C57BL/6J小鼠實驗性自身免疫性腦脊髓炎模型建立的關鍵性問題

吳彥青 郭玉紅,2,3 劉清泉,2,3

(1 首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)醫(yī)院,北京,100010; 2 北京中醫(yī)醫(yī)院順義醫(yī)院,北京,101300;3 中醫(yī)感染性疾病基礎研究北京市重點實驗室,北京,100010)

C57BL/6J小鼠實驗性自身免疫性腦脊髓炎模型建立的關鍵性問題

吳彥青1郭玉紅1,2,3劉清泉1,2,3

(1 首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)醫(yī)院,北京,100010; 2 北京中醫(yī)醫(yī)院順義醫(yī)院,北京,101300;3 中醫(yī)感染性疾病基礎研究北京市重點實驗室,北京,100010)

實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)模型是國際公認的多發(fā)性硬化(MS)的經(jīng)典動物模型,被廣泛用于MS發(fā)病機制和評價免疫調(diào)節(jié)藥物的實驗研究。實驗操作中仍有較多缺陷導致發(fā)病率不能達到100%和死亡率偏高,需要對造模的關鍵技術不斷完善。加強該模型免疫前準備工作、免疫操作和免疫后護理3個方面的研究,分析EAE模型成功建立的關鍵性問題,并根據(jù)實驗操作過程提出解決辦法,完善EAE模型的規(guī)范化造模流程,可以使EAE模型具備發(fā)病率高、死亡率低、模型穩(wěn)定的特點。

實驗性免疫性腦脊髓炎模型;關鍵性問題;免疫前處理;免疫操作;免疫后護理

實驗性自身免疫性腦脊髓炎(Experimental Autoimmune Encephalomyelitis,EAE)是由自身抗原特異性T細胞進行介導的自身免疫性疾病,在病理特征以及臨床表征上與多發(fā)性硬化(Multiple Sclerosis,MS)非常相似,是當前國際公認的、被廣泛運用來評價防治MS的免疫調(diào)節(jié)藥物和探討MS的發(fā)病機制進行動物實驗研究的經(jīng)典MS實驗動物模型[1-4]。C57BL/6J純系小鼠具有遺傳背景明確的品系特點,髓鞘少突膠質細胞糖蛋白(MOG35-55)誘導免疫的C57BL/6J小鼠EAE模型主要表現(xiàn)為復發(fā)-緩解型病程,適合從分子免疫學的角度探討發(fā)病機制[5],日漸成為MS臨床前研究、復雜新藥開發(fā)的重要研究手段。但是,該模型實驗操作中仍有較多缺陷導致發(fā)病率不能達到100%、臨床表現(xiàn)和病程重復性差、死亡率偏高。因此,MOG35-55誘導C57BL/6J小鼠造模過程中的諸多細微的關鍵技術無疑應該成為值得關注的問題。

1 免疫前準備工作

1.1 實驗動物的確定與飼養(yǎng) 不同品種或品系的實驗動物誘導EAE的易感性與臨床特點迥異,可能由主要組織相容性復合體基因的多樣性表達引起[6];EAE的敏感性和臨床過程的特點與實驗動物的動物品種、年齡、性別具有相關性[7]。而小鼠在病理學方面的特點與人類非常相似[8],無論是慢性進展型病程還是復發(fā)-緩解型病程上的模型在病理上均可見脫髓鞘特征。C57BL/6J小鼠一直被認定為“標準”的近交系,可以為多種突變基因提供遺傳背景,是生理學方面、免疫學方面、遺傳學方面、腫瘤學方面在實驗研究中的常用品系。MOG35-55誘導C57BL/6J小鼠建立EAE模型實驗過程中,宜選用8～10周齡雌性C57BL/6J小鼠,體質量18 g左右[9-10]。免疫操作前小鼠進行適應性飼養(yǎng)1周左右,飼養(yǎng)環(huán)境維持明-暗每次各12 h交替循環(huán),籠中每天給予充足的飼料和潔凈飲水[3]。

1.2 抗原乳劑的配制 完全弗氏佐劑(Complete Freun′s Adjuvant,CFA)是實驗中最常用的免疫佐劑,無論是皮內(nèi)還是皮下注射CFA均可提高細胞免疫反應的強度來激發(fā)多種自身免疫性疾病。大多數(shù)EAE模型在誘導方案中會采用CFA降低機體對抗原的破壞以延遲機體對抗原的免疫耐受,同時促進抗原的彌散,從而使抗原對機體緩慢持續(xù)的發(fā)揮免疫原性[11]。相對于易感大鼠,小鼠對誘導EAE相對抵抗,主要體現(xiàn)在發(fā)病率以及發(fā)病時間的差異,因此需要佐劑輔助。此外,CFA可增加EAE模型血腦屏障(Blood Brain Barrier,BBB)的通透性和中樞神經(jīng)系統(tǒng)血管周圍血清蛋白滲出[12]。結核分枝桿菌在EAE模型的誘導中主要通過激發(fā)T細胞介導的免疫反應來擴大免疫效應并引起淋巴結增生[13]。

