快速冰凍免疫組化染色診斷陰道惡性黑色素瘤1例及其應用價值

宋劍嬋　司婧文　陳凌　張新瑩　師宜荃　劉易欣

摘要：陰道惡性黑色素瘤是一類非常罕見，但惡性程度高且復發率高的腫瘤，其發病率在全球范圍內呈上升趨勢，嚴重威脅了女性的生命健康。本文報道一例天津市中心婦產科醫院快速冰凍切片免疫組化染色診斷陰道惡性黑色素瘤的病例。該患者為老年女性，19年前因子宮肌瘤行子宮全切術，現因陰道分泌物增多伴出血就診，陰道鏡檢查發現宮頸黑色病變，TCT檢測見部分含有黑色素的細胞，患者術中送檢組織進行冰凍檢測，但因送檢組織小，不具備診斷惡性黑色素瘤的標準，遂行快速冰凍免疫組化染色HMB45和MelanA均呈陽性，冰凍診斷考慮為惡性黑色素瘤，石蠟切片HE及免疫組化染色支持陰道惡性黑色素瘤。通過報道該病例，探討快速冰凍切片免疫組化染色的臨床意義及應用價值。

關鍵詞：惡性黑色素瘤，快速冰凍免疫組化，HMB45，MelanA

Diagnosis of Vaginal Malignant Melanoma by Rapid Frozen Immunohistochemical Staining：A Case Report and Its Application Value

SONG Jian-chan，SI Jing-wen，CHEN Ling，ZHANG Xin-ying，SHI Yi-quan，LIU Yi-xin

（Department of Pathology，Tianjin Central Hospital of Gynecology Obstetrics，Tianjin，300100，China）

Abstract：Vaginal malignant melanoma is a very rare，but high degree of malignancy and high recurrence of the tumor，the incidence rate in the global context is on the rise，a serious threat to women's life and health.This paper reports a case of Tianjin Central Obstetrics and Gynecology Hospital rapid frozen section immunohistochemistry staining in diagnosis of vaginal malignant melanoma cases.The patient was an old women，19 years ago due to uterine fibroids hysterectomy，due to increased vaginal secretions with hemorrhage treatment，cervical lesions found in black colposcopy and TCT detection showed some melanin containing cells.For patients with frozen tissue detection，but because the inspection organization is small，does not have the diagnosis of malignant melanoma of the standard，carry out the frozen immunohistochemistry staining of HMB45 and MelanA were positive，frozen for diagnosis of malignant melanoma，paraffin HE and immunohistochemical staining in support of malignant melanoma in the vagina.Through the case study reports，to investigate the clinical significance and application value of rapid frozen section immunohistochemical staining.

Key words：Malignant melanoma；Rapid frozen immunohistochemistry；HMB45；MelanA

1資料與方法

1.1病例 患者，女性，67歲，主因子宮肌瘤行子宮全切術后19年，陰道分泌物增多伴出血就診于外院，診斷為陰道炎，為進一步明確診斷轉入天津市中心婦產科醫院。陰道鏡檢查發現宮頸黑色病變，采集宮頸細胞樣本進行液基細胞學技術（Thinprep cytologic test，簡稱TCT）檢測，鏡下見含有黑色素的細胞，見圖1。遂于2016年8月29日進行手術，術中送檢陰道內組織及病灶（小米大～直徑0.5 cm）共8塊做快速冰凍檢測，由于送檢組織小，細胞異型小，無典型惡性黑色素瘤形態特點，術中正確診斷對于患者手術方式選擇至關重要，且該患者年齡較大，無法耐受二次手術，遂決定行術中快速冰凍免疫組化檢測，HMB45和MelanA染色，腫瘤細胞均呈陽性表達，冰凍診斷為：陰道黑色素腫瘤，考慮為惡性黑色素瘤。之后臨床對腫物進行了擴大切除，進一步切除了雙側附件、宮旁組織、陰道壁及雙側髂總、髂內、髂外、閉孔、腹股溝淋巴結。

1.2方法

1.2.1快速冰凍切片免疫組織化學染色 快速免疫組化的檢測系統采用邁新公司的即用型快捷免疫組化MaxVisionTM試劑盒，一抗HMB45為中杉金橋公司的ZM-0187鼠單抗，MelanA為中杉金橋公司的ZM-0398鼠單抗，顯色分別用Dako公司的Dako RealTM DAB和中杉金橋公司的ZLI-9036 AEC酶底物試劑盒。

術中送檢的組織標本進行快速冰凍制片后，經95%乙醇固定2 min，稍水洗，3%H2O2 2 min，PBS 1 min ×3次，分別滴加HMB45和MalanA一抗，37°C孵育20 min，PBS 1 min ×3次，然后滴加快捷型二抗，37°C孵育8 min，PBS稍洗后，滴加DAB顯色2 min，稍水洗后進行復染，常規脫水透明后封片，整個染色過程共約35～40 min。

