二仙湯含藥血清對順鉑干預的大鼠卵巢顆粒細胞凋亡調控蛋白bcl-2、bax表達的影響

楊 蕾 王繼峰 牛建昭 趙丕文 孫麗萍 陶仕英 武洪波 蔡欣悅 齊明月

(北京中醫藥大學，北京，100029)

二仙湯含藥血清對順鉑干預的大鼠卵巢顆粒細胞凋亡調控蛋白bcl-2、bax表達的影響

楊 蕾 王繼峰 牛建昭 趙丕文 孫麗萍 陶仕英 武洪波 蔡欣悅 齊明月

(北京中醫藥大學，北京，100029)

目的：觀察二仙湯含藥血清對順鉑干預的大鼠卵巢顆粒細胞凋亡調控蛋白bcl-2、bax表達的影響，從細胞凋亡的角度探討二仙湯含藥血清對卵巢顆粒細胞凋亡的作用機制。方法：22～24 d的SD雌性大鼠30只，隨機分為3組，分別為生理鹽水組，補佳樂組，二仙湯組。每組大鼠10只。給藥4 d后處死大鼠，心臟取血，制備藥物血清。22～24 d的SD大鼠卵巢顆粒細胞，經培養貼壁后，用順鉑損傷大鼠原代卵巢顆粒細胞。經各組藥理血清作用后，應用放免法，進行雌激素和孕激素水平測定及分析。應用免疫組化法，測定各分組bcl-2、bax蛋白的表達情況，并進行圖像分析。結果：放免結果顯示，與正常組相比，模型組和補佳樂組E2表達明顯改變，有統計學意義(P<0.05)。與模型組相比，補佳樂組、二仙湯組E2表達均有增加；與正常組相比，模型組P表達水平有所變化，有統計學意義(P<0.05)。與模型組相比，二仙湯組P表達略高于補佳樂組，但低于正常組。免疫組化結果顯示，在卵巢顆粒細胞細胞質上可見bcl-2和bax蛋白表達的棕黃色顆粒。和正常組相比較，順鉑干預后各組bcl-2表達均減弱，而以模型組最明顯，有統計學意義(P<0.05)；和模型組比較，各藥物組均可見bcl-2陽性表達增加，但弱于正常組，有統計學意義(P<0.05)。bax與bcl-2表達強度結果相反，和正常組比較，順鉑干預后的各組bax均表達增強，模型組呈現極強表達現象，有統計學意義(P<0.05)；和模型組比較，各藥物組均可見陽性表達減弱，但表達高于正常組，有統計學意義(P<0.05)。結論:二仙湯能降低經順鉑干預后大鼠bax蛋白在卵泡顆粒細胞表達，增強bcl-2蛋白的表達，二仙湯能夠通過調節凋亡蛋白bcl-2、bax蛋白的表達，抑制卵巢顆粒細胞發生凋亡，從而保護卵巢功能。

二仙湯；順鉑；顆粒細胞；細胞凋亡

卵巢顆粒細胞對育齡期女性的生殖功能起著重要的作用。正常卵泡生長、發育以及排卵均需要顆粒細胞的正常的增殖和功能表達[1]。順鉑作為抗癌藥物，在臨床治療腫瘤的同時也具有細胞毒性作用。它可以破壞正常的卵巢顆粒細胞，使其發生凋亡，甚至形成卵巢早衰[2]。而傳統醫學認為卵巢功能發生異常主要是腎氣虧虛，精血不足所致，治當以填精益髓，調理陰陽，補益天癸。二仙湯是張伯訥教授研制出來的以補腎為主的方劑。在臨床治療卵巢功能異常中具有明顯的療效。

本實驗觀察二仙湯含藥血清對順鉑干預的大鼠卵巢顆粒細胞凋亡調控蛋白bcl-2、bax表達的影響，旨在從細胞凋亡的角度探討二仙湯含藥血清對卵巢顆粒細胞凋亡的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 22～24 d健康雌性SD大鼠，共40只，體質量(60±10)g。購于斯貝福(北京)實驗動物科技有限公司。使用許可證：SCXK(京)2011-0004。