乳化于完全弗氏佐劑的中樞神經(jīng)系統(tǒng)不同特異性抗原在不同實驗動物上誘導多種EAE,常見的抗原包括髓磷脂堿性蛋白(MBP)、蛋白脂質蛋白質(PLP)、髓鞘相關糖蛋白(MAG)和MOG,C57BL/6J小鼠是具有EAE-susceptible特性的品系之一,其對MOG的敏感抗原表位是35-55位氨基酸[14],其致敏的主要抗原是MOG35-55多肽(MEVGWYRSPFSRVVHLYNGK)。

MOG35-55抗原油包水乳劑的配制首先將MOG35-55多肽15 mg加入生理鹽水7.5 mL混勻為A液(每100 μL液體含MOG35-55200 μg),將結核桿菌粉末30 mg加入完全弗氏佐劑(TB 1 mg/mL)7.5 mL中混為B液(每100 μL含結核桿菌500 μg),采用玻璃注射器吸取A液和B液后反復用力抽打2個小時以上充分乳化至將抗原油包水乳劑滴可以在清潔水面聚集而不分散并保持小球狀。見圖1。

1.3 百日咳毒素溶液的配制 早期的研究顯示,當用小鼠脊髓勻漿組織溶于完全弗氏佐劑中來誘導EAE模型時,百日咳毒素可以增加模型的成功率和加重神經(jīng)功能損傷癥狀[15]。后來的研究顯示百日咳毒素能破壞血腦屏障,防止自身反應T細胞抗原產(chǎn)生,刺激抗原呈遞細胞(APCs),不可逆地抑制第二信使和影響信號通路[16],所有的這些結果都在解釋百日咳毒素幫助誘導EAE模型的可能機制。將百日咳毒素采用生理鹽水稀釋成0.1 mL含400 ng百日咳毒素的溶液。

圖1 抗原乳劑配制成功的標準

2 免疫操作

2.1 C57BL/6J小鼠麻醉 麻醉是保障動物福利的重要內(nèi)容之一,也是動物實驗的一項重要基本技術[17-18]。實驗動物麻醉是保證實驗成功的一個重要環(huán)節(jié),采用安全、有效、適宜的麻醉方法以達到良好的麻醉效果是保證實驗安全性、數(shù)據(jù)可靠性的重要基礎。影響動物麻醉效果的因素主要包括麻醉劑的種類、濃度、劑量和給藥方式。一項針對烏拉坦、阿佛丁和水合氯醛對C57BL/6J小鼠的麻醉研究證明[19],使用烏拉坦則麻醉效果差、死亡率高,以合適劑量注射阿佛丁或水合氯醛(4%水合氯醛以0.20 mL/20 g)對C57BL/6J小鼠的麻醉時可以達到起效時間短、維持時間適中、死亡率低的效果。水合氯醛是在動物實驗中具有良好效果和安全性保證的一種麻醉藥[4],具有性價比高、麻醉誘導快、術后蘇醒快、死亡率低等優(yōu)點[20]。一項水合氯醛對C57BL/6J小鼠麻醉研究表明,選擇水合氯醛(2.5%水合氯醛以0.10 mL/10 g)腹腔注射麻醉C57BL/6J小鼠就可以誘導淺麻狀態(tài)[21]。MOG35-55誘導C57BL/6J小鼠皮下注射抗原油包水乳劑過程中誘導至淺麻狀態(tài)即可,因此,建議使用2.5%水合氯醛以0.10 mL/10 g腹腔注射進行麻醉。

2.2 皮下注射部位 建立EAE模型抗原油包水乳劑給予部位主要有后肢足掌、尾部和側腹皮下,其臨床病程、高峰期、最高臨床得分各不相同。C57BL/6J小鼠抗原給予部位均以側腹皮下為主,其中蛋白脂蛋白(PLP)+CFA+百日咳毒素(PT)制成的抗原誘導慢性病程,高峰期為23～25 d;以髓脂質堿性蛋白(MBP)聯(lián)合PLP+CFA+PT制成的抗原誘導也為慢性病程,高峰期為10～20 d;以MOG的抗原誘導為復發(fā)-緩解病程,高峰期為14～20 d[22-23]。由于抗原乳劑能夠誘導強烈的炎性反應,甚至導致局部皮膚的肉芽腫和壞死,MOG35-55誘導C57BL/6J小鼠注射抗原油包水乳劑建議在小鼠側腹皮下分四點皮下注射共計0.2 mL MOG35-55抗原乳劑。注射完抗原乳劑30 min后每只小鼠腹腔內(nèi)注射0.1 mL(400 ng)百日咳毒素溶液,48 h后每只小鼠再次腹腔內(nèi)注射1次0.1 mL(400 ng)溶液。

