蟾毒靈對大鼠嗎啡成癮消退及其重建的影響

陳宇涵, 賴莉麗, 陳愛貞, 蔣元杰, 宋 夏, 楊 芳, 陳愛琴

蟾毒靈對大鼠嗎啡成癮消退及其重建的影響

陳宇涵1, 賴莉麗2, 陳愛貞1, 蔣元杰1, 宋 夏1, 楊 芳1, 陳愛琴2

目的 研究蟾毒靈在嗎啡成癮消退和重建中的藥理作用。 方法 大鼠隨機分為溶酶組和蟾毒靈組，每組各12只。腹腔注射鹽酸嗎啡并通過條件性位置偏愛裝置建立嗎啡成癮模型后，2組分別注射溶酶和蟾毒靈(0.6 mg/kg)并檢測其偏愛分值變化。 結果 蟾毒靈組在注射蟾毒靈后，偏愛分值降低，與后測值比較，差別有統計學意義(P<0.05)，而且效應持續3 d以上；溶酶組的偏愛分值與后測值比較，差別無統計學意義(P>0.05)。成癮消退后采用半劑量嗎啡注射重建嗎啡成癮，蟾毒靈組和溶酶組的偏愛分值比較，差別無統計學意義(P>0.05)。 結論 蟾毒靈可促進大鼠嗎啡成癮的消退，但不影響成癮消退后的重建。

腫瘤/*病理學； 腫瘤/*治療； 嗎啡依賴； 疾病模型，動物

藥物成癮的本質是一種慢性復發性腦病，形成機制復雜，目前的治療方法只能減輕軀體依賴，但不能解除心理依賴，而且療程結束后仍有相當高的復吸率。因此,探尋促進成癮消退、抑制復吸的藥物意義重大[1-2]。中藥提取物蟾毒靈目前多用于抗腫瘤領域。研究表明其是有效的Na+，K+-ATP酶抑制劑以及強效穩定的麻醉鎮痛劑[3-4]。本研究擬探討藥物成癮時蟾毒靈在戒毒領域的運用機制，為臨床用藥提供新的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 健康雄性SD大鼠36只，體質量(200±25)g，清潔級[福建醫科大學動物實驗中心,許可證號:SCXK(閔)2012-0001]。在光照14 h、黑暗10 h、室溫(25±1)℃條件下飼養，實驗期間自由飲水和攝食。

1.1.2 藥品與試劑 蟾毒靈(批號:P0512，福州市永恒生物技術有限公司)，臨用前用溶酶二甲基亞砜(DMSO)配成所需濃度；鹽酸嗎啡注射液(批號：131005-2，濃度10 mg/mL，東北制藥集團沈陽第一制藥有限公司)。

1.1.3 條件性位置偏愛實驗裝置 上海移數信息科技有限公司生產的條件位置偏愛系統(穿梭箱)。穿梭箱為三箱式，由2個隔板分為大小相同的2個條件訓練箱70 cm×30 cm×34 cm(長×寬×高)和一個中間箱(13 cm×22 cm×27 cm)，隔板放入時可將動物限制在某一個箱內，隔板取出時動物在整個穿梭箱內可以自由跑動。各箱的顏色和底板不同。一側的訓練箱四壁白色、底板為光滑的桿狀，另一側訓練箱四壁黑色，底板為網格狀，中間箱四壁灰色，底板為灰色樹脂玻璃，底板和箱內的光線可調。箱內裝有工業高清晰CCD攝像頭，清晰度為600線，視頻攝像系統既可在光亮條件下、也可在星光條件下，對動物進行連續的黑白攝像和分析。

1.2 方法

1.2.1 適應環境 將大鼠放入CPP箱體中讓其在各箱體中自由活動15 min，連續3 d，以減少實驗動物暴露于實驗裝置的新奇感與應激作用。

1.2.2 前測階段 記錄大鼠在每側箱體停留的時間，測定其自然偏愛側，非自然偏愛側為伴藥箱，結果所有大鼠均顯示對黑箱的偏愛，故選擇白箱為伴藥箱。以前測階段最后1天的偏愛分值作為前測值：

