缺血再灌注損傷腦微血管內皮細胞Necroptosis模型的建立

胡艷紅 雷洪濤 王淑艷 于 雪 張 賽 蘇 靖 馬家寶姜昭妍 張 凡 萬亮琴 臧妍妍 李芳赫 李衛紅

(1 北京中醫藥大學，北京，100029； 2 中國中醫科學院醫學實驗中心，北京，100700)

缺血再灌注損傷腦微血管內皮細胞Necroptosis模型的建立

胡艷紅1雷洪濤2王淑艷1于 雪1張 賽1蘇 靖1馬家寶1姜昭妍1張 凡1萬亮琴1臧妍妍1李芳赫1李衛紅1

(1 北京中醫藥大學，北京，100029； 2 中國中醫科學院醫學實驗中心，北京，100700)

目的：采用擬缺血再灌注損傷結合z-VAD-FMK(Benzyloxyearbonyl-Val-Ala-Asp-fluoromethylketone，z-VAD-FMK)干預，探索一種腦微血管內皮細胞(Brain Microvascular Endothelial Cells，BMECs)Necroptosis模型。方法：首先利用原代大鼠腦微血管內皮細胞，采用氧糖剝奪及復氧復糖方法，篩選出擬缺血再灌注損傷時間點。在擬缺血再灌注模型基礎上，予Casepase抑制劑z-VAD-FMK 20 μmol/L干預，采用CCK-8檢測細胞活性；透射電鏡觀察細胞超微結構；Annexin V-FITC/PI(Propidium Iodide)雙染色法檢測細胞死亡方式。結果：確定氧糖剝奪2 h復氧復糖8 h，作為擬缺血再灌注時間點；z-VAD-FMK作用于擬缺血再灌注損傷BMECs后，細胞活性無統計學意義；z-VAD-FMK干預組在電鏡下呈現明顯的Necroptosis特征；流式檢測顯示，各象限細胞比率無明顯變化，但Necroptosis特異性抑制劑Nec-1可顯著降低Q2象限細胞比率，提示z-VAD-FMK干預抑制了細胞晚期凋亡，誘導了Necroptosis的發生。結論：z-VAD-FMK可誘導擬缺血再灌注腦微血管內皮細胞發生Necroptosis，為以后研究缺血性腦中風necroptosis機制提供了細胞實驗模型。

腦微血管內皮細胞；Necroptosis；z-VAD-FMK；缺血再灌注損傷

腦中風是嚴重影響人類身體健康，甚至威脅生命的疾病。在我國，位列疾病死因第一位，每年發生腦中風的患者達200萬，其中缺血性腦中風所占的比率為70%～80%[1]。缺血再灌注損傷(Ischemia-reperfusion Injury，IRI)是該病的重要病理生理過程，缺血再灌注損傷形式有多種，其中細胞死亡是主要損傷形式之一。除傳統的凋亡和壞死外，近些年又發現一種新的細胞死亡形式—Necroptosis。已有證據表明，缺血缺氧模型的心肌細胞、神經細胞以及腫瘤存在Necroptosis[2-4]。腦微血管內皮細胞(Brain Microvascular Endothelial Cells，BMECs)作為血腦屏障的主要構成細胞，其功能受損和死亡參與了腦缺血的病理演變過程，但目前關于缺血誘導的腦微血管內皮細胞Necroptosis的研究甚少。本實驗利用原代培養的大鼠腦微血管內皮細胞，在氧糖剝奪誘導缺血再灌注損傷的基礎上，選用目前應用最為廣泛的caspase廣譜性蛋白抑制劑z-VAD-FMK(Benzyloxyearbonyl-Val-Ala-Asp-fluoromethylketone)進行處理，以建立一種腦微血管內皮細胞Necroptosis體外模型，為今后深入研究腦缺血后腦微血管內皮細胞Necroptosis的發生機制及血管保護藥物的療效靶點奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 采用本課題組已建立的大鼠腦微血管內皮細胞培養技術[5]，對20 g左右雄性SD大鼠進行細胞取材、培養和傳代。實驗中使用的第3代內皮細胞，其純度達到98%以上[6]。

