反相HPLC法測定比格犬血漿中白藜蘆醇含量及其藥代動力學研究

甄玉改

反相HPLC法測定比格犬血漿中白藜蘆醇含量及其藥代動力學研究

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目的建立測定比格犬血漿中白藜蘆醇的HPLC法，并研究白藜蘆醇在比格犬體內的藥代動力學。方法色譜柱為C18柱，流動相乙腈-水（32∶68），流速為1.0m l/min，檢測波長306 nm：血漿樣品用乙酸乙酯萃取法預處理。結果線性范圍0.1～10.0μg/m l，相關系數r=0.9995。日內RSD<10%，日間RSD<15%，回收率97.6%～103.3%。比格犬口服給藥白藜蘆醇主要藥代動力學參數為15min后血漿藥物濃度達峰值，Cmax為4.789μg/ml，半衰期為135min。結論該方法靈敏度高，操作方便，適用于白藜蘆醇在比格犬體內的藥代動力學研究：本品口服吸收快消除迅速。

白藜蘆醇；藥代動力學；比格犬；反相HPLC法

白黎蘆醇（Resveratrol，見圖1Ⅰ）化學名稱為3，5，4’-三羥基-二苯乙烯，是一種多酚類植物抗毒素，具有抗氧化活性，主要存在于葡萄［1］、葡萄汁、紅酒及其他植物提取物中［2-4］，是一種植物在惡劣環境下或遭到病原體侵害時，自身分泌的一種可抵御霉菌感染的抗生素。白藜蘆醇的抗心血管疾病作用因“法國悖論”而被學者們認識，進一步研究發現，白藜蘆醇還具有抗腫瘤、抗炎、免疫調節、抗菌抗病毒、抗衰老及雌激素樣活性等多種藥理作用［5-7］，但有關其在比格犬體內藥代動力學的研究尚未見報道。為闡明白藜蘆醇在比格犬體內的藥代動力學規律，本文建立了以液液萃取為前處理的反相HPLC法，并研究了白藜蘆醇單次口服給藥后在比格犬體內的藥代動力學過程。

1 材料與儀器

1.1 藥品與試劑白藜蘆醇對照品和根皮素（圖1Ⅱ）對照品購自中國藥品生物制品檢定所；白藜蘆醇原料藥購自西安小草植物科技有限公司，含量＞98%；乙腈為進口色譜純（美國TEDIA公司）；其他試劑為國產分析純；色譜用水為超純水。

圖1 白藜蘆醇（Ⅰ）及內標根皮素（Ⅱ）結構

1.2 動物及給藥方式比格犬（10±3）kg，雌雄各半，白藜蘆醇給藥劑量為300mg/kg，給藥方式為口服。

1.3 儀器Agilent 1100液相色譜儀（Agilent 1100泵、Agilent1100 DAD檢測器、Agilent 1100色譜工作站）；電子分析天平（德國Sartorius公司）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件色譜柱：UltimateAQ-C18（150mm×4.6mm，5μm，Welch Materials.Inc.，USA）；C18保護柱（10mm×4.6mm，江蘇漢邦）；流動相：乙腈∶水=32∶68（v/v）；流速：1ml/min；檢測波長：306 nm，進樣量：20μl，柱溫：30℃。

2.2 標準溶液及內標溶液配制精密稱量白藜蘆醇對照品5.00mg，于50ml棕色容量瓶中以甲醇溶解并釋至刻度，搖勻，制成對照品儲備液，-20℃避光保存備用。

精密稱量根皮素對照品50.00mg，于50m l容量瓶中以甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成對照品儲備液，-20℃避光保存備用。

2.3 血漿樣品預處理取比格犬血漿0.2 ml于1.5 ml離心管中，加10μl內標物根皮素（640μg/ ml），渦旋振蕩30 s，加1ml乙酸乙酯，渦旋3min。12000 rpm×10min離心，取上清液800μl，通風櫥中氮氣流吹干，加甲醇80μl，渦旋振蕩3min，12000 rpm× 10min離心，取上清液20μl進行HPLC分析。

2.4 方法的專屬性取比格犬空白血漿0.2ml，按“血漿樣品預處理”；將一定濃度的白藜蘆醇標準溶液和內標溶液加入空白血漿中，同法操作；取比格犬口服給藥后收集的血漿樣品，同法操作。按“色譜條件”中的色譜條件下進樣分析，結果顯示，空白血漿中內源性物質不干擾白藜蘆醇和內標的測定，白藜蘆醇的保留時間為5.2min，內標的保留時間為8.0min，見圖2。

圖2 白藜蘆醇及內標根皮素的色譜圖

2.5 標準曲線制備與線性范圍精密量取白藜蘆醇對照品儲備液，以甲醇逐步稀釋成1.0，5.5，10.0，32.5，55.0，100.0μg/ml白藜蘆醇對照品溶液。

分別精密吸取上述對照品系列溶液10μl和內標溶液10μl，分別加入200μl血漿中，按“血漿樣品預處理”，處理后系列標準溶液最終濃度為0.10、0.55、1.00、3.25、5.50、10.00μg/m l，取上清液20μl進行高效液相分析。

以白藜蘆醇色譜峰面積（A1）與內標色譜峰面積（A2）之比Y對白藜蘆醇對照品濃度C（μg/m l）進行加權最小二乘法回歸，見圖3?；貧w方程為：Y= 1.013X-0.03（R=0.9995，n=5），權重：1/C2；線性范圍：0.10～10.00μg/ml。