1.2.3 建立嗎啡成癮模型 選取前側階段偏愛暗箱的SD大鼠，前測試后的第1天開始為期5 d的條件訓練。采取counterbalance設計方式，即將SD大鼠中的一半與藥物搭配黑箱，另一半與藥物搭配白箱。嗎啡劑量為1 mL/kg(濃度10 mg/mL)，生理鹽水1 mL/kg，腹腔注射。每天上午半數大鼠注射嗎啡，半數注射生理鹽水，各自一半放白箱一半放黑箱，時間為45 min；上午注射嗎啡的大鼠晚上注射生理鹽水，上午注射生理鹽水的大鼠晚上注射嗎啡，上午放白箱的晚上放置于黑箱，上午放黑箱的晚上放置于白箱，時間均為45 min。上午和晚上2次注射時間間隔8 h以上。末次條件性訓練24 h后，把大鼠放在中間箱體中，15 min內允許其在2個側箱內自由活動，記錄動物在兩側箱體內分別停留的時間。測定其偏愛分值并與前測值比較。若大鼠表現出對伴藥側的偏愛且有顯著性差別，則確定已建立CPP嗎啡成癮模型。將未表現成癮的大鼠剔除。

1.2.4 分組并給藥 選取建立嗎啡成癮模型后的大鼠24只，隨機分為2組(n=12)。 蟾毒靈組：單次腹腔注射0.6 mg/kg蟾毒靈(溶酶為DMSO)；溶酶組：單次腹腔注射等劑量DMSO。給藥后的大鼠每天檢測1次偏愛分值。當溶酶組、蟾毒靈組大鼠的偏愛分值連續3 d和前測值比較，差別無統計學意義；與后側值比較，差別有統計學意義時，則判定大鼠進入成癮消退期，停止測試偏愛分值。

1.2.5 CPP模型重現測試 大鼠進入成癮消退期后，用藥物進行點燃測試(半劑量嗎啡腹腔單次注射)，5 min后把大鼠放在中間箱體中，15 min內允許其在兩個側箱內自由活動，由計算機自動記錄動物在兩個側箱體內分別停留的時間，計算偏愛分值，如果偏愛分值顯著高于消退期，而且差別有統計學意義則證明CPP模型重現。

1.3 統計學處理 結果以AV±SE表示，采用SPSS統計軟件處理，采用t檢驗及ANOVA法進行顯著性檢驗，P<0.05為差別具有統計學意義，并利用Graphpad prism軟件繪制圖表。

2 結 果

2.1 嗎啡誘導大鼠CPP效應的表達 注射嗎啡前，24只大鼠的偏愛分值前測值為(0.278 3±0.013 3)；經過5 d的嗎啡誘導訓練，偏愛分值為(0.690 8±0.013 3)，與前測值比較，差別有統計學意義(P<0.01)，提示嗎啡條件性位置偏愛成功建立，大鼠形成成癮記憶(圖1)。

2.2 蟾毒靈對大鼠嗎啡成癮消退的作用 蟾毒靈組大鼠偏愛分值顯著降低為(0.355 8±0.069 7)，而溶酶組偏愛分值為(0.648 3±0.046 5)，注射蟾毒靈后偏愛分值與前測值比較,差別有統計學意義(P<0.05)，而注射溶酶后偏愛分值與前測值比較差別無統計學意義(P>0.05)，提示蟾毒靈可抑制大鼠的成癮記憶(圖2)。

為觀測藥物效應，持續3 d檢測偏愛分值，蟾毒靈組大鼠偏愛分值分別為[(0.455 0±0.052 8),(0.430 8±0.065 8),(0.435 0±0.059 3)],與后測值比較差別有統計學意義(P<0.05，圖3)；溶酶組大鼠的偏愛分值分別為[(0.624 2±0.050 8),(0.631 7±0.047 1),(0.640 8±0.051 5)]，與后測值比較差別無統計學意義(P>0.05，圖4)。連續3 d蟾毒靈組偏愛分值均減低，提示蟾毒靈可促進大鼠嗎啡成癮記憶的消退。

與前測值比較，☆：P<0.01.圖1 嗎啡誘導大鼠位置偏愛效應的表達Fig 1 Expression of morphine-induced conditioned place preference