1.1.2 藥物 二仙湯由淫羊藿、仙茅、巴戟天、當歸、黃柏和知母組成。按照《婦科臨床方劑學》規定的劑量比(9∶6∶10∶15∶12∶10)稱取，由北京中醫藥大學東直門醫院提供,根據東直門院提供的中藥顆粒與中藥飲片的固有比例進行計算，最終按照人用藥劑量計算大鼠用藥劑量為7.5 mg/(kg·d)。注射用順鉑(CDDP)，每支10 mg，由齊魯制藥有限公司生產。補佳樂(雌激素)購自東直門醫院，規格：1 mg/片，由拜耳醫藥有～限公司生產。用法與劑量：成人每日1 mg，折算成大鼠所需劑量即0.009 mg/kg。

1.1.3 試劑 免疫組化試劑：1)Bax(Rabbit polyclonal IgG)、Bcl-2(Rabbit polyclonal IgG)購于北京歐北科技有限公司。2)DAB顯色劑、二抗SP-9000,(羊抗兔)購于北京中山金橋生物技術有限公司。

放免試劑：1)血清孕酮放免測定盒P(HY-031)RIAKIT、血清雌二醇放免測定盒E2-17β(HY-10029)RIAKIT均購于北京華英生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 制備卵巢顆粒細胞 22～24 d雌性SD大鼠10只，體質量35 g，飼養在23～25 ℃，光照12 h，食水隨意，適應性喂養1 d，注射PMSG 50IU/只，48 h后，在無菌條件下取出雙側卵巢顆粒細胞進行培養。具體操作如下：1)取SD大鼠，10%水合氯醛麻醉后，經脫臼處死，浸泡75%乙醇中消毒3 min。2)消毒后放入已消毒托盤中在超凈臺中取雙側卵巢，放入預冷的Hank′s液2.7 mL。3)用Hank′s液清洗3次，將其中的脂肪、包膜等清理干凈。4)將卵巢移入無血清培養基中，用1 mL一次性注射器刺破卵巢，5 min/只，使顆粒細胞充分釋放。5)加入0.3 mL 2.5%胰酶反復用吸管吹打懸液數次，使顆粒細胞團塊分離。37 ℃消化10 min(每3 min，震蕩或吹打一次)。6)加入1 mL含血清培養液終止胰酶消化，并靜置10 min。取懸液加入15 mL離心管中。7)1 000 r/min離心10 min，棄上清。加入生理鹽水5 mL沖散細胞再次離心。8)棄上清，加入10%胎牛血清0.2 mL，吹打均勻。9)計數：應用血球小板計數，調整懸液濃度，以5×105接種于96孔板中。在37 ℃，5%CO2培養箱中培養。觀察貼壁情況，待細胞長滿瓶底至75%～80%融合時，用于實驗。

1.2.2 制備藥理血清組 22～24 d的雌性SD大鼠50只，體質量35～40 g，飼養在23～25 ℃，光照12 h，食水隨意，適應性喂養1 d，第2天取藥理血清。具體操作如下。藥理血清動物分3組：1)正常組：灌胃蒸餾水0.4 mL/d。2)補佳樂組：灌胃補佳樂0.5 mL/d。3)二仙湯組：灌胃二仙湯0.4 mL/d，各組連續灌胃3 d，于第4天晨起七點灌胃，2 h以后，心臟取血并分離血清，-20 ℃保存。

1.2.3 順鉑干預卵巢顆粒細胞 待細胞生長至底壁的75%～80%時，將模型組、補佳樂組、二仙湯組的培養基吸出，每孔加入CDDP(濃度為2.5 μg/mL)200 μL，放入37 ℃，5%CO2的培養箱中培養12 h。

1.2.4 藥理血清處理 于CDDP作用12 h后，進行給藥處理，每孔加入相應的藥理血清組200 μL，放入37 ℃，5%CO2的培養箱中培養24 h，進行指標測定。

