。

綜上所述，糖尿病大鼠胸主動(dòng)脈HSP90的表達(dá)水平明顯增高，提示HSP90可能參與糖尿病大血管病變的發(fā)生機(jī)制，但其具體的分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步探索。

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