芪桂益脈靈對大鼠心肌缺血再灌注損傷基質金屬蛋白酶9及c-Jun氨基末端蛋白激酶表達的影響※

趙 龍 張超越 徐京育

(黑龍江中醫藥大學2014級碩士研究生，黑龍江 哈爾濱 150040)

芪桂益脈靈對大鼠心肌缺血再灌注損傷基質金屬蛋白酶9及c-Jun氨基末端蛋白激酶表達的影響※

趙 龍 張超越 徐京育△

(黑龍江中醫藥大學2014級碩士研究生，黑龍江 哈爾濱 150040)

目的 觀察芪桂益脈靈對大鼠心肌缺血再灌注損傷基質金屬蛋白酶9(MMP-9)和c-Jun氨基末端蛋白激酶(JNK)信號通路的影響。方法 將50只健康雄性SD大鼠隨機分為空白組(N)、假手術組(Sham)、單純缺血再灌注組(I/R)、芪桂益脈靈高劑量組(QGYMLH)、芪桂益脈靈低劑量組(QGYML)，每組10只，分別給予0.9%氯化鈉注射液、芪桂益脈靈(高、低劑量)，連續灌服7 d，結扎冠狀動脈左前降支造成急性心肌梗死模型，腹主動脈采血，離心取上層血清，采用酶聯免疫法檢測MMP-9的表達；取心肌組織，用中性福爾馬林固定，應用免疫組化法檢測磷酸化c-Jun氨基末端蛋白激酶(P-JNK)表達。結果 Sham組MMP-9、P-JNK表達水平與N組比較差異無統計學意義(P>0.05)；I/R組、QGYMLL組、QGYMLH組MMP-9、P-JNK表達水平均高于N組(P<0.05)；QGYML組、QGYMLH組MMP-9、P-JNK表達水平均低于I/R組(P<0.05)；QGYMLH組MMP-9、P-JNK表達水平低于QGYMLL組(P<0.05)。結論 芪桂益脈靈對缺血再灌注損傷心肌具有保護作用，其機制與抑制心肌組織中JNK磷酸化程度及MMP-9表達有關，且與中藥劑量相關。

黃芪；桂枝；心肌再灌注損傷；大鼠；JNK絲裂原活化蛋白激酶類；基質金屬蛋白酶類

近年來，心肌梗死(以下簡稱心梗)的發病率不斷上升，心梗再通后造成的心肌損傷成為關注的熱點，所以心肌缺血再灌注治療藥物的研究具有重要意義。缺血再灌注的病理機制主要有炎性反應、能量代謝障礙等，其中c-Jun氨基末端蛋白激酶(JNK)是炎性損傷的關鍵靶點[1-3]。JNK信號通路不僅在缺血期可被激活，在再灌注階段也可被激活，參與炎性反應，進一步引起炎性損傷[4]。基質金屬蛋白酶9(MMP-9)是基質金屬蛋白酶(MMPs)家族的主要成員之一，能在缺血再灌注損傷后使小血管壁受傷，導致細胞水腫及炎性浸潤，早期抑制MMP-9表達，可以減輕梗死面積[5]。現有研究發現，激活JNK信號通路可以上調MMP-9表達。本研究通過芪桂益脈靈對大鼠進行預處理，觀察心肌急性缺血再灌注損傷大鼠模型MMP-9和JNK的表達，研究芪桂益脈靈對缺血再灌注損傷保護機制[6]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 健康雄性SD大鼠50只,體質量200 g～250 g，由黑龍江中醫藥大學實驗動物中心提供[許可證號：SCXK(黑)2013-004]。

1.1.2 試劑 大鼠MMP-9酶聯免疫分析試劑盒，購自北京誠林生物科技有限公司； SC-572(兔一抗)試劑盒、SC-6254(鼠一抗)試劑盒、PV-9001(兔二抗)試劑、PV-9002(鼠二抗)試劑，均購自北京中杉金橋生物技術有限公司；烏拉坦，購自北京博士德生物工程有限公司；3′3-二氨基苯聯胺(DAB)顯色溶液，購自上海杰美基因醫藥科技有限公司；磷酸緩沖鹽溶液(PBS)，購自上海易利生物科技有限公司；中藥復方芪桂益脈靈，藥物組成：黃芪、桂枝、苦參、三七、黃連、龍齒、黨參、麥冬、五味子、炒酸棗仁，為免煎顆粒劑，購自江陰天江藥業有限公司。