1.2.5 卵巢顆粒細胞bcl-2、bax免疫組化染色步驟 免疫組化染色采用SABC法,其中bcl-2、bax的一抗濃度均為1∶200。1)96孔板每孔滴加20 μL 4%多聚甲醛固定20 min。2)1*PBS清洗標本3次，2 min/次。3)每孔滴加20 μL 0.5%tritox-100，搖勻，孵育20 min。4)1*PBS清洗標本3次，2 min/次。5)3%H2O2去離子水孵育7 min。6)1*PBS清洗標本3次，3 min/次。7)滴加試劑A(封閉用正常山羊血清工作液)室溫孵育12 min，傾去，勿洗。8)滴加一抗，37 ℃孵育3 h。9)1*PBS清洗標本3次，3 min/次。10)滴加試劑B(生物素化二抗工作液IgG/Bio)，室溫孵育12 min。11)1*PBS清洗標本3次，3 min/次。12)滴加試劑C(辣根酶標記鏈霉卵白素工作液S-A/HRP)，室溫孵育12 min。13)1*PBS清洗標本3次，3 min/次。14)DAB顯色劑顯色。15)自來水沖洗，顯微鏡觀察。

每孔隨機選取6個視野，統一放大倍數為200倍，利用免疫組化軟件包對卵巢顆粒細胞進行灰度測量分析，并測算視野內陽性目標總面積，并與視野面積相比得到陽性反應顆粒的灰度值。

1.2.6 放免法對E2及P的測定 取標本100 μL、標準品100 μL，加E2及P抗體100 μL，加E2及P標記物100 μL，37 ℃2 h，加二抗分離劑1 mL，室溫15 min，3 500 r/min離心15 min。去上清，測沉淀CPM。自動放免分析儀出結果。

2 結果

2.1 各組大鼠雌二醇及孕激素實驗分析結果 與正常組相比，模型組和補佳樂組E2表達明顯改變，有統計學意義(P<0.05)。與模型組相比，補佳樂組E2表達明顯增加，而二仙湯組無統計學意義，但可看出與模型組相比較二仙湯組表達明顯增加，見圖1；與正常組相比，模型組P表達水平有所變化，有統計學意義(P<0.05)，可見模型組P表達明顯減少，見圖2。與模型組相比，補佳樂組、二仙湯組均有所變化，有統計學意義(P<0.05)，其中二仙湯組P表達略高于補佳樂組。可看出二仙湯含藥血清能促進順鉑干預后的卵巢顆粒細胞E2和P的合成與分泌能力。見表1。

表1 各組大鼠卵巢顆粒細胞中E2、P的表達情況

注：與正常對照組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

圖1 各組大鼠卵巢顆粒細胞中E2分泌柱狀圖

圖2 各組大鼠卵巢顆粒細胞中P分泌柱狀圖

2.2 卵巢顆粒細胞中bcl-2、bax蛋白表達比較 免疫組化結果顯示：各組bcl-2棕黃色陽性表達位于胞質內，其中正常組表達最多，呈深棕色；模型組bcl-2陽性細胞表達明顯減少，呈淡棕色。補佳樂組、二仙湯組陽性細胞著色增強，而二仙湯組陽性表達最為明顯，但少于正常組。見圖3。而bax蛋白表達呈現相反的趨勢，各組bax在細胞質內均有表達，可見棕黃色陽性物質位于胞質內，正常組bax陽性細胞染色較淺，呈棕色或淺棕色，表達較少。模型組陽性細胞著色較深，呈深棕色，表達較多。補佳樂組、二仙湯組和模型組相比，陽性表達細胞著色變淺，但不及正常組。見圖4。

圖3 檢測各組大鼠卵巢顆粒細胞中bcl-2蛋白的表達情況(免疫組化×200)

注：正常組：陽性顆粒表達多，染色呈深棕色；模型組：陽性顆粒表達明顯減少，呈現淡棕色；補佳樂組：陽性表達較模型組明顯增多但不及正常組，呈現淺棕色；二仙湯組：陽性表達比補佳樂組表達多但不及正常組，呈現淺棕色偶有深棕色。