1.1.2 試劑與儀器 z-VAD-FMK(美國Enzo Life Sciences公司)，Nec-1(美國Enzo Life Sciences公司)，DMSO(美國Sigma公司)，胎牛血清(excell bio南美血緣胎牛血清)，D-MEM/F-12培養基干粉(美國Gibco公司)，內皮細胞生長添加劑(ECGS，中科邁晨(北京)科技有限公司)，明膠(美國Sigma公司)，胰蛋白酶(美國Sigma公司)，膠原酶Ⅱ型(美國Sigma公司)，CCK-8試劑盒(日本同仁化學研究所)，Annexin V-FITC and PI雙染試劑盒(美國BD公司)，倒置相差顯微鏡(日本OLYMPUS公司)，X-Mark型酶標儀(美國BIO-RAD公司)，流式細胞儀(美國BD公司)，透射電子顯微鏡(日本H7650公司)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 將傳至第3代的腦微血管內皮細胞隨機分成3組：正常組、IRI組和IRI+z-VAD-FMK組。篩選和制備擬缺血再灌注模型：在本室已建立的擬缺血損傷模型的基礎上，重新篩選氧糖剝奪時間和復糖復氧時間，以制備穩定的擬缺血再灌注模型。第3代BMECs鋪滿瓶底約80%～90%時，吸出培養瓶內原培養液，用D-Hank′s洗滌兩遍，換成無糖Kreb′s液，放置37 ℃含1%O2、95%N2和5% CO2的培養箱中培養2 h或3 h，然后取出培養瓶棄掉上清，換成D-MEM/F-12基礎培養基，放進37 ℃、21.7%O2和5% CO2正常培養箱分別孵育0、4、8、12 h，每個時間點均設立正常對照組。造模結束后用CCK-8試劑盒檢測細胞活性，篩選合適的氧糖剝奪時間和復糖復氧時間，建立擬缺血再灌注損傷模型。

1.2.2 干預方法 除正常組外，其余2組按上述篩選出的擬缺血再灌注模型進行造模。IRI+z-VAD-FMK組，造模前30 min及造模過程中按20 μmol/L濃度加入z-VAD-FMK。造模及處理結束后，進行下列指標檢測。

1.2.3 檢測指標與方法 CCK-8檢測各組細胞活性：造模完成后棄上清，加入D-MEM/F-12培養基，每孔再加入10 μL CCK-8溶液，在培養箱中繼續孵育2 h后，用酶標儀測定各組的吸光光度值，檢測波長為450 nm，每組設6個復孔。透射電鏡觀察細胞超微結構：造模結束后，消化并收集細胞，用D-Hank′s洗滌細胞2次，將細胞懸液置于1.5 mL EP管中，200 g水平離心10 min。用預冷2.5%戊二醛(pH 7.3)1 mL/管進行固定，PBS漂洗，之后用1%鋨酸固定。以不同濃度的丙酮順次脫水，環氧樹脂包埋，光鏡下進行修塊，超薄切片機切成60 nm的薄片，用醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色，放于電子顯微鏡下觀察并拍片。Annexin V-FITC/PI雙染色法檢測細胞死亡方式：因細胞發生Necroptosis與晚期凋亡染色特征相似，因此本實驗在上述3組的基礎上，增加IRI+z-VAD-FMK+Nec-1(Necstatin-1，Necroptosis特異性阻滯劑)組，即在造模前30 min及造模過程中加入20 μmol/L z-VAD-FMK和10 μmol/Lnecstatin-1。造模結束后，用不含EDTA的胰酶消化細胞，200 g離心5 min，棄上清；用預冷的D-Hank′s洗滌細胞兩次，400 g離心5 min；每管加500 μL 1×Binding Buffer、5 μL Annexin V-FITC吹打混勻，室溫避光放置15 min后，在檢測前5 min加入10 μLPI后，上流式細胞儀進行檢測。

2 結果

2.1 確定擬缺血及再灌注時間 圖1為氧糖剝奪2 h，復氧復糖不同時間點的結果。造模前，正常組和模型組無統計學意義。與正常組比較，氧糖剝奪2 h時，細胞活性開始下降，但組間無統計學意義；復氧復糖4 h時，細胞活性顯著下降(P<0.01)，復氧復糖8 h時，細胞活性持續下降(P<0.01)，復氧復糖12 h時，細胞活性降低，但與復氧復糖8 h組比較，變化不大。

圖1 缺氧缺糖2 h，復氧復糖不同時間點BMECs活性的變化

注：與正常組比：△△P<0.01。

圖2為氧糖剝奪3 h，復氧復糖不同時間點的結果。造模前，正常組和模型組無統計學意義。與正常組比較，氧糖剝奪3 h時，細胞活性明顯下降(P<0.05)；復氧復糖4 h時，細胞活性顯著下降(P<0.01)，復氧復糖8 h和12 h時，細胞活性變化不大。