3 免疫后護理

動物的福利考慮周全,其中對動物的優(yōu)質護理能夠很大程度上減少應激因素在動物實驗中對實驗結果準確性、可靠性的干擾[5]。其中動物麻醉中采取適當?shù)乃『銣貕|保溫措施,可以顯著縮短麻醉周期和麻醉后恢復自主期的時間,減輕寒顫發(fā)生,增加動物舒適度,對輔助實驗動物安全順利蘇醒有著重要的作用[24]。

免疫后小鼠由于強烈的炎性反應產(chǎn)生眾多的免疫調(diào)節(jié)功能,小鼠出現(xiàn)激惹狀態(tài),建議減少單籠小鼠數(shù)量,并給予足量食物和水,否則弱小小鼠會被吃掉。免疫后3 d體質量緩慢下降,并伴有精神萎靡、皮毛不光滑、活動減少等特征,但是無運動功能障礙,隨后體質量有所恢復。免疫第11天左右,伴隨著出現(xiàn)體質量明顯下降,小鼠逐漸依次出現(xiàn)尾部遠端無力、尾麻痹、跛行、弓背、肢體癱瘓、瀕死貌等癥狀,此時部分小鼠可以自行進食、飲水,多數(shù)小鼠進食、飲水比較困難,必須注意單籠飼養(yǎng)、食料及飲水嘴邊放置、保溫等精心呵護,必要時進行人工灌胃4次/d以防止其營養(yǎng)缺乏、脫水及水電解質紊亂等引起死亡,造模后死亡幾乎全由免疫后護理不周全引起。

4 結語

綜上所述,EAE模型模擬人類MS或與人類MS極為相似的發(fā)病現(xiàn)象旨在有助于人們深入研究MS并探索合適的治療方法。MOG35-55誘導C57BL/6J小鼠EAE模型在病理學特點上與人類MS相似,在復發(fā)緩解型病程上可見脫髓鞘特征,組建MOG35-55誘導C57BL/6J小鼠EAE模型的規(guī)范化流程彌補實驗操作中的導致發(fā)病率不能達到100%和死亡率偏高的缺陷是進行MS研究和治療的根基,其他研究工作都要圍繞在均一性動物模型成功建立的基礎上展開。因此,加強免疫前準備工作、免疫操作和免疫后護理3個方面的研究,分析EAE模型成功建立的關鍵性問題,對于其后一系列研究的成功有著重要意義。

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(2017-03-17收稿 責任編輯：王明)

Key issues on establishment of the experimental autoimmune encephalomyelitis model in C57BL/6J mice

Wu Yanqing1, Guo Yuhong1,2,3，Liu Qingquan1,2,3

(1BeijingHospitalofTraditionalChineseMedicine,affiliatedwithCapitalMedicalUniversity,Beijing100010,China; 2BeijingHospitalofTraditionalChineseMedicineshunyibranch,Beijing101300,China; 3BeijingKeyLaboratoryofbasicresearchwithTraditionalChineseMedicineoninfectiousdiseases,Beijing100010,China)

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) model is an internationally recognized classic animal model of multiple sclerosis (MS) and is widely used in researches on the pathogenesis of MS and the evaluation of immunomodulator for MS. However, There are still many defects leading to morbidity less than 100% and high mortality. Therefore, in order to reach a high morbidity, a low mortality and a stable EAE model, the process of EAE model establishment was standardized and refined by improving the preparation, operation and nursing of the model immunization. In addition, the key issues to the successful establishment were analyzed and the solutions were provided according to the process of experiment operation.

Experimental autoimmune encephalomyelitis; Key issues; Preparation before immunization; Operation in immunization; Nursing after immunization

國家自然科學基金項目(編號:81403221)

吳彥青(1980.02—),男,醫(yī)學博士,博士后,副主任醫(yī)師,研究方向:中醫(yī)藥防治急危重癥的臨床與基礎研究,E-mail:wyqbs120@163.com

劉清泉(1965.11—)，男，大學本科，主任醫(yī)師/教授，首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)醫(yī)院院長，研究方向：中西醫(yī)結合診治危重病，E-mail:liuqingquan2003@126.com

R228

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10.3969/j.issn.1673-7202.2017.04.006