復(fù)方烏頭微乳皮膚刺激性和急性毒性實(shí)驗(yàn)研究

李玉奎 趙愛俠 趙 琳 馬振勇

(河南省商丘醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，商丘，476100)

實(shí)驗(yàn)研究

復(fù)方烏頭微乳皮膚刺激性和急性毒性實(shí)驗(yàn)研究

李玉奎 趙愛俠 趙 琳 馬振勇

(河南省商丘醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，商丘，476100)

目的：觀察復(fù)方烏頭微乳皮膚刺激和急性毒性實(shí)驗(yàn)，為臨床安全用藥提供依據(jù)。方法：單次刺激性試驗(yàn)選大鼠12只，完整皮膚和破損皮膚2組，采用同體左右側(cè)自身對比，實(shí)驗(yàn)前24 h將其背部對稱兩側(cè)用脫毛劑脫毛，將去毛部位分成4個區(qū)域，左側(cè)分為上下2個區(qū)域，右側(cè)分為上下個區(qū)域，在各大鼠身體左上側(cè)皮膚上涂微0.5 mL，右上側(cè)皮膚上涂空白微乳0.5 mL，其余部分不做處理，于涂藥6 h去除藥物，分別在1、24、48、72 h觀察皮膚刺激反應(yīng)及恢復(fù)情況，與對側(cè)比較。多次刺激性實(shí)驗(yàn)方法同上，給藥3次/d，每次0.5 mL，連續(xù)7 d，于末次給藥去除藥物后1周內(nèi)，觀察皮膚刺激反應(yīng)、急性毒性試驗(yàn)將SD大鼠隨機(jī)分為5組，即生理鹽水組，空白微乳組，高、中、低劑量治療組，每組15只，雌雄各半。各組大鼠背部脊柱兩側(cè)剃毛，面積約4 cm×3 cm，空白對照組涂生理鹽水0.9 mL/(只·d)，藥物對照組涂凡士林膏0.9 mL/(只·d)，低劑量組涂微0.9 mL/(只·d)，中劑量組涂微乳1.5 mL/(只·d)，高劑量組涂微乳2.5 mL/(只·d)，分3次給藥，間隔4 h，連續(xù)給藥14 d(間隔7 d脫毛1次)，分別在給藥前(D0)，給藥后第7天(D7)，給藥后第14天(D14)記錄動物體質(zhì)量，觀察動物外觀體征，行為活動，腺體分泌等，并檢測血常規(guī)及血液生化指標(biāo)。結(jié)果：皮膚刺激性實(shí)驗(yàn)無明顯變化，皮膚急性毒性試驗(yàn)主要血液學(xué)指標(biāo)、生化指標(biāo)與空白對照組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。高劑量組有兩只大鼠腹瀉，體質(zhì)量下降，其余大鼠大鼠外觀、行為體征、活動、精神狀態(tài)均無明顯異常；飲食、糞便及尿液正常；無大鼠死亡情況發(fā)生。結(jié)論：復(fù)方烏頭微乳外用對大鼠完整皮膚無刺激性，對破損皮膚有輕度刺激性，對大鼠皮膚無急性毒性。

復(fù)方烏頭微乳；動物；實(shí)驗(yàn)；透皮給藥；安全性

烏頭湯在臨床上經(jīng)常用來治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[1]等各種關(guān)節(jié)疼痛。復(fù)方烏頭微乳是將烏頭湯為基本方的我校附屬醫(yī)院的浸膏劑改成微乳制劑，我們通過皮膚刺激性和急性毒性實(shí)驗(yàn)，了解其中毒劑量，以更好地為臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 健康SD大鼠100只，體質(zhì)量200～250 g，雌雄各半，由河南省實(shí)驗(yàn)動物中心提供，動物合格證號：150617。每只分籠飼養(yǎng)，基礎(chǔ)飼料為實(shí)驗(yàn)鼠全價顆粒飼料，飲用水為已潔凈消毒的水，籠底墊料為已經(jīng)潔凈消毒的鋸末，更換1次/2 d。實(shí)驗(yàn)室溫度21～24 ℃，濕度55%～70%，光照12 h明暗周期。

