黃連對糖尿病腎病大鼠腎臟NF-κB及PPAR-γ表達的影響

郭楊志 杜 娟 李向民 馮興中 郭 偉

(1 首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院,北京,100038; 2 北京市昌平區中西醫結合醫院,北京,102208;3 內蒙古自治區烏海市蒙中醫院,烏海,016000)

黃連對糖尿病腎病大鼠腎臟NF-κB及PPAR-γ表達的影響

郭楊志1杜 娟2李向民1馮興中1郭 偉3

(1 首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院,北京,100038; 2 北京市昌平區中西醫結合醫院,北京,102208;3 內蒙古自治區烏海市蒙中醫院,烏海,016000)

目的:觀察黃連對糖尿病腎病大鼠腎臟病理、腎小球NF-κB及PPAR-γ mRNA的影響。方法:采用高脂飲食結合腹腔注射鏈脲佐菌素方法建立糖尿病SD大鼠模型,隨機分為模型組、厄貝沙坦組[31.25 mg/(kg·d)]、黃連低、中、高劑量組[相當于人黃連飲片用量的83 mg/(kg·d)、500 mg/(kg·d)、1000 mg/(kg·d)],每組8只,另取8只正常大鼠作為對照,給藥12周后,檢測各組大鼠腎小球NF-κB及PPAR-γ mRNA表達水平及腎臟病理變化。結果:黃連各劑量組可顯著降低大鼠腎臟NF-κB表達(P<0.05),黃連高劑量組及厄貝沙坦組可顯著增強大鼠腎臟PPAR-γ mRNA表達(P<0.05),各用藥組均有一定改善大鼠腎臟病變的作用。結論:黃連具有降低糖尿病腎病大鼠腎臟NF-κB表達及增強PPAR-γ mRNA表達的作用,可緩解腎臟病變。

糖尿病腎病;黃連;NF-κB;PPAR-γ

糖尿病腎病(Diabetic Nephropathy,DN)是糖尿病的主要微血管并發癥之一,其以腎小球肥大、腎小球濾過率降低、腎小球外基質堆積和腎小球纖維化為主要病理特征[1],是導致我國終末期腎病的主要原因之一[2]。包括多種炎性反應因子參與的炎性反應在DN進展過程中發揮重要作用[3]。

過氧物酶體增殖體激活受體γ(Peroxisome Proliferator Activated Receptorγ,PPARγ)是PPAR核受體家族中的一員,其通過改善胰島素抵抗并降糖、降低血壓、調節細胞生長周期、抑制脂質在腎臟沉積、抗炎抗氧化等作用改善DN所致腎臟損傷[4]。核因子-κB(Nuclear Factor Kappa B,NF-κB)存在于多種組織細胞中,是炎性反應的關鍵調控因子,其通過上調多種炎性反應因子及前炎性反應因子表達,如腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factor α,TNF-α)、單核細胞趨化因子-1(Monocyte Chemoattractant Protein 1,MCP-1)、細胞間黏附分子-1(Intercellular Adhesion Molecule 1,ICAM-1)等,募集炎性反應細胞向腎小球浸潤,誘發并加重腎小球炎性反應損傷,參與DN進展[5]。而在DN發病過程中,PPARγ可通過抑制NF-κB表達,減輕DN炎性反應損傷,發揮腎臟保護作用。

黃連是毛茛科植物黃連(CoptischinensisFranch.)、三角葉黃連(CoptisdeltoideaC.Y.ChengetHsiao)或云連(CoptisteetaWall.)的干燥根莖[6],具有“清熱燥濕解毒”作用,廣泛應用于表現為濕熱證侯、火毒證侯的多種疾病。近年來部分中醫臨床工作者總結了以“郁、熱、虛、損”為特點的糖尿病發病規律,并應用大劑量黃連治療糖尿病,取得了一定療效。而在實驗研究中也證實了黃連所含鹽酸小檗堿、巴馬汀等具有一定降低血糖及改善糖尿病并發癥的作用[7-8]。本研究以全成分提取的黃連配方顆粒為干預手段,選取具有腎臟保護作用的PPAR-γ及促進腎臟炎性反應損傷的NF-κB作為觀察指標,對比不同劑量黃連配方顆粒對此二者的影響,為臨床應用黃連干預DN提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 清潔級健康雄性SD大鼠70只,體質量160～180 g,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司,合格證號SCXK(京)2012-0001,全部飼養于首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院動物實驗室(室溫20～24 ℃,空氣相對濕度50%～70%,晝夜循環12 h,自由進食)。

