清胰Ⅱ號顆粒劑對急性重癥胰腺炎大鼠胰腺損傷的保護作用

肖青川 蘭天罡 兌丹華

(1 武警四川總隊醫院肝膽一外科，樂山，614000； 2 遵義醫學院附屬醫院肝膽胰外科，遵義，563003)

清胰Ⅱ號顆粒劑對急性重癥胰腺炎大鼠胰腺損傷的保護作用

肖青川1蘭天罡2兌丹華2

(1 武警四川總隊醫院肝膽一外科，樂山，614000； 2 遵義醫學院附屬醫院肝膽胰外科，遵義，563003)

目的：觀察清胰Ⅱ號顆粒劑對重癥急性胰腺炎(Severe Acute Pancreatitis，SAP)大鼠胰腺損傷的保護作用并探討其機制。方法：將18只SD大鼠隨機等分為假手術組(A組)、SAP組(B組)、治療組(C組)。以30 g/L牛磺膽酸鈉逆行注入胰膽管制作大鼠SAP模型。C組以250 g/L清胰Ⅱ號顆粒劑灌胃給藥(10 mL/kg)，1次/6 h，A組、B組用同等劑量生理鹽水以相同方式灌胃。制模后24 h取材，用real-time PCR檢測胰腺組織中Hmgb1 mRNA表達，ELISA測定胰腺組織中一氧化氮和內皮素-1濃度，同時觀察胰腺組織病理改變，測定胰腺組織濕/干重比值。結果：B組有胰腺組織損傷改變，Hmgb1 mRNA的表達上調，一氧化氮和內皮素-1濃度升高；清胰Ⅱ號顆粒劑可下調胰腺組織中Hmgb1mRNA的表達，降低一氧化氮及內皮素-1濃度，減輕胰腺病理損害程度。結論：Hmgb1、一氧化氮及內皮素-1在SAP胰腺損傷中可能具有重要作用，清胰Ⅱ號顆粒劑可能通過下調胰腺組織中Hmgb1 mRNA的表達，降低一氧化氮和內皮素-1濃度，減輕胰腺組織的病理改變，從而保護胰腺損傷。

高遷徙率族蛋白-1；內皮素-1；一氧化氮；重癥急性胰腺炎；大鼠

重癥急性胰腺炎(Severe Acute Pancreatitis，SAP)發生時，首要出現的是胰腺自身的病理生理變化，包括胰腺的充血、水腫、出血及壞死，內外分泌功能的紊亂等，胰腺損傷是發生這些變化的基礎。普遍認為SAP胰腺損傷發生機制是胰腺微循環障礙[1]。而多種炎性反應遞質、細胞因子在胰腺微循環障礙中起重要作用。本實驗通過觀測清胰Ⅱ號顆粒劑干預措施下，SAP大鼠胰腺組織病理學變化、內皮素-1(endothelin-1，ET-1)、一氧化氮(nitric oxide，NO)濃度變化及胰腺組織中高遷徙率族蛋白-1(high mobility group box 1，Hmgb1)mRNA表達改變，探討清胰Ⅱ號顆粒劑對SAP大鼠胰腺損傷是否有保護作用，及其可能的作用機制，以便為該藥的開發應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 清潔級SD大鼠18只，購自第三軍醫大學野戰外科研究所動物室(動物質量合格證號SCXK-(軍)2012008)，體質量150～200 g，雌雄不拘。

1.1.2 藥物 牛磺膽酸鈉(美國Sigma公司)。清胰Ⅱ號顆粒劑(遵義醫學院附屬醫院研制)。

1.1.3 試劑與儀器 大鼠ET-1、NO定量ELISA試劑盒(上海西唐生物科技有限公司)。反轉錄反應試劑、RNAiso Reagent、PCR反應試劑(大連寶生物工程有限公司)，熒光定量PCR儀器(iCycler iQ，Bio-rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 采用隨機數字表法，將18只大鼠等分為假手術組(A組)、SAP組(B組)、治療組(C組)。參照文獻[2]的方法復制SAP模型：100 g/L水合氯醛注射腹腔麻醉大鼠，上腹正中切口進腹。