1.1.2 藥物 復(fù)方烏頭微乳：生川烏30 g、生馬錢子20 g、紅花30 g、麻黃20 g、當(dāng)歸20 g、川芎20 g、黃芪20 g、甘草10 g、生白芍20 g。將以上中藥在60 ℃恒溫干燥3 h，以料液比為1∶5的75%乙醇浸泡12 h，重復(fù)3次，合并濾液，濾液60 ℃減壓濃縮至糖漿狀，殘?jiān)粤弦罕葹?∶4的60 ℃生理鹽水溶解、靜置、分層并過濾，得澄清淡黃色水溶液，該溶液60 ℃減壓濃縮。將以上濃縮的原料放入十六醇，單甘脂，吐溫-80 1.5%，白凡士林15%、甘油5%溶液中。在37 ℃水浴中渦旋混勻后，加入20倍的蒸餾水，于磁力攪拌下乳化，制成微乳。微乳中烏頭堿含量小于0.24 mg/mL。

空白微乳：微乳中不加入任何藥物成分。

1.1.3 試劑與儀器 Biofuge strutos型高速低溫離心機(jī)；(Kendro Laboratory Products)；JY92-2D型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝科器研究所)；YKH-I型液體快速混合器(江西醫(yī)療器械廠)；TU-180紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；PTHW型電熱套(鞏義市英峪予華儀器廠)；電熱恒溫水浴鍋(上海醫(yī)療器械股份有限公司一醫(yī)療器械五廠)；予華SHZ-D(1lI)循環(huán)水式真空泵(鞏義市英峪予華儀器廠)；CELL-DYN3700全自動五分類血球分析儀(日本光電)；75%的乙醇(商丘市永發(fā)酒廠)批號：20140908。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 選健康大鼠12只，體質(zhì)量200～250 g，雌雄各半，分為2組：完整皮膚組和皮膚破損組，每組6只。按照《中藥新藥研究指南》的要求，采用同體左右側(cè)自身對比，實(shí)驗(yàn)前24 h將其背部對稱兩側(cè)用脫毛劑脫毛，脫毛面積每側(cè)為3 cm×3 cm。實(shí)驗(yàn)前檢查去毛皮膚是否因去毛而劃破，如皮膚受傷，該大鼠不宜用作完好皮膚的刺激性實(shí)驗(yàn)。破損皮膚的制作方法：用75%乙醇皮膚清潔，消毒，暴漏完整皮膚，待乙醇揮發(fā)后，采用一次性無菌7號針頭將完整的皮膚消毒去劃“井”字破口，破損區(qū)域2 cm×2 cm，以刺傷表皮，不傷真皮，見有滲血為度。

1.2.2 給藥方法

1.2.2.1 單次給藥大鼠皮膚刺激實(shí)驗(yàn) 將去毛部位分成4個區(qū)域，左側(cè)分為上下2個區(qū)域，右側(cè)分為上下個區(qū)域，左側(cè)上半?yún)^(qū)涂抹復(fù)方烏頭微乳，左側(cè)下半?yún)^(qū)不做處理，右側(cè)上半?yún)^(qū)涂抹空白微乳，右側(cè)下半?yún)^(qū)不做處理。涂抹0.5 mL/次。于涂搽受試物46 h后，用溫水除去殘留受試物。然后在1、24、48、72 h觀察皮膚刺激反應(yīng)及恢復(fù)情況，與對側(cè)比較，并根據(jù)中藥、天然藥物刺激性和溶血性研究的技術(shù)指導(dǎo)原則[1](編號ZJGPT4-1)制定評分標(biāo)準(zhǔn)。