圖4 檢測各組大鼠卵巢顆粒細胞中bax蛋白的表達情況(免疫組化×200)

注：正常組：陽性顆粒表達少，染色呈淺棕色；模型組：陽性顆粒表達明顯增多，呈現深棕色；補佳樂組：陽性表達較模型組明顯減少但不及正常組，呈現淺棕色；二仙湯組：陽性表達比補佳樂組表達少但不及正常組，呈現淺棕色。

2.3 各組卵巢顆粒細bcl-2、bax表達的比較 免疫組化實驗結果：和正常組相比較，順鉑干預后各組bcl-2表達均減弱，而以模型組最明顯，有統計學意義(P<0.05)；和模型組比較，各藥物組均可見bcl-2陽性表達增加，但弱于正常組，其中二仙湯組陽性表達要高于補佳樂組，有統計學意義(P<0.05)(見表2)。bax與bcl-2表達強度結果相反，和正常組比較，順鉑干預后的各組bax均表達增強，模型組呈現極強表達現象，有統計學意義(P<0.05)；和模型組比較，各治療組均可見陽性表達減弱，但表達高于正常組，其中二仙湯組陽性表達略低于補佳樂組，有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠卵巢細胞中bcl-2、bax蛋白免疫組化圖像分析結果±s，n=6)

注：與正常對照組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3 討論

細胞凋亡是一個受嚴格調控的能量依賴性的自殺程序，它引發細胞內一系列信號級聯式放大反應，最終導致細胞死亡。細胞凋亡是通過2個信號轉導途徑實現：一種是內在途徑另一種是外在途徑[3]。近年來研究表明，bcl-2蛋白廣泛的存在于線粒體膜、內質網膜以及外核膜上，但其主要存在于線粒體外膜，bcl-2蛋白能夠促進顆粒細胞的分裂，可以抑制凋亡，近而使卵泡閉鎖率降低也就是說bcl-2蛋白表達缺失，會導致卵巢組織中有效卵泡減少，嚴重者會出現無卵母細胞的卵泡[4]而bax蛋白約21%與bcl-2同源且有拮抗作用。高表達bax蛋白是卵子細胞死亡的關鍵因素，同時，bax的基因產物能加速細胞凋亡[5]。bcl-2與Bax,組成一個平衡體系，bax過度表達可以加速細胞凋亡，而bcl-2過度表達則使細胞凋亡得到抑制。免疫組化結果提示：bcl-2和bax蛋白表達與卵巢顆粒細胞凋亡密切相關，而細胞凋亡則是通過促進或抑制參與細胞凋亡的相關基因蛋白的表達情況來實現的[6]。實驗結果表明二仙湯可增加bcl-2蛋白的表達進而抑制顆粒細胞的凋亡。同時，二仙湯也可以降低bax蛋白的表達進而減緩顆粒細胞的凋亡。

雌二醇(Estradiol,E2)是女性激素中生物活性最強的一種甾體類化合物，主要由卵巢合成和分泌，少量由腎上腺分泌。雌二醇濃度是檢查下視丘—垂體—生殖腺軸功能的指標之一[7]。孕酮(Progesterone,P)是一種重要性激素，不僅在月經周期的調節中起重要作用，也是維持妊娠所必須的重要激素之一，P由卵巢分泌，在卵巢內主要是由黃體產生，因此，臨床上測定血清孕酮的含量，對于婦女卵巢排卵功能也有著重要的意義。本實驗所反映出來的激素水平，可能預示著正常卵泡由正常到功能衰竭之間的一個過渡階段。E2的升高可作為早期卵巢功能不全或障礙的重要指標，可估計卵泡池中所剩卵泡的數量。本次實驗表明，二仙湯能夠升高P、E2水平，進而改善卵巢功能。