圖2 缺氧缺糖3 h，復氧復糖不同時間點BMECs活性的變化

注：與正常組比：△P<0.05，△△P<0.01。

從圖1和圖2綜合來看，BMECs氧糖剝奪2 h后，細胞活性稍有下降，但無統計學意義，復氧復糖4～8 h是細胞明顯損傷期。而氧糖剝奪3 h及復氧復糖各時間點細胞活性均顯著下降，復氧復糖0～4 h是細胞明顯損傷期，該損傷更接近于急性缺血性損傷。我們認為，氧糖剝奪2 h復氧復糖8 h，細胞損傷主要發生在再灌注過程中，更符合缺血再灌注損傷的特征，因此確定了氧糖剝奪2 h復氧復糖8 h來制備擬缺血再灌注損傷模型，以下實驗均采用此條件造模。

2.2 CCK-8檢測各組的細胞活性 如表1結果所示，IRI組OD值較正常組顯著降低(P<0.01)，提示IRI組細胞活性顯著下降；與IRI組比較，IRI+z-VAD-FMK組OD值變化不明顯。這一結果顯示加入z-VAD-FMK后，細胞活性沒有明顯升高，與本實驗驗證z-VAD-FMK可能會誘導另一種細胞死亡形式相一致。

表1 各組BMECs活性的變化

注：與正常組比：△△P<0.01。

2.3 透射電鏡觀察各組細胞形態學改變 如圖3所示，在透射電鏡下，正常的腦微血管內皮細胞的細胞膜完整，細胞核呈橢圓形，染色質均勻，細胞器狀態良好(圖3a)。IRI組大多細胞核固縮或破裂，染色質凝聚，但細胞膜基本完整(圖3b、3c)。IRI+z-VAD-FMK組(圖3d、e、f)：細胞膜完整性被破壞和內容物從胞內釋放，細胞器腫脹，線粒體內脊消失呈空泡化，細胞核基本完整，這些變化與Necroptosis的形態特征相符合，提示z-VAD-FMK可誘導擬缺血再灌注損傷BMECs發生Necroptosis。

圖3 透射電鏡觀察各組細胞超微結構

注：a：正常組；b、c：IRI組；d、e、f：IRI+z-VAD-FMK組。

2.4 Annexin V-FITC/PI雙染色法檢測細胞死亡方式 如圖4結果所示：與正常組相比，IRI組Q1、Q2、Q4象限細胞比率均顯著升高(Q2、Q4象限P<0.01)，Q3象限細胞比率顯著降低(P<0.01)，提示擬缺血再灌注損傷造成BMECs早期凋亡、晚期凋亡以及壞死率均顯著增加；與IRI組相比，IRI+z-VAD-FMK組Q1、Q2、Q3和Q4象限細胞比率變化不明顯，無統計學意義。為了證明Q2象限細胞為Necroptosis，我們另設了IRI+z-VAD-FMK+Nec-1組，即在上述處理的基礎上，利用Necroptosis抑制劑Nec-1進行干預，結果顯示，與IRI+z-VAD-FMK組相比，IRI+z-VAD-FMK+Nec-1組Q2象限細胞比率顯著降低(P<0.05)，Q3象限比率顯著升高(P<0.01)，具有統計學意義，說明Nec-1可顯著降低Q2象限細胞比率，提示OGD+z-VAD-FMK組Q2象限細胞死亡形式可能是Necroptosis。

組別NQ1Q2Q3Q4正常組346±0452±15892±1010±07IRI組3123±74148±54△△671±41△△58±20△△IRI+z?VAD?FMK組3131±66138±41668±2162±77IRI+z?VAD?FMK+Nec?1組380±3682±22▲804±13▲▲34±22

圖4 Annexin V-FITC/PI雙染色法檢測細胞死亡方式

注：與正常組比：△△P<0.01；與IRI+z-VAD-FMK組比：▲P<0.05，▲▲P<0.01。Q1:壞死細胞象限；Q2：晚期凋亡細胞象限；Q3：正常細胞象限；Q4：早期凋亡細胞象限。