DMSO:二甲基亞砜. 與前測值比較，☆：P<0.05.圖2 蟾毒靈對大鼠位置偏愛消退的影響Fig 2 The effects of Bufalin to extinction of morphine-induced conditioned place preference

2.3 蟾毒靈組和溶酶組大鼠嗎啡成癮的消退 溶酶組大鼠在注射DMSO 11，12，13 d后，其偏愛分值分別為[(0.308 3±0.028 0),(0.320 0±0.022 5),(0.318 3±0.030 8)]，與前測值比較差別無統計學意義(P>0.05)，與后測值比較差別有統計學意義(P<0.05)，提示嗎啡成癮已消退；蟾毒靈組的偏愛分值一直維持在較低的水平，注射蟾毒靈10，11，12 d后，其偏愛分值分別為[(0.455 8±0.059 6),(0.345 0±0.065 8),(0.355 0±0.059 2)]，與前測值比較差別均無統計學意義(P>0.05)，與后測值比較差別有統計學意義(P<0.05)，提示蟾毒靈組與溶酶組大鼠嗎啡成癮均已完全消退(表1)。

2.4 蟾毒靈對半劑量嗎啡誘導大鼠CPP復燃的影響 大鼠CPP效應消退后，以半劑量嗎啡和伴藥箱作為引燃刺激，以探討蟾毒靈是否影響成癮消退后的重建。無論是蟾毒靈組還是溶酶組，半劑量注射嗎啡后，偏愛分值明顯增加[(0.560 8±0.040 4)，(0.699 2±0.031 9)]，與注射前的偏愛分值比較，差別有統計學意義(P<0.05)，提示2組半劑量嗎啡均成功重建嗎啡成癮。此外，點燃后2組之間的偏愛分值比較，差別無統計學意義(P>0.05)，提示蟾毒靈對嗎啡成癮消退后的重建無明顯抑制作用(圖5)。

與后測值比較,☆:P<0.05.圖3 蟾毒靈促進大鼠嗎啡成癮消退的持續時間Fig 3 The duration of Bufalin facilitates extinction of morphine-induced conditioned place preference

DMSO:二甲基亞砜.圖4 注射溶酶后大鼠偏愛分值的變化Fig 4 The changes of preference value after injection DMSO

表1 蟾毒靈組和溶酶組大鼠在嗎啡成癮消退階段的偏愛分值

Tab 1 The preference value of group bufalin and group DMSO in morphine-induced conditioned place preference extinction phase

時 間偏愛分值蟾毒靈DMSO前測值0．2783±0．01330．2783±0．0133后側值0．6908±0．01330．6908±0．0133注射10d后0．4558±0．0596☆0．5752±0．0327注射11d后0．3450±0．0658☆0．3083±0．0280☆注射12d后0．3550±0．0592☆0．3200±0．0225☆注射13d后0．3183±0．0308☆

DMSO:二甲基亞砜. 與后測值比較，☆：P<0.05.

DMSO:二甲基亞砜. 與后測值比較，☆：P<0.05；與消退期偏愛分值比較，#：P<0.05.圖5 蟾毒靈對大鼠嗎啡成癮消退后重建的影響Fig 5 The effects of Bufalin to the reinstatement of morphine-induced conditioned place preference

3 討 論

本實驗以CPP建立大鼠嗎啡成癮模型，以半劑量嗎啡腹腔注射點燃，研究蟾毒靈對大鼠嗎啡成癮消退和重建的影響。蟾毒靈組單次腹腔注射蟾毒靈(0.6 mg/kg)，對照組單次注射同等劑量的DMSO，比較偏愛分值的變化。結果表明,蟾毒靈可促進大鼠嗎啡成癮的消退，但不影響消退后嗎啡成癮的重建。

在藥物成癮的研究中，CPP模型是應用巴甫洛夫條件反射的原理，把藥物與環境刺激反復結合后，動物會表現出對伴藥環境(伴藥箱)的偏愛，把藥物的獎賞效應與伴藥箱聯系起來，表明大鼠形成了成癮記憶。成癮記憶是藥物成癮牢固性和持續性及高復吸率的關鍵機制[5]。