1.2.2 給藥方法 A組進腹后僅翻動腸管即關腹；其余2組大鼠開腹后提起十二指腸，用血管夾分別夾住肝門部胰膽管和十二指腸端，向胰膽管內逆行緩慢注入30 g/L牛磺膽酸鈉溶液2 mL/kg，時間1 min，后保持2 min再關腹。制模后1 h每組大鼠灌胃：A、B組喂飼生理鹽水10 mL/kg，C組喂飼等量250 g/L清胰Ⅱ號顆粒劑。其后，重復灌胃1次/6 h。24 h后處死大鼠，取材檢測各相關指標。

1.2.3 檢測指標與方法 胰腺組織形態學觀察和濕/干重比值測定：處死大鼠后，取胰腺組織做常規HE染色。采用盲法，由專人在光學顯微鏡鏡下觀察胰腺組織病理改變，并進行病理評分[3]。用吸水紙吸干新鮮胰腺組織水分，電子天平稱量濕重。再置于干燥箱中，60 ℃干燥72 h，稱量干重，計算濕/干重比值。胰腺組織中Hmgb1基因mRNA表達水平測定和相對定量分析：以real-time PCR法檢測胰腺組織內Hmgb1及β-actin的mRNA表達水平[1]。以β-actin作為內參，引物上游序列：5′-TGACAGGATGCAGAAGGAGA-3′，下游序列：5′-TAGAGCCACCAATCCACACA-3′，產物長度104 bp(大連寶生物合成)。Hmgb1基因引物，上游序列：5′-TGGGAAACTGGAGCAAAACC-3′，下游序列：5′-ACCACAAGACACCCCTCACC-3′，產物長度123 bp。反應條件：預變性：95 ℃，10 sec，1個循環。PCR反應：95 ℃，5 sec，60.2 ℃(內參基因為61.6 ℃)，20 sec，40個循環。熔解曲線分析：55 ℃開始采集信號，60次。用Bio-rad公司提供的基因表達分析軟件Genex.xls進行相對定量分析、處理數據。胰腺組織中ET-1和NO濃度的測定：取每組相同質量的胰腺組織進行勻漿，離心分離后取上清，-20 ℃保存。各樣品中ET-1和NO的含量，依照大鼠ET-1、NO定量ELISA試劑盒中提供的方法分別進行檢測。

1.3 統計學方法 采用SPSS 19.0軟件進行統計學分析。對數據進行正態性、方差齊性檢驗。符合正態分布且方差齊同，進行方差分析。差異有統計學意義，進而行兩兩比較的q檢驗。資料呈偏態分布或方差不齊，進行秩和檢驗，將數據經秩轉換后，作兩兩比較的q檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 胰腺組織形態學觀察和病理學評分比較 光學電子顯微鏡下胰腺組織形態學觀察：A組胰腺組織偶見炎性細胞浸潤，無明顯水腫、出血、壞死，腺泡結構完整。制模后的B組胰腺組織可見大量炎性細胞浸潤，間質水腫、結構破壞，組織大片出血、壞死，腺泡腫脹。而清胰Ⅱ號顆粒劑干預后的C組胰腺組織炎性細胞浸潤，間質水腫、出血、壞死及腺泡的破壞程度均較B組減輕。量化后的B組胰腺組織病理學評分高于A組(P<0.01)，C組胰腺病理學評分小于B組(P<0.05)。見表1。

2.2 胰腺組織濕/干重比值比較 3組中，B組胰腺組織濕/干重比值明顯高于A組(4.84±0.23 VS 3.37±0.22，P<0.01)。而C組胰腺組織濕/干重比值明顯低于B組(4.39±0.29 VS 4.84±0.23，P<0.01)。

2.3 其他各項指標檢測 與A組比較，B組胰腺組織中Hmgb1 mRNA相對表達量顯著上調(P<0.01)，ET-1、NO濃度均顯著升高(均P<0.01)。與B組比較，C組胰腺組織中Hmgb1 mRNA相對表達量明顯下調(P<0.01)，且ET-1、NO濃度均明顯降低(均P<0.01)。見表1。