3 討論

腦缺血后公認的細胞死亡類型包括缺血核心區即刻發生的細胞壞死，以及隨后再灌注過程中的細胞凋亡。因此以往關于缺血再灌注損傷的研究多集中在細胞凋亡。2005年由哈佛大學課題組發現一種新型的細胞死亡形式，命名為Necroptosis，在國內被翻譯為程序性壞死或壞死性凋亡，但以前者更被認可[7]。研究表明，Necroptosis是由死亡受體介導的，被一系列信號傳導通路所調控的caspase非依賴性細胞死亡方式，同時具有壞死和凋亡的特征。在形態學方面，Necroptosis具有明顯的壞死特征，主要表現為細胞器腫脹、細胞膜完整性破壞，細胞核完整等[8]。此外，在Necroptosis過程中，會釋放大量損傷相關分子，引發嚴重的局部炎性反應，導致大量炎性反應細胞浸潤和激活[9]；而在其發生機制方面類似于凋亡，由特定因子啟動，依賴于死亡受體并按照一定信號通路和程序發生，可以對其過程進行調控，但其過程不依賴于caspase系統。隨著研究的深入，發現Necroptosis與腦缺血再灌注損傷關系十分密切，在缺血性腦中風發病機制中占有重要地位，現已成為研究的熱點[10]，這也為研制開發神經保護藥物提供了新的靶點。

為了深入研究抑制Necroptosis對缺血性腦損傷的意義，人們探索了一些體外誘導細胞發生Necroptosis的方法，其中最常用的是在誘導凋亡的基礎上加用z-VAD-FMK進行干預[11]。其原理為細胞的死亡受體激活后，如果凋亡通路活化則誘導凋亡，凋亡過程是依賴caspase的，在caspase活性被抑制時會啟動Necroptosis。z-VAD-FMK是一種人工合成的廣譜caspase抑制劑，能夠抑制細胞凋亡發生過程中多種caspase酶的活性，因此可以誘導Necroptosis的發生。

本實驗采用擬缺血再灌注損傷結合z-VAD-FMK，探索了腦微血管內皮細胞Necroptosis模型。首先用cck-8篩選了缺血再灌注時間，由于實驗室前期發現氧糖剝奪6 h時，腦微血管內皮細胞已經發生急性缺血性損傷，因此本次實驗從氧糖剝奪5 h以內摸索缺氧缺糖時間，再摸索再灌時間。結果缺氧4 h和5 h時，細胞損傷已很嚴重(數據未顯示)，最后棄掉，只做了缺氧缺糖2 h和3 h不同再灌時間點的模型。實驗結果顯示缺氧缺糖2 h再灌注8 h時，細胞損傷明顯，且損傷主要發生在再灌后4～8 h，比較符合缺血再灌注損傷特點，因此確定該時間點作為模擬缺血再灌注損傷的時間點，建立了穩定的IRI模型。

然后，在IRI的基礎上利用z-VAD-FMK進行誘導，cck-8結果顯示IRI組OD值降低，IRI+z-VAD-FMK組與IRI組相比無統計學意義，可能的原因為z-VAD-FMK在抑制凋亡的同時誘導了另一種細胞死亡形式Necroptosis的發生，因此該組細胞活性總體沒有明顯升高。為了進一步揭示z-VAD-FMK誘導的細胞死亡形式，本實驗又用Annexin V-FITC/PI雙染色法通過流式細胞儀來檢測，結果顯示z-VAD-FMK干預后各象限細胞比率變化不大。這一結果可能與Annexin V-FITC/PI雙染色法的原理和Necroptosis的細胞形態變化特征有關。在細胞發生凋亡的早期，Annexin V-FITC可與外翻到細胞表面的磷酯酰絲氨酸結合，因此Annexin V-FITC陽性被作為檢測細胞早期凋亡的靈敏指標之一。PI是一種核酸染料，它不能透過正常細胞或早期凋亡細胞的完整的細胞膜，但可以透過凋亡晚期和壞死細胞的細胞膜而使細胞核染紅。z-VAD-FMK主要通過阻斷caspase來抑制凋亡，對早期凋亡影響不大；Q2象限為Annexin V和PI染色均為陽性的細胞，一般代表晚期凋亡細胞，z-VAD-FMK阻斷caspase后，通過磷酸化RIP3誘導Necroptosis的發生，Necroptosis細胞Annexin V和PI染色也表現為雙陽性，因此，z-VAD-FMK抑制了晚期凋亡，但增加了Necroptosis的發生，使得Q2象限細胞比率變化不明顯。為了證明Q2象限細胞的死亡方式為Necroptosis，我們另設了IRI+z-VAD-FMK+Nec-1組，即在上述處理的基礎上，增加了Necroptosis特異性抑制劑Nec-1干預，結果顯示Nec-1可有效降低Q2象限細胞比率，證明了Q2象限的細胞發生Necroptosis。該結果在投射電鏡中再次被證實，IRI+z-VAD-FMK組細胞膜破壞明顯，線粒體腫脹，內脊消失呈空泡化，細胞核基本完整，這些變化符合Necroptosis的形態特征。總之，綜合以上實驗結果證實了：z-VAD-FMK可誘導擬缺血再灌注腦微血管內皮細胞發生Necroptosis，為以后研究缺血性腦中風發生Necroptosis提供了細胞實驗模型。