1.1.2 藥物 黃連配方顆粒,基原為毛茛科植物黃連CoptischinensisFranch.的干燥根莖,購自北京康仁堂藥業有限公司(批號:15005651),1 g黃連配方顆粒提取自10 g黃連飲片;厄貝沙坦片(安博維)購自賽諾菲(杭州)制藥有限公司(批號:5A154);高脂飼料(66.75%普通飼料,20%蔗糖,10%豬油,3%蛋黃粉,1%膽固醇,0.25%膽酸鈉)購自北京科澳協力飼料有限公司(批號:11002900017691)。

1.1.3 試劑與儀器 鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)購自Sigma公司(貨號:S0130);兔抗NF-κB p65(A)單克隆抗體(1∶100)購自Santa Cruz公司產品(貨號:sc-109);超敏二步法免疫組化檢測試劑(貨號:PV-9001)購自北京中杉金橋生物技術有限公司;超純RNA提取試劑盒(貨號:CW0581)、SYBR Green熒光定量PCR試劑盒(貨號:CW0956)、HiFi-MMLV cDNA第一鏈合成試劑盒(貨號:CW0744),均購自北京康為世紀生物科技有限公司;引物序列由上海英駿生物技術有限公司合成。ABI 7500型快速實時熒光定量PCR儀為美國ABI公司生產。奧林巴斯BX51光學顯微鏡顯微鏡為日本奧林巴斯株式會社生產。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 SD大鼠適應性飼養1周后,隨機分為正常對照組(n=8)和STZ誘導組(n=62),分別予普通飼料及高脂飼料。4周后,STZ誘導組腹腔注射新鮮配制的STZ溶液(35 mg/kg),正常對照組予等劑量的枸櫞酸鈉腹腔注射。STZ注射72 h及1周后,尾靜脈采血測定空腹血糖(Fasting Blood Glucose,FBG),2次FBG均超過16.7 mmol/L者為DM造模成功[9]。造模成功的DM大鼠40只隨機分為模型組、厄貝沙坦組、黃連低、中、高劑量組,每組8只。

1.2.2 給藥方法 厄貝沙坦組予31.25 mg/(kg·d)厄貝沙坦片(安博維)灌胃;黃連低、中、高劑量組分別予52 mg/(kg·d)、312.5 mg/(kg·d)、625 mg/(kg·d)黃連配方顆粒劑灌胃[折算為成人黃連飲片用量為:83 mg/(kg·d)、500 mg/(kg·d)、1 000 mg/(kg·d)]，連續給藥12周[10]。

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3.1 HE染色 第12周末,所有大鼠腹腔注射水合氯醛(10 mg/kg)麻醉,手術剝離大鼠兩側腎臟,將去掉包膜的腎臟縱向剖開,留取包括腎髓質及腎皮質的完整扇形組織。左側腎臟組織4%多聚甲醛固定、石蠟包埋切片(4 μm),常規HE染色,光學顯微鏡(×400)觀察大鼠腎小球病理改變,使用JEDR 801D形態學圖像分析系統軟件采集圖像。

1.2.3.2 免疫組化染色 取石蠟固定切片(4 μm)行免疫組織化學法觀察腎小球NF-κB表達。步驟:脫蠟;高溫高壓法組織修復;3%過氧化氫孵育5～10 min,PBS沖洗,2 min×3次;滴加一抗,4 ℃冰箱過夜,PBS沖洗,2 min×3次;滴加二抗,37 ℃孵育30 min,PBS沖洗,2 min×3次;DAB顯色,蒸餾水充分沖洗;DAB顯色;蘇木素復染細胞核,分化,返藍;剃度乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。每張切片在高倍鏡(×400)下選取含有腎小球的6個連續不重復視野,以胞質或胞核出現金黃色或棕黃色顆粒為陽性信號,采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件測定平均積分光密度值(IOD/area),以平均值作為該大鼠的腎臟陽性產物平均積分光密度值。