表1 各組胰腺組織病理學評分、NO及ET-1濃度、Hmgb1 mRNA相對表達量比較

注：**P<0.01 vs A組；△△P<0.01 vs B組；▲P<0.05 vs B組。

3 討論

既往實驗研究表明，在SAP的發生、發展過程中，由于胰腺組織微循環障礙進而導致的胰腺組織缺血損傷是一個重要因素[4]。SAP時，引發胰腺損傷的涉及因素眾多，而胰腺組織局部體液因素的調節作用尤其重要。ET-1和NO是內皮細胞分泌的2種重要的血管活性物質。NO由L-精氨酸和分子氧在NO合酶的催化下生成。作為一種內源性血管舒張劑、炎性反應遞質、血小板聚集抑制因子和神經遞質，NO最主要的生物學功能是傳遞信息、舒張血管和細胞毒作用。有研究顯示，NO可能主要通過擴張血管、提高胰腺血流量、改善胰腺微循環，以減輕SAP時胰腺的亞細胞器損害，特別是減輕對線粒體和溶酶體的氧化損傷[5]。同時，NO可以對抗異位胰蛋白酶原的激活，抑制胰腺內胰蛋白酶和血清脂肪酶活性，進而實現對胰腺的保護作用[6]。關于NO在SAP發病中的作用也有不同的認識。Hossam等[7]以蛙皮素誘發大鼠水腫型急性胰腺炎，觀察到用L-NNA阻斷內源性NO后，胰腺組織水腫減輕，同時代表血管通透性的Evans blue漏出減少，而NO底物L-精氨酸能逆轉L-NNA的作用，因此，NO導致胰腺損傷的機制是增加了蛋白的滲出和血管通透性。在本實驗中，我們發現，復制大鼠SAP模型后，胰腺組織中NO含量明顯增高，反映胰腺組織損傷的病理學指標如濕干重比值、病理學評分明顯改變，胰腺損傷明顯，表明高濃度的NO可能介導了SAP時的胰腺損傷。ET-1是迄今發現的最強的長效縮血管物質。研究發現對ET-1反應最明顯的血管是微動脈分枝部，ET-1可使其收縮甚至使血管腔完全閉塞，ET-1的血管選擇性作用對調節微循環血流量具有重要意義[8]。還有動物研究顯示，靜脈注射ET-1可使胰腺血流量明顯下降，而胰腺血流量明顯增加則出現在給予選擇性ET-1受體拮抗劑后，表明在胰腺組織缺血缺氧的損傷過程中ET-1發揮了重要作用[9]。目前認為，急性胰腺炎時，ET-1引發胰腺損傷的主要機制是：血管內皮細胞產生的ET-1使胰腺小動脈痙攣，胰腺供血不足，胰腺組織缺血，而缺血又可導致產生更多ET-1，從而形成急性胰腺炎性反應細胞因子ET-1正反饋的病理生理過程，這一惡性循環的直接后果就是加重胰腺組織的損傷[10]。在我們的研究中，也觀察到，誘導大鼠產生SAP后，胰腺組織中ET-1的含量顯著增加，胰腺損傷明顯。而給予清胰Ⅱ號顆粒劑干預后，出現相反的變化。

急性胰腺炎時，一定濃度的ET-1可刺激NO產生增加。合適水平的NO通過對抗ET-1縮血管作用，改善胰腺微循環，減輕白細胞-內皮的相互作用等，對胰腺損傷有保護作用。而過多釋放的NO不但對胰腺損傷無保護作用，反而會介導胰腺組織損傷的發生和發展：一是高水平的NO可引起血管過度擴張，血液瘀滯，組織氧利用減少，直接導致胰腺損傷發生；二是NO還有自由基性質的細胞毒性作用，促使胰腺組織損傷加重。

Hmgb1是一類廣泛存在于真核細胞內的非組蛋白，在人體分布十分廣泛。可在單核巨噬細胞、中性粒細胞、血小板、肝細胞等細胞核和細胞質中表達。在炎性反應發生時，由于其相對于IL、TNF-α等早期炎性反應遞質出現的晚，而以晚期炎性反應遞質著稱。有研究顯示，用純化的Hmgb1加入巨噬細胞培養物中，可明顯刺激NO、IL-1、IL-6、IL-8及TNF-α的產生，且呈劑量依賴性[11]。這表明作為晚期炎性反應遞質的Hmgb1，反過來又可以增加早期炎性反應遞質的大量釋放。近年的動物實驗和臨床研究都發現在急性胰腺炎發生時，體內的Hmgb1水平升高，且升高程度與疾病嚴重程度呈正相關，而用Hmgb1阻滯劑丙酮酸乙酯干預后，肝、肺、腎功能及胰腺、肺等病理組織學改變得到明顯改善，病死率降低，表明Hmgb1是急性胰腺炎急性炎性反應和器官損傷的重要遞質[12-14]。在我們的研究中亦發現，SAP發生后，胰腺組織中Hmgb1mRNA的表達明顯上調。