1.1.3 儀器 ECG-1150型心電圖機(上海光電醫用電子儀器有限公司)；DH-150型動物人工呼吸機(浙江大學醫學儀器有限公司)；DT5000A型電子分析天平[梅特勒-托利多國際貿易(上海)有限公司]；318型洗板機(上海三科儀器有限公司)；DK-8B型電熱恒溫水槽(上海精宏實驗設備有限公司)；ELX808吸收光酶標儀(上海啟步生物科技有限公司)；NiKon E200光學顯微鏡；低溫冰箱(日本三洋公司)；低溫離心機(日本三洋公司)；冰凍切片機。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組 健康SD大鼠50只，隨機分為5組，分別為：空白組(N)、假手術組(Sham)、單純缺血再灌注組(I/R)、芪桂益脈靈低劑量組(QGYMLL)、芪桂益脈靈高劑量組(QGYMLH)。每組10只，最終隨機每組入組8只,相同條件下進行飼養。

1.2.2 給藥 5組大鼠分別按照下列給藥方法用藥7 d。每日清晨N組、Sham組、I/R組均予空腹灌服0.9%氯化鈉注射液2 mL、QGYMLL組空腹灌服低劑量芪桂益脈靈(0.6 g/kg)2 mL、QGYMLH組空腹灌服高劑量芪桂益脈靈(1.2 g/kg) 2 mL。

1.2.3 造模 按上述末次給藥60 min后進行造模。大鼠用20%烏拉坦(1 g/kg)腹腔麻醉。麻醉后進行心電監測，氣管切開，連呼吸機(呼吸頻率為90次/min，潮氣量為12 mL，呼吸比為1∶1)。于胸骨左緣3、4肋間，切開皮膚，長度約2 cm，逐層分離皮下組織和肌肉，打開胸腔及心包膜,擠出心臟；在肺動脈圓錐與左心耳交界處結扎左冠狀動脈前降支，將結扎后的心臟放回胸腔內。連續記錄冠狀動脈結扎前后及再通后Ⅱ導聯心電圖。N組：只開胸，不穿線，不結扎；Sham組：開胸，只穿線但不結扎；I/R組行左主冠狀動脈結扎60 min，再灌注180 min；QGYMLH組、QGYMLL組方法同I/R組。模型成功標準:心電示S-T段呈近似單線曲線拱背向上抬高;并見再灌注后心律失常。

1.3 觀察指標及方法 (1)MMP-9：造模成功后，于腹主動脈采血5 mL，離心后取上層血清備用，按照MMP-9試劑盒檢測方法檢測大鼠MMP-9含量。(2)磷酸化c-Jun氨基末端蛋白激酶(P-JNK)：摘取大鼠心臟，剔除周圍結締組織，采用0.9%氯化鈉注射液沖洗血液，用4%中性福爾馬林固定備用，應用蘇木精-伊紅(HE)染色法觀察心肌病理學變化；免疫組化法檢測心肌組織中JNK信號通路表達，方法：①脫蠟、水化組織切片；②根據應用的一抗的特殊要求，對組織切片進行預處理；③3%H2O2去離水孵育10 min，以阻斷內源性過氧化物酶；④PBS沖洗，2 min 3次；⑤滴加一抗試劑，室溫孵育1～2 h，PBS沖洗，2 min 3次；⑥滴加Primary Antibody Enhancer(增強子),37 ℃孵育10～20 min，PBS沖洗，2 min 3次；⑦滴加二抗試劑,37 ℃孵育10～20 min，PBS沖洗，2 min 3次；⑧應用DAB溶液顯色；⑨自來水充分沖洗、復染、脫水、透明、封片，顯微鏡觀察。在400倍顯微鏡下拍攝切片圖像，每張圖片選3個不重疊視野計算平均陽性百分比。

2 結 果

2.1 各組大鼠心肌組織病理形態學改變(HE染色) N組、Sham組肌纖維排列相對規則，細胞核呈橢圓形，間質未見明顯異常；I/R組心肌組織細胞嚴重破壞，心肌細胞間質明顯水腫、增寬，心肌纖維斷裂溶解；QGYML組與I/R組相比有明顯緩解，其中QGYMLH組改善更為明顯。見圖1。