膚刺激反應(yīng)評分標(biāo)準(zhǔn)：紅斑勉強(qiáng)可見為1分，中度紅斑為2分，嚴(yán)重紅斑為3分，紫色紅斑并有焦痂形成為4分；水腫勉強(qiáng)可見為1分，皮膚隆起輪廓清楚為2分，隆起1 mm為3分，隆起1 mm以上并有擴(kuò)大為4分。皮膚剌激強(qiáng)度評價標(biāo)準(zhǔn)：0.5<分值<3.O為輕度刺激性，3.0<分值<6.0為中度刺激性，分值>6.0為強(qiáng)刺激性。

1.2.2.2 多次給藥對大鼠皮膚的刺激性實(shí)驗(yàn) 選健康大鼠12只，體質(zhì)量200～250 g，雌雄各半，實(shí)驗(yàn)方法同上，給藥3次/d，0.5 mL/次，連續(xù)應(yīng)用7 d，于末次給藥后1周內(nèi)，觀察皮膚刺激反應(yīng)，并按上述評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評價。

1.2.2.3 急性毒性實(shí)驗(yàn) 將75只大鼠體質(zhì)量200～250 g，隨機(jī)分為5組，即空白微乳照組，生理鹽水對照組，高劑量組、中劑量組、低劑量組每組15只，雌雄各半，各組大鼠背部脊柱兩側(cè)剃毛，面積約4 cm×3 cm。空白對照組涂生理鹽水0.9 mL/(只·d)，空白微乳對照組0.9 mL/(只·d)，低劑量組涂復(fù)方烏頭微乳0.9 mL/(只·d)，中劑量組涂抹復(fù)方烏頭微乳1.5 mL/(只·d)，高劑量組涂抹復(fù)方烏頭微2.5 mL/(只·d)，給藥，3次/d,連續(xù)給藥14 d(間隔7 d脫毛1次)，分別在給藥前(D0)，給藥后第7天(D7)，給藥后第14天(D14)記錄動物體質(zhì)量，觀察動物外觀體征，行為活動，腺體分泌，呼吸，飲食，排泄物等及其他中毒表現(xiàn)，若有動物死亡,則需要肉眼觀察和尸檢,必要時病理學(xué)檢查。并將實(shí)驗(yàn)組與對照組進(jìn)行比較。

1.2.3 檢測指標(biāo)與方法 第15天將所有豚鼠心臟取血(先用10%水合氯醛以800 mg/kg腹腔注射麻醉豚鼠，然后快速打開胸腔暴露心臟，持10 mL注射器經(jīng)左心室插入抽取5～8 mL，檢測各組大鼠血紅蛋白(Hgb)、紅細(xì)胞計數(shù)(RBC)、白細(xì)胞計數(shù)(WBC)及白細(xì)胞分類(包括中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞及嗜酸粒細(xì)胞)主要血液學(xué)指標(biāo).同時，收集血液，分離血清，檢測尿素氮(BUN)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)及血清總膽紅素(TBiL)等主要生化指標(biāo)。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)對大鼠皮膚的刺激性 單次給藥后1、8、12、24 h觀察皮膚刺激反應(yīng)，所有動物均未出現(xiàn)明顯紅斑、水腫等反應(yīng)；完整皮膚組和破損皮膚組均無刺激性反應(yīng)，空白微乳和復(fù)方烏頭微乳對皮膚均無刺激性。多次給藥后連續(xù)觀察1周，完整皮膚所有大鼠給藥側(cè)皮膚均未出現(xiàn)明顯紅斑、水腫及其他皮膚反應(yīng)。破損組大鼠的皮膚，復(fù)方烏頭微乳和空白微乳均有輕度的刺激性。但在連續(xù)給藥48 h后刺激性消失。

2.2 急性毒性實(shí)驗(yàn)對大鼠體質(zhì)量的影響 通過體質(zhì)量的檢測，各組分別與第7天和第14天進(jìn)行對比，各組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，高劑量組有兩只大鼠在用藥第10天出現(xiàn)腹瀉，體質(zhì)量下降，未給予任何治療，在第14天停藥后，腹瀉逐漸緩解。所有動物未見死亡。