1.2.3.3 實時熒光定量PCR檢測腎臟PPAR-γ mRNA表達 取右側腎組織腎皮質100 mg,按超純RNA提取試劑盒說明書操作進行總RNA提取,以總RNA為模板,逆轉錄合成cDNA。采用Primer3.0及NCBI-primer設計軟件設計基因cDNA上游及下游引物,由上海英駿生物技術有限公司合成引物。PPAR-γ引物序列上游:5′-CTCC AGCT GAAG CTGA ACCA-3′,下游:5′-AGATCTCCTGGAGCAGAGGG-3′,163 bp;內參β-actin引物序列上游:5′-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3′,下游:5′-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3′,150 bp;待測物相對定量測定采用常用的2-△△Ct法[11]。

2 結果

2.1 大鼠腎小球HE染色 HE染色可見正常組大鼠腎小球毛細血管球結構清晰,管腔無狹窄,腎小球濾過膜結構完整,未見增厚、皺曲,腎小管結構清晰,腎間質未見炎性反應細胞浸潤。DN大鼠腎小球體積縮小、毛細血管球結構破壞,局部腎小球組織纖維化、玻璃樣變,毛細血管腔明顯狹窄,并有脂質物質沉積導致濾過膜增厚,腎小管萎縮,腎間質血管增生。經厄貝沙坦及黃連低、中、高劑量干預后,大鼠腎小球病變均有改善,腎小球結構尚完整,毛細血管球結構無明顯破壞,毛細血管腔狹窄減輕,系膜基質部分增生,HE染色結果見圖1。

圖1 各組大鼠腎小球HE染色

注：A:正常組;B:模型組;C:黃連低劑量組;D:黃連中劑量組;E:黃連高劑量組;F:厄貝沙坦組。

2.2 大鼠腎臟NF-κB免疫組化染色 正常組大鼠腎小球可見少量NF-κB表達,腎小管中幾乎觀察不到NF-κB著色;與正常組比較,模型組大鼠腎小球著色明顯,經西藥及黃連各劑量組干預后,NF-κB表達減少,結果見圖2。平均積分光密度值顯示,與正常組比較,模型組、厄貝沙坦組腎小球NF-κB表達明顯升高,差異有統計學意義(P<0.05);與模型組比較,黃連各劑量組NF-κB表達明顯降低,差異有統計學意義(P<0.05),其中黃連中劑量組NF-κB表達最低,結果見表1。

圖2 各組大鼠腎小球NF-κB免疫組化染色

注：A:正常組;B:模型組;C:黃連低劑量組;D:黃連中劑量組;E:黃連高劑量組;F:厄貝沙坦組。

表1 各組大鼠腎臟NF-κB免疫組化平均積分光密度值

注:與正常組比較*P<0.05;與模型組比較△P<0.05。

2.3 大鼠腎臟PPAR-γ mRNA表達 與正常組比較,模型組、黃連各劑量組、厄貝沙坦組PPAR-γ mRNA表達明顯降低,差異有統計學意義(P<0.05);與模型組比較,黃連高劑量組及厄貝沙坦組PPAR-γ mRNA表達明顯升高,差異有統計學意義(P<0.05),其中厄貝沙坦組PPAR-γ mRNA表達高于黃連高劑量組(P<0.05),其余藥物組間差異不明顯(P>0.05),結果見圖3。

圖3 各組大鼠PPAR-γ mRNA PCR結果

注：與正常組比較*P<0.05;與模型組比較△P<0.05;與黃連高劑量組比較▲P<0.05。

3 討論

DN的病理改變包括腎小球及腎小管間質肥大、腎小球基底膜增厚、細胞外基質蛋白在腎小球系膜及腎小管間質中的沉積[12]。本研究發現DN模型組腎小球體積縮小、纖維化,功能破壞明顯,符合DN后期腎小球纖維化病理改變,經黃連及厄貝沙坦干預后,腎小球纖維化病變減輕,腎臟病理損傷緩解,說明黃連及厄貝沙坦具有緩解DN腎臟損傷的作用。