圖1 各組大鼠心肌病理學變化(HE×400)

2.2 各組大鼠P-JNK表達的免疫組化結果 N組、Sham組未見顯著異常，肌纖維排列相對規則，細胞核橢圓形，間質未見明顯異常；I/R組心肌組織細胞嚴重破壞，心肌細胞間質明顯水腫、增寬，心肌纖維斷裂溶解；QGYML組與I/R組相比，細胞間質水腫現象明顯減輕，心肌纖維排列較為規則，其中QGYMLH組改善更為明顯。見圖2。

圖2 各組大鼠P-JNK表達的免疫組化結果(×400)

2.3 各組大鼠MMP-9、P-JNK表達比較 見表1。

組 別nMMP-9(ng/L)P-JNK(%)N組833.07162±1.4319690.78±0.03Sham組835.32275±1.163989*1.00±0.02*I/R組844.16338±1.353010△2.13±0.13△QGYMLL組841.24712±0.687672△#1.23±0.11△#QGYMLH組838.54413±1.286125△#○1.12±0.08△#○

與N組比較，*P>0.05，△P<0.05；與I/R組比較，#P<0.05；與QGYMLL組比較，○P<0.05

由表1可見，Sham組MMP-9、P-JNK表達水平與N組比較差異無統計學意義(P>0.05)；I/R組、QGYMLL組、QGYMLH組MMP-9、P-JNK表達水平均高于N組，差異有統計學意義(P<0.05)；QGYML組、QGYMLH組MMP-9、P-JNK表達水平均低于I/R組，差異有統計學意義(P<0.05)；QGYMLH組MMP-9、P-JNK表達水平低于QGYMLL組，差異有統計學意義(P<0.05)。

3 討 論

心肌的缺血再灌注損傷,尤其在急性心肌梗死通過經皮冠狀動脈介入術(PCI)治療后, 可能出現一系列病情惡化現象，患者可能表現為嚴重心功能不全、嚴重心律失常、心功能衰竭、心源性休克、猝死等[7]。可進一步發生心室重構, 嚴重者會引起心力衰竭、心臟破裂等嚴重并發癥，嚴重影響急性冠狀動脈綜合征的預后[8]。目前研究表明，心肌的缺血再灌注損傷與炎性介質密切相關。JNK家族是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)超家族成員之一，JNK信號通路可被多種因素激活，JNK的活化被認為其參與了細胞凋亡，其一旦被激活稱為P-JNK，則會由細胞質轉移到細胞核內，引起一系列作用底物的激活，與細胞凋亡密切相關[9]。JNK是一種具有多方面調節功能的蛋白激酶，在發生心肌缺血再灌注損傷時，JNK信號通路被激活，參與再灌注損傷時的炎性反應[10]。JNK蛋白激酶有3個基因編碼，其表達廣泛，在生理和病理過程中發揮重要作用[11]。MMPs是一組金屬蛋白酶家族，常以酶原的形式存在，主要參與細胞外基質的微環境的穩定，目前MMPs已經被證實參與多種病理及生理過程[12]。近來研究發現MMPs快速參與缺血再灌注損傷等氧化應激反應, 同時有研究發現其抑制劑能有效抑制心肌缺血再灌注后損傷的發生[13]。MMP-9又被稱為明膠酶B，是MMPs家族中的主要成員，目前研究發現血清中MMP-9濃度的增加與冠狀動脈事件發生的危險程度呈正相關。心肌缺血再灌注后組織表達MMP-9是心肌小血管管壁損傷,從而導致細胞水腫及炎性細胞浸潤的機制。在早期選擇性抑制MMP-9可顯著減輕心肌梗死面積[14]。

心肌缺血再灌注損傷屬中醫胸痹范疇，胸痹一名最早見于《內經》，屬本虛標實，病機關鍵為心脈攣急和閉塞，氣虛血瘀為該病的基本病機之一[15]。針對該病機，徐京育教授根據多年臨床經驗自擬中藥復方芪桂益脈靈。方中黃芪補氣升陽，益氣補心,能通行血脈，為治療氣滯血瘀型胸痹心痛的要藥；桂枝溫通經脈，助陽化氣；二者相互配伍，共為君藥以補心氣，通心脈。黨參益氣養血，助黃芪補氣養心行氣活血；三七活血止痛，化瘀養血，行血通脈；二者在補氣的基礎上，活血化瘀通脈，故為臣藥。五味子、炒酸棗仁、龍齒養心陰，斂心氣，麥冬滋陰為佐藥。又恐全方滋補太過，故以苦參、黃連佐制，清心火、安神為使。此外桂枝、五味子、龍齒、三七、黃連等均入心經，作為引經藥，引藥入心。本方著重扶正氣，助血運，提高機體抗缺血缺氧的能力。