2.3 急性毒性試驗(yàn)對大鼠血常規(guī)指標(biāo)的影響 實(shí)驗(yàn)14 d后，心臟取血，比較治療組與對照組大鼠血常規(guī)指標(biāo)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.4 急性毒性試驗(yàn)對大鼠血生化指標(biāo)的影響 見表3。

表1 急性毒性實(shí)驗(yàn)對大鼠體質(zhì)量的影響[n，(g)]

注：組間比較，P>0.05，無統(tǒng)計學(xué)意義。

表2 急性毒性試驗(yàn)對大鼠血常規(guī)指標(biāo)的影響±s)

注：組間比較，P>0.05，無統(tǒng)計學(xué)意義。

表3 急性毒性試驗(yàn)對大鼠血生化指標(biāo)的影響±s)

注：組間比較，P>0.05，無統(tǒng)計學(xué)意義。

3 討論

本方正是以《傷寒論》烏頭湯為基本方加減而成，具有溫經(jīng)溫經(jīng)散寒、祛風(fēng)除濕、舒筋活絡(luò)止痛的功效。烏頭湯在臨床上經(jīng)常用來治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[2-3]等各種關(guān)節(jié)疼痛的患者，現(xiàn)代研究也證明[4-6]：白芍總苷、馬錢子堿、烏頭堿，具有較強(qiáng)的鎮(zhèn)痛作用，而微乳制劑可以促進(jìn)白芍總苷等成分的頭皮吸收。從而能提高臨床療效。中藥外用的安全性已經(jīng)受到2 000余年的臨床驗(yàn)證，但隨著現(xiàn)代分離提取技術(shù)的出現(xiàn)，直接作用在病變部位的有效成分濃度相對提高[7-9]。尤其是微乳制劑，使皮膚的角質(zhì)層結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，促進(jìn)藥物的吸收。這些因素導(dǎo)致臨床外用制劑的不安全性。例如烏頭堿毒性極大，成人口服烏頭堿0.2 mg中毒，2～5 mg可以致死[10-13]。因口服的毒性限制了臨床廣泛的引用，為達(dá)到減毒增效的目的，透皮給藥是理想給藥方式。烏頭堿透皮給藥最小致死量為15.6 mg/kg。烏頭堿鎮(zhèn)痛作用強(qiáng)度隨著用藥量的增加而加強(qiáng)，當(dāng)用量達(dá)到18.75 mg/kg時，烏頭堿鎮(zhèn)痛作用達(dá)到平臺期[14-16]。因此，烏頭堿透皮給藥方式優(yōu)于內(nèi)服，但必須做相關(guān)的毒性實(shí)驗(yàn)，以便了解其毒性反應(yīng)，為臨床安全用藥提供指導(dǎo)。

我們通過復(fù)方烏頭微乳的皮膚刺激性實(shí)驗(yàn)和急性毒性實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了復(fù)方烏頭微乳對皮膚單次給藥和多次給藥，對完整皮膚均無刺激性。多次給藥后，復(fù)方烏頭微乳和空白微乳對破損皮膚均有輕度刺激性，但用藥后刺激性消失。這種輕度的刺激既可以是藥物中的活性成分，也可以是基質(zhì)本身。因復(fù)方烏頭微乳與空白微乳對破損皮膚刺激比較無差異，考慮到可能是基質(zhì)所致，因此進(jìn)一步選擇良好的基質(zhì)是我們努力的方向。通過急性毒性實(shí)驗(yàn)表明：除了高劑量組有2只大鼠出現(xiàn)腹瀉，體質(zhì)量下降，其余大鼠外觀、行為體征、活動、精神狀態(tài)均無明顯異常；飲食、糞便及尿液正常，無大鼠死亡情況發(fā)生。體質(zhì)量，血常規(guī)和血生化組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