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(2016-08-16收稿 責任編輯：徐穎)

世界中醫藥大會第三屆夏季峰會暨大健康產業博覽會

由世界中醫藥學會聯合會主辦的“世界中醫藥大會”是全球中醫藥領域規模大、參與廣、層次高的學術盛會，至今已經成功舉辦十三屆。為進一步擴大世界中醫藥大會的學術影響力，世界中聯特決定在境內召開世界中醫藥大會夏季峰會，至今已經成功主辦兩屆。世界中醫藥大會第三屆夏季峰會，將于2017年6月10—12日在安徽合肥召開，本次大會主題為“聚焦中醫藥大健康，助力‘一帶一路’發展”，現誠摯邀請來自世界各國(地區)的中醫藥相關專家、學者與會，交流中醫藥理論研究、臨床經驗、科研成果以及新技術、新療法，聚焦大健康產業發展。大會將制作《世界中醫藥大會第三屆夏季峰會特刊》，收錄具備一定資質的機構和個人的相關宣傳資料，將贈與參會人員及我會67個國家的251個會員團體、各國駐華使館、我國駐外使館及有關國際組織和相關機構收藏。大會將制作大會論文集，論文截稿日期2017年5月20日，歡迎大家積極投稿。

報名聯系人：鄒建華、關濤、焦云洞、劉香玉、劉曉婷、陳安

電話：010-58650042/0043，010-58650242,傳真：010-58650043

報名網站：http://wccmss2017.medmeeting.org/cn

聯系郵箱：wfcmsxshb@vip.163.com

The Establishment of Necroptosis Model on Mimic Ischemic Reperfusion Injury in Brain Microvascular Endothelial Cells

Hu Yanhong1, Lei Hongtao2, Wang Shuyan1, Yu Xue1, Zhang Sai1, Su Jing1, Ma Jiabao1, Kang Soyeon1, Zhang Fan1, Wan Liangqin1, Zang Yanyan1, Li Fanghe1, Li Weihong1

(1BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China; 2MedicalResearchCenterofChineseAcademyofTraditionalChineseMedicine,Beijing100700,China)

Objective:To explore a model of necroptosis in brain microvascular endothelial cells (BMECs) by mimic ischemia-reperfusion injury combined with z-VAD-FMK (Benzyloxyearbonyl-Val-Ala-Asp-fluoromethylketone, z-VAD-FMK). Methods:First, primary rat BMECs were cultured in oxygen-glucose deprivation (OGD) and reintroduction conditions for various time points to screen a time of mimic ischemia-reperfusion injury. Then, z-VAD-FMK, the casepase inhibitor, was administrated at 20 μmol/L concentration on the ischemia-reperfusion injured BMECs. The cell activity was detected by CCK-8. The ultra-stucture was observed using the transmission electron microscope. The death mode of BMECs was detected using cell ultrastructure; Annexin V-FIT C/PI (propidium iodide) double staining to detect the type of cell death. Results:OGD 2 h and reintroduction 8 h was determined to be the time point of mimic ischemia-reperfusion injury. After z-VAD-FMK was administrated on ischemia-reperfusion injuried BMECs, the cells viability didn′t change significantly. The necroptosis characteristic was presented under transmission electron microscope. The flowcytometry results showed that ratio of cells in each quadrant had no significant change. However, Nec-1, a specific inhibitor of necroptosis, could significantly decrease the ratio of cells in quadrant Q2, suggesting that intervention of z-VAD-FMK inhibited the late apoptosis and induced necroptosis occurrence. Conclusion:The necroptosis may be induced by z-VAD-FMK in ischemia-reperfusion injured BMECs, which provides the cell experimental model for researching necroptosis mechanism in the ischemic stroke in the future.

Brain microvascular endothelial cells; Necroptosis; z-VAD-FMK; Ischemia-reperfusion injury

國家自然科學基金項目(編號：81273885)；北京市自然科學基金項目(編號：7144223)

胡艷紅(1988.12—)，女，在讀碩士研究生，研究方向：中藥復方治療腦病的配伍機制研究

李衛紅(1973.05—)，女,醫學博士,副教授，研究生導師，從事中醫藥治療腦病的基礎研究，E-mail:liweihong.403@163.com

R965

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.04.043