圖3 白藜蘆醇標準曲線

2.6 精密度考察照標準曲線制備方法制備白藜蘆醇含量為0.325μg/m l、3.250μg/m l、8.875μg/m l的血漿樣品，并進行預處理。

上述各樣品在各自色譜條件下同1天連續進樣5次，測定峰面積，分別計算白藜蘆醇的日內相對標準誤差（RSD）。連續3天進樣5次，測定峰面積，計算白藜蘆醇的日間RSD。結果見表1。

表1 白藜蘆醇測定方法精密度

2.7 提取回收率實驗取比格犬空白血漿0.2m l若干份，加入10μl不同濃度的標準溶液，按“血漿樣品預處理”，使白藜蘆醇的濃度分別為0.325、3.250、8.875μg/ml，并進行測定。計算樣品的測得濃度，與配制濃度對照，求得本法的加樣回收率及準確度。見表2。

表2 血漿中白藜蘆醇測定方法的提取回收率

2.8 穩定性試驗總結了0.325，3.250，8.875μg/ ml三個濃度樣品的穩定性數據，結果表明樣品在這些實驗中都很穩定，所以說明在樣品常規分析中不會出現與樣品穩定性有關的問題。見表3。

表3 白藜蘆醇的穩定性試驗

2.9 實驗設計與樣品采集與處理4只比格犬禁食過夜，按300mg/kg口服白藜蘆醇，分別于給藥后2，5，10，15，30min和1.0，1.5，2，3，4，6，8 h采血，收集于肝素化的離心管內，離心1500 rpm×10min，分離出血漿并于-20℃凍存待測。

取上述樣品血漿0.2m l于1.5m l離心管中，加10μl內標物根皮素甲醇溶液（640μg/m l），渦旋振蕩30 s，加1m l乙酸乙酯，渦旋3min。12000 rpm× 10min離心，取上清液800μl，通風櫥中氮氣流吹干，加甲醇80μl，渦旋振蕩3min，12000 rpm×10min離心，取上清液20μl進行HPLC分析。

2.10 比格犬口服給藥后的藥代動力學比格犬口服白藜蘆醇后各時間點所測得的血藥濃度-時間曲線見圖4。采用中國藥理學會數學藥理委員會編制的DAS2.0實用藥代動力學軟件處理血藥濃度數據，求得其藥代動力學參數，結果見表4。

圖4 比格犬口服白藜蘆醇后血藥濃度-時間曲線

3 討論

本實驗建立了HPLC法測定比格犬血漿中白藜蘆醇含量的方法，實驗證明，本方法能夠有效地測定藥物在血漿中含量的變化情況及其藥代動力學研究，靈敏度高，重現性好，操作簡便快捷，對準確考察黃白藜蘆醇對比格犬藥代動力學的作用具有指導意義。

本研究表明，比格犬口服白藜蘆醇后藥物從胃腸道吸收快，2min即可測到原型藥，15min左右血藥濃度達峰值Cmax為4.789μg/m l。白藜蘆醇在比格犬體內的半衰期為135min，說明本品在比格犬體內消除迅速。

表4 比格犬口服白藜蘆醇后白藜蘆醇的藥代動力學參數

［1］Fulda S，Debatin KM.Resveratrol modulation of signal transduction in apoptosis and cell survival：A mini-review［J］.Cancer Detection and Prevention，2006，30（2）：217-223.

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［5］Lin HS，Paul C.Ho.A rapid HPLC method for the quantification of 3，5，4′-trimethoxy-trans-stilbene（TMS）in rat plasma and its application in pharmacokinetic study［J］.Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2009，49（3）：387-392.

［6］Savouret JF，Quesne M.Resveratrol and cancer：a review［J］. Biomed Pharmacother，2002，56（1）：84-87.

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［2016－05－16收稿，2016－06－14修回］［本文編輯：劉一洋］

Reverse HPLC method for the quantification of resveratrol in Beagle dog p lasma and its application in pharm acokinetic study

ZHEN Yu-gai.
Dept.of Pharmacy，No.401 Hospital of Navy，Qingdao，Shandong 260002，China

Objective To develop a HPLC-UV method for quantitative determination of resveratrol in Beagle dog plasma and to study the pharmacokinetics of resvetrol in Beagle dog after oral administration. M ethods Chromatographic separation was achieved on an Ultimate AQ-C18 column（150 mm×4.6 mm，5μm）using acetonitrile-water（32∶68，v/v）as mobile phase at a flow rate of 1.0m l/min.The UV detection wavelength was set at 306 nm，and the assay was executed at 30℃.Results The method was found to be linear in the range of 0.10-10.00μg/m l.And the main pharmacokinetic parameters of resveratrol was Cmax=4.789μg/m l，Tmax= 15min，T1/2=135min.Conclusion The above method is sensitive，simple and successfully app lied in the study of pharmacokinetics of resveratrol in Beagle dog plasma which resveratrol was absorbed and eliminated quickly.

Resveratrol；Pharmacokinetics；Beagle dog；Reverse HPLC

R917

A

10.14172/j.issn1671-4008.2017.01.020

260002山東青島，解放軍401醫院（甄玉改）