類風(fēng)濕等關(guān)節(jié)炎患者因?yàn)殚L期服藥，出現(xiàn)許多并發(fā)癥，中藥外用雖有療效，但制劑往往落后，再加上中藥復(fù)方制劑的成分復(fù)雜，且容易發(fā)生水解、氧化、揮發(fā)等因素，通常不提取單一純品。提起的成分中有些是脂溶性，有些是水溶性的，故一時難以借用某些先進(jìn)的外用用新劑型[17-18]。然而微乳可以避免這些不利因素。微乳具有表面張力較低，易于濕潤皮膚，組織透過性好等優(yōu)點(diǎn)[19-21]。微乳本身具有良好的穩(wěn)定性，對于水溶性、脂溶性及難溶性藥物均有較好的溶解能力，既可以克服“首過效應(yīng)”促進(jìn)藥物吸收，又能提高生物利用度。其特定的納米尺度使微乳劑具有一定的緩釋和靶向作用[22-23]。微乳具有良好的透皮吸收能力，主要是通過其作用于角質(zhì)層而促進(jìn)藥物透皮吸收。另外，微乳也可通過提高藥物溶解度、作用于皮膚附屬器來促進(jìn)藥物透皮吸收。

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(2016-09-29收稿 責(zé)任編輯：洪志強(qiáng))

Experimental Study on Acute Toxicity and Irritation of Compound Aconite Microemulsion Skin

Li Yukui, Zhao Aixia, Zhao Lin, Ma Zhenyong

(ShangqiuMedicalCollege，Henan，Shangqiu476100,China)

Objective:To observe the effect of compound aconite microemulsion skin irritation and acute toxicity test，to provide the basis for clinical drug safety.Methods:Single stimulation test selected 12 rats with intact skin and damaged skin of two groups，the same side of 24 h，before the experiment will be on both sides of the back symmetrical with depilatory.The hair part is divided into 4 parts，the left side is divided into 2 regions，the right side is divided into upper and lower regions，in the rat body left on the skin with micro 0.5 mL，right side of the skin with the rest of the blank microemulsion 0.5 mL，without treatment，to remove drug applicator for 6 hours，respectively 1、24、48、72 h observation of skin irritation reaction and recovery，compared to the contralateral side; multiple stimulation experiment method ibid，administered 3 times daily，0.5 mL each time，for 7 d，at the end of the administration after drug removal within a week，view Observation of skin irritation; acute toxicity test：SD rats were randomly divided into 5 groups：normal saline group，blank microemulsion group，high，medium and low dose group，15 rats in each group，half male and half female.The rats back on both sides of the spine to shave，an area of about 4 cm×3 cm，the blank control group with saline 0.9 mL/(d only)，the drug control group with Vaseline ointment(only 0.9 mL/D)，low dose group with micro 0.9 mL/(only D)，middle dose group(1.5 mL/TU microemulsion-only D)，high dose group with 2.5 mL/microemulsion(only D)，divided into 3 doses.The interval of 4 hours，continuous administration of 14 days(7 days apart，a hair removal)before administration(D0)，seventh days after administration(D7)，after administration of l the 4 day(D14)records of animal weight，observe the appearance of animal signs，behavior，glandular secretion，and detection of blood and blood biochemical index.Results:Skin irritation test showed no obvious change index，biochemical index compared with the control group there were no significant differences in skin acute toxicity test of majorhematologic(P>0.05)high there are two dose group diarrhea rats，weight loss，appearance，the rest rats behavioral signs，activities and mental status were not significantly abnormal; diet，feces and urine of normal rats; no occurrence of death.Conclusion:Compound aconite microemulsion had no irritation to the rats with intact skin，mild irritation to skin damage，no acute toxicity on the skin of rats.

Compound aconite microemulsion; Animal; Experiment; Transdermal drug delivery; Safety

河南省教育廳科研課題(編號：15B360009)

李玉奎(1981.01—)，男，碩士研究生，講師，主治醫(yī)師，研究方向：復(fù)方中藥微乳在骨關(guān)節(jié)中的應(yīng)用研究，E-mail：1403905489@qq.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.04.039