清胰Ⅱ號顆粒劑是一種中藥復方制劑，內含大黃、梔子、丹皮等主要成分。我們前期對SAP發病機制中相關細胞因子TNF-α、CD44、IL-1、IL-6、MCP-1等的作用進行了研究[15-17]，也觀察到清胰Ⅱ號顆粒劑有抑制促炎性反應細胞因子TNF-α、CD44、IL-1、IL-6等釋放的作用[18]。在本實驗中，我們還發現，誘發大鼠SAP發生24 h后，胰腺組織濕/干重比值增加，胰腺炎性反應水腫、出血壞死明顯，出現胰腺損傷，胰腺組織中NO、ET-1水平均升高，Hmgb1 mRNA表達上調。而經過清胰Ⅱ號顆粒劑干預后，胰腺濕/干重比值降低，胰腺病理組織學改變減輕，同時，SAP大鼠胰腺組織中的NO、ET-1水平降低，Hmgb1 mRNA表達下調。由此，我們推測清胰Ⅱ號顆粒劑對SAP胰腺損傷有保護作用，除了與降低NO、ET-1等炎性反應遞質濃度有關外，還可能與下調胰腺組織Hmgb1 mRNA表達有關。但是，在這一過程中是否存在Hmgb1與NO及ET-1的協同作用，尚需進一步研究。

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(2016-07-31收稿 責任編輯：徐穎)

Protective Effects of Qingyi II Granules against Pancreas Injury in Rats with Severe Acute Pancreatitis

Xiao Qingchuan1, Lan Tiangang2，Dui Danhua2

(1DepartmentofHepatobiliarysurgery,SichuanArmedPoliceHospital,Leshan614000,China；2DepartmentofHepatobiliarysurgery，AffiliatedHospitalofZunyiMedicalCollege，Zunyi563003,China)

Objective:To observe the effect and mechanism of Qingyi II Granules (QY) against the pancreas injury in rats with severe acute pancreatitis (SAP). Methods:Eighteen SD rats were randomly divided into fake operation group (group A), SAP group (group B) and treatment group (group C). The rat SAP model was made by retrograde injection of 30 g/L sodium taurocholate into pancreatic duct. Group C was treated with 250 g/L Qingyi Ⅱ Granule (10 mL/kg), once per 6 h, and group A and group B were treated with the same dose of saline in the same way. The expression of Hmgb1 mRNA in pancreatic tissue was detected by real-time PCR after 24 hours of modeling. The concentration of nitric oxide and endothelin-1 in pancreas was measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The pathological changes of pancreas were observed and the wet/dry weight ratio of pancreas was measured. Results:There were pancreas injury changes in group B, besides, expression of Hmgb1 mRNA was up-regulated and the levels of nitric oxide and endothelin-1 were increased; Qingyi Ⅱ Granule may cause that the expression of Hmgb1 mRNA in pancreatic tissue, the levels of nitric oxide and endothelin-1 concentration were decreased, thus reduced the degree of pathological damage of the pancreas. Conclusion:Hmgb1, nitric oxide and endothelin-1 may play an important role in SAP pancreatic injury. Qingyi II granules may reduce the expression of Hmgb1 mRNA in pancreatic tissue and decrease the concentration of nitric oxide and endothelin-1 to reduce the pathological changes of pancreatic tissue, thus protecting the pancreas injury.

High migration rate family protein-1; Endothelin-1; Nitric oxide; Severe acute pancreatitis; Rats

貴州省省長專項資金項目(編號：黔省專合字(2008)106號)

肖青川(1974.09—)，男，碩士，主治醫師，研究方向：肝膽胰基礎與臨床，Email：bedllxiao@163.com

兌丹華(1957.06—)，女，本科，教授，肝膽胰科主任，研究方向：胰腺炎，Email：ddh1975@163.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.04.042