本實驗結果顯示，缺血再灌注損傷后大鼠心肌組織中MMP-9和P-JNK表達明顯高于N組和Sham組，說明心肌的急性缺血再灌注能夠使炎癥因子釋放，JNK通路激活，也表明建模成功；芪桂益脈靈組MMP-9和P-JNK表達濃度明顯低于I/R組(P<0.05)，表明芪桂益脈靈能夠降低JNK的磷酸化水平，降低炎癥因子MMP-9的釋放，減輕心肌缺血再灌注心肌細胞凋亡，對缺血心肌有保護作用；而QGYMLH組的MMP-9和P-JNK表達水平較QGYMLL組更低，說明高劑量組更能降低受損心肌，對其保護作用更佳。本研究不僅可以證實MMP-9和P-JNK的表達與心肌受損程度相關，還證明了芪桂益脈靈在心肌缺血再灌注損傷后對心肌具有一定的保護作用。

綜上所述，芪桂益脈靈能夠很好地減輕缺血再灌注心肌組織MMP-9炎癥因子的釋放及JNK信號通路激活造成的影響，改善缺血心肌病理性改變，也進一步證實了芪桂益脈靈在急性心肌缺血中具有保護作用，對新藥的研究與開發提供了理論依據。

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(本文編輯：李珊珊)

Effects of Qigui-yimailing on the expression of matrix metalloproteinase-9 and c-Jun amino terminal protein kinasein in rats with myocardial ischemia reperfusion injury

ZHAOLong*,ZHANGChaoyue,XUJingyu.

*2014-GradeMasterofHeilongjiangUniversityofTraditionalChineseMedicine,Heilongjiang,Haerbin150040

Objective To observe the effects of Qigui-yimailing on the signal pathway of matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) and c-Jun amino terminal protein kinase (JNK) in rats with myocardial ischemia reperfusion injury. Methods 50 healthy male SD rats were randomly divided into normal group (N), sham-operated group (Sham), pure ischemia reperfusion group (I/R), high dose of Qigui-yimailing group (QGYMLH) and low dose of Qigui-yimailing group (QGYMLL), 10 rats each group, rats in last three group were received 0.9% sodium chloride injection, high and low dose of Qigui-yimailing respectively, continuously treatment for 7 d. The acute myocardial infarction model was established by ligating the left anterior descending coronary arteries. The blood was collected from the abdominal aorta, the upper serum was taken by centrifugal, and the expression of MMP-9 was measured by ELISA. The expression of phosphorylation c-Jun amino terminal protein kinase (P-JNK) from formalin-fixed myocardial tissue was measured by means of immunohistochemical staining. Results There were no statistical differences on the expressions of MMP-9 and P-JNK between Sham and N group (P>0.05).The expressions of MMP-9 and P-JNK in I/R, QGYMLL and QGYMLH group were higher than N group (P<0.05). The expressions of MMP-9 and P-JNK in QGYMLL and QGYMLH group were lower than I/R group (P<0.05). The expressions of MMP-9 and P-JNK in QGYMLH group were lower than QGYMLL group (P<0.05). Conclusion Qigui-yimailing has protective effect of myocardial ischemia-reperfusion injury, and its mechanism may be related with the degree of JNK phosphorylation, the MMP-9 expression and the dosage of drug.

Huangqi; Guizhi; Myocardial ischemia-reperfusion injury; Rats; JNK mitogen - activated protein kinases; Matrix metalloproteinases

10.3969/j.issn.1002-2619.2017.02.026

※ 項目來源：2013年度黑龍江省自然科學基金面上項目(編號：H201326)

趙龍(1990—)，男，碩士研究生在讀，學士。研究方向：心血管方向。

R285.5；R-33

A

1002-2619(2017)02-0264-05

2016-07-15)

△ 通訊作者：黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院心血管病四科，黑龍江 哈爾濱 150040