1.2.2石蠟組織切片染色 組織標本固定于10%中性福爾馬林，經脫水、透明、浸蠟后，石蠟包埋、常規切片、HE染色。

1.2.3石蠟組織切片免疫組織化學染色 免疫組化染色一抗HMB45為中杉金橋公司的ZM-0187鼠單抗，MelanA為中杉金橋公司的ZM-0398鼠單抗，二抗為深達生物公司的DD-13免疫顯色試劑，顯色試劑同冰凍免疫組化。常規石蠟切片后65°C烤片1 h，透明劑5 min×3脫蠟，無水乙醇3 min×3，95%乙醇3 min，80%乙醇3 min，水洗，EDTA（PH8.0）熱修復95°C，3 min，待冷卻后經3%H2O2封閉10 min，流水沖洗，PBS 3 min×3，然后滴加一抗，37°C孵育1 h，PBS 3 min×3，然后滴二抗，室溫孵育30 min，PBS 3 min×3，滴加DAB顯色2 min，稍水洗后進行復染，常規脫水透明后封片，整個染色過程約4～5 h。

2結果

2.1快速冰凍切片HE及免疫組化染色：HE染色細胞異型小，惡性黑色素瘤形態不典型，HMB45和MelanA部分細胞呈陽性表達，定位于細胞漿，見圖2。

1.2石蠟切片HE染色結果 鏡下見大部分區域腫瘤細胞較小，異型性小，圓形或多角形，上皮樣，部分細胞胞漿空亮，少部分細胞內可見黑色素顆粒；零件少部分區域細胞呈梭形，異型性較大，部分細胞漿內可見黑色素顆粒，見圖3。病理診斷：陰道黑色素瘤，結節樣惡性黑色素瘤；Breslow厚度：1.3 cm；Clark水平：Ⅳ；有水平（放射狀）生長、垂直生長及潰瘍，核分裂像1～4個/2mm2，無退化，淋巴細胞浸潤不明顯，周圍切緣及深部切緣陰性，見微衛星灶，有血管浸潤，無神經浸潤；AJCC分期：T4bN2aMx。

2.3石蠟切片免疫組化染色結果 MelanA和HMB45染色，腫瘤細胞均陽性；其中AEC顯色，陽性結果呈紅色；DAB顯色，陽性結果為呈棕黃色；細胞內色素呈棕至棕黑色，細胞核均呈藍色，見圖4。

2討論

惡性黑色素瘤是來源于黑色素細胞的一種高度惡性腫瘤[1]，原發于女性生殖道的惡性黑色素瘤少見，僅占全部惡性黑色素瘤的3%～5%[2]。1887 年Poronas 首次報道了原發性陰道惡性黑色素瘤，至今這種病例只有少數個案報道及病例分析，全球的病例報道文獻不足300 例[3]，該疾病惡性度高，易發生復發轉移，其5年生存率約為25%[4]。目前，手術仍是陰道惡性黑色素瘤首選治療方案，能有效延長患者生存時間[5]。此外，早期發現有助于延長患者的存活時間，因此對惡性黑色素瘤病理診斷分析的準確性顯得極為重要，掌握惡性黑色素瘤病理診斷特點，有助于臨床治療和患者預后。免疫組織化學染色中，惡性黑色素瘤腫瘤細胞不同程度地表達黑色素細胞標志物S-100、HMB45和MelanA，由于各標志物的敏感性和特異性不同，故采用至少兩種標志物聯合檢測，可提高惡性黑色素瘤的診斷準確性[6]。本病例因冰凍送檢組織小，鏡下惡性黑色素瘤細胞形態不典型，異型性小，且患者年齡較大，無法耐受二次手術，所以需行快速冰凍免疫組化以明確診斷，選取HMB45和MelanA兩種抗體聯合使用。我們所用的快速冰凍免疫組化只需35～40 min就能完成染色過程，對于術中需要明確診斷，尤其是明確良惡性診斷的病例具有重要的臨床意義和應用價值，但并不是所有用于石蠟免疫組化的抗體，均適用于快速冰凍免疫組化，因此我們也在進一步研究和探討更多適用于快速冰凍免疫組化的指標。

參考文獻：

[1]周茜，黃綺，姚曉虹，等.29例皮膚惡性黑色素瘤臨床病理分析[J].中國醫藥指南，2008，6（9）：20.

[2]Weinstock M A.Malignant melanoma of the vulva and vagina in the united states：Patterns of incidence and opulatin-based estimates of survival[J].Am J Obstet Gyneeol，1994，171（5）：1225-30.

[3]Charlotte Vaysse，Patricia Pautier，Thomas Filleron，et al.A large retrospective multicenter study of vagina melanomas：implications for new management[J].Melanoma Research，2013，23（2）：138-146.

[4]Tcheung W J，Selim M A，Nd H J，et al.Clinicopathologic study of 85 cases of melanoma of the female genitalia[J].Journal of the American Academy of Dermatology，2012，67（4）：598.

[5]Fmmovitz M，Etchepareborda M，Sun CC，et al.Primary malignant melanoma of the vagina[J].Obstet Gynecol，2010，116（6）：1358-1365.

[6]Tcheung W J，Selim M A，Herndon J N，et al.Clinicopathologic study of 85 cases of melanoma of the female genitalia[J].J Am Acad Dermatol，2012，67（4）：598-605.編輯/高章利