二仙湯對順鉑損傷的卵巢顆粒細胞具有較好的療效。以往研究表明，二仙湯可以作用于垂體，改善GTH細胞的結構促性腺激素的合成和分泌，有效的治療絕經后高血壓。可以調節自身性腺分泌，使性激素增加，臨床治療月經不調。也可以延緩老年大鼠弓狀核退化，用于治療女性更年期綜合征[8-11]。本次實驗研究表明，二仙湯通過調節血清中激素含量，能降低順鉑干預后大鼠卵巢顆粒細胞中bax蛋白在卵泡顆粒細胞表達，增強bcl-2蛋白的表達，二仙湯可抑制卵巢顆粒細胞凋亡，降低順鉑對卵巢顆粒細胞的損害，從而促進卵泡發育，改善卵巢功能。

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(2016-06-28收稿 責任編輯：白樺)

Effects of Erxian Decoction Serum on Regulating Expression of Protein bcl-2 and bax in Rat Ovarian Granulosa Cells Apoptosis Induced by Cisplatin

Yang Lei,Wang Jifeng,Niu Jianzhao,Zhao Piwen,Sun Liping,Tao Shiying,Wu Hongbo,Cai Xinyue,Qi Mingyue

(BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China)

Objective:To observe the effect of serum containing Erxian decoction on regulating the expression of bcl-2and bax protein from rats′ ovarian granulosa cells induced by cisplatin and to investigate the mechanism of Erxian Decoction serum on apoptosis of ovarian granulosa cells from the perspective of apoptosise. Methods:Thirty SD female rats for 22 to 24 days birth were randomly divided into three groups：the normal saline group,progynova group and the Erxian Decoction group with 10 rats in each group. After 4-day drug administration,rat hearts were taken to prepare drug serum. Ovarian granulosa cells were taken from SD rats and cultured to acquire adherent cells. Then,primary ovarian granulosa cells in rats were induced by cisplatin. After pharmacological action to serum,radio immunity method was used to detect estrogen and progestin and make analysis. Immunohistochemistry was applied to detect the expression of bcl-2 and bax protein in each group and then for image analysis. Results:Test results showed that E2 expression significantly changed in the model group and progynova group (P<0.05) with statistically significant difference,compared with the normal group. Compared with the model group,the expression of E2 increased significantly in the progynova group and the Erxian Decoction group. Compared with the normal group,P expression in the model group was somewhat changed (P<0.05),which showing statistically significant difference. Compared with the model group,P expression in Erxian Decoction group was slightly higher than that of the progynova group,but lower than that of the normal group. Immunohistochemistry results showed that brown granules of bcl-2 and bax protein were expressed in the cytoplasm of ovarian granulosa cells. Compared with the normal group,the expression of bcl-2 in each group under the intervention of cisplatin was decreased,and the model group was the most obvious (P<0.05).Compared with model group,the positive expression of bcl-2 in each drug group was increased,but it was weaker than that in the normal group (P<0.05). The intensity of bax and bcl-2′s expression was opposite. Compared with the normal group,Bax expression in each group under the intervention of cisplatin were enhanced and that in the model group especially showed a strong expression (P<0.05). Compared with the model group,the positive expression of the drug groups was decreased,but was higher than that of the normal group (P<0.05) with statistically significant difference. Conclusion:Erxian Decoction can decrease the expression of Bax protein in follicular granulosa cells induced by cisplatin injury and increase the expression of bcl-2 protein. It can inhibit the apoptosis of ovarian granulosa cells and protect the ovarian function by adjusting the expression of bcl-2 and bax.

Erxian Decoction; Cisplatin; Granulosa cells; Apoptosis

教育部國家外專局創新引智基地項目(編號：B07007)；國家自然科學基金項目(編號：81273887；30772849)

楊蕾(1990.02—)，女，在讀研究生，研究方向：中醫藥防治女性生殖內分泌疾病基礎研究，E-mail：1171935855@qq.com

陶仕英(1970.09—)，女，副教授，研究方向：中醫藥防治女性生殖內分泌疾病基礎研究，Tel：(010)64287538,E-mail：taoshiying1970@163.com

R-332；R271.9

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.04.040