本研究免疫組化染色觀察到模型組NF-κB表達集中于腎小球部分,而在腎小管中幾乎觀察不到NF-κB著色,提示在DN進展過程中,由NF-κB介導的炎性反應主要發生于腎小球內,其可能通過募集炎性反應細胞向腎小球聚集,誘發炎性反應,導致腎小球損傷。PCR檢測發現,模型組腎臟皮質中對NF-κB具有抑制作用的PPAR-γ mRNA含量明顯下降,提示在DN發病過程中,促進炎性反應蛋白的增多,和抑制炎性反應蛋白的減少,共同導致了DN腎小球損傷。通過藥物干預,發現黃連及厄貝沙坦都能增加PPAR-γ mRNA的含量,提示二者可能通過PPAR-γ相關通路抑制了NF-κB及其介導的炎性反應,緩解了DN腎臟損傷。此外,黃連干預后,還可直接減少NF-κB在腎小球的表達,進一步抑制腎小球炎性反應,這可能由于黃連含有多種有效成分,與厄貝沙坦比較,能多靶點發揮抗炎作用,其具體機制有待深入研究。

總之,本研究發現黃連可減輕DN腎小球損傷,這可能與其抑制DN腎小球NF-κB蛋白表達、增強PPAR-γ mRNA表達相關。

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(2016-11-28收稿 責任編輯：王明)

Effect of Coptis Chinensis on Expression of NF-κB and PPAR-γ in Kidney of Diabetic Nephropathy Rats

Guo Yangzhi1，Du Juan2，Li Xiangmin1，Feng Xingzhong1，Guo Wei3

(1BeijingShijitanHospital,Beijing100038,China; 2BeijingChangpingHospitalofIntegratedChineseandWesternMedicine,Beijing100038,China; 3TheMongolianMedicineandTCMHospitalofWuhai，Wuhai016000,China)

Objective:To investigate the effect of Coptis Chinensis on NF-κB, PPAR-γ and pathological changes of kidney in STZ-induced Diabetic Rats. Methods:Diabetic model in SD rats were established by intravenous injection of STZ combined with high-fat chow feeding. The models were randomly divided into a model group, an Irbesartan group [31.25 mg/(kg·d)], and Coptis Chinensis low-, mid-, and high-dose [equal with Coptis Chinensis used in human:83 mg/(kg·d),500 mg/(kg·d),1000 mg/(kg·d)] groups (n=8 each), other 8 SD rats were selected as normal group. After 12 consecutive weeks of administration, the expression of NF-κB and PPAR-γ in kidney was detected, and the pathological changes of kidney were observed. Results:The Coptis Chinensis groups decreased the expression of NF-κB (P<0.05); The Coptis Chinensis mid-dose group and Irbesartan group increased the expression of PPAR-γ(P<0.05); In all the Coptis Chinensis groups and Irbesartan group, pathological changes of kidney on STZ-induced diabetic rats were alleviated. Conclusion:Coptis Chinensis can decrease the expression of NF-κB, increase the expression of PPAR-γ and alleviate the pathological changes of kidney in STZ-induced Diabetic Rats.

Diabetic nephropathy；Coptis Chinensis；NF-κB；PPAR-γ

北京市中醫藥科技項目青年研究項目(編號:QN2014-08);北京世紀壇醫院青年博士基金(編號:2016QB07);國家中醫重點專科建設項目

郭楊志(1986.01—),男,博士,住院醫師,研究方向:中醫藥防治糖尿病、腫瘤及老年病研究,E-mail:guoyangzhi@outlook.com

馮興中(1964.10—),男,博士,主任醫師,研究方向:中醫藥防治糖尿病及腫瘤研究,E-mail:fengxz9797@sina.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.04.044