本研究觀察到大鼠嗎啡成癮后腹腔內單次注射蟾毒靈，可降低大鼠CPP的偏愛分值，促進成癮記憶的消退。蟾毒靈是中藥蟾酥的藥理成分之一，目前多用于抗腫瘤領域，有研究表明其是有效的Na+，K+-ATP酶抑制劑[3]。Hazelwood等發現，Na+，K+-ATP酶影響中樞DA系統的功能[6]。藥物成癮的機制研究表明，中腦腹側被蓋區(ventral tegmental area,VTA)腦內多巴胺(dopamine,DA)的增多是致使嗎啡成癮的原因之一，藥物通過激活中腦邊緣的多巴胺系統促進DA的釋放，從而產生獎賞效應，致使藥物成癮[7-8]。因而，筆者推測蟾毒靈可能通過抑制Na+，K+-ATP酶的活性，影響到大腦獎賞通路多巴胺的功能，促進嗎啡成癮的消退。

研究表明，蟾毒靈具有平穩的鎮痛麻醉作用，其鎮痛效果是可卡因的30～60倍，且無局部刺激作用，其作用機理與肌細胞緩慢釋放乙酰膽堿有關[4]。現有的中樞乙酰膽堿和藥物成癮的研究進展表明，乙酰膽堿對VTA投射到伏隔核的獎賞投射通路具有調節作用，膽堿能神經參與了藥物的獎賞和自身給藥行為[9]。Rezayof等發現，腦內微量注射膽堿能抑制劑能顯著抑制嗎啡或可卡因誘導的CPP及自發活動[10]。故蟾毒靈對大鼠嗎啡成癮消退的促進作用也可能是通過作用于中樞膽堿能神經，影響乙酰膽堿的釋放，從而實現對藥物獎賞和自身給藥行為的調節。當然，由于阿片類藥物成癮機制非常復雜，涉及多系統多靶點的變化，蟾毒靈是否通過多個靶點發揮抗嗎啡依賴與促進成癮消退的作用及主要的作用靶點有哪些，尚需進一步的實驗研究。

藥物成癮后復吸率居高不下，可能與成癮記憶的牢固持久有關。實驗大鼠成癮記憶一旦形成后，將失去對藥物的控制，藥物戒除后，成癮記憶仍處于潛伏狀態；當重新暴露于藥物或其他相關環境后，成癮記憶很容易被喚起[11]。蟾毒靈可促進嗎啡成癮記憶的消退，然而本研究未觀察到其對嗎啡成癮消退后重建的抑制，提示成癮記憶并未被蟾毒靈完全擦除。下一階段筆者擬通過多次注射蟾毒靈來進一步探究其對藥物成癮復吸的影響。

綜上所述，蟾毒靈可以促進大鼠嗎啡成癮的消退，為今后精神藥物及毒品戒斷研究提供理論依據。由于蟾毒靈還具有強效的鎮痛作用，理論上支持與嗎啡等具有依賴性的鎮痛藥物臨床聯合使用，在優化鎮痛效應的同時預防藥物成癮，這也為臨床用藥提供了新的思路。

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(編輯:張慧茹)

The Effects of Bufalin on Extinction and Reinstatement of Morphine Addictive Rats

CHEN Yuhan1, LAI Lili2, CHEN Aizhen1, JIANG Yuanjie1, SONG Xia1, YANG Fang1, CHEN Aiqin2

1. Department of Clinical Medicine, Fujian Medical University, Fuzhou 350122,China; 2. Department of Physiology and Pathology Physiology, Basic Medical Sciences, Fujian Medical University, Fuzhou 350122,China

Objective To study the pharmacological actions of bufalin on extinction and relapse of morphine addictive rats. Methods We established the rat models of morphine addiction by using conditioned place preference. To explore the effects of bufalin on extinction and reinstatement of morphine addictive rats, the rats in the experimental group were given a single peritoneal injection of bufalin (0.6 mg/kg) after addiction while the control group only received an injection of same amount of DMSO. Results The preference value decreased significantly compared with the post-test value(P<0.05) after bufalin injection and the effects lasted at least 3 days. However, the preference value of the control group didn’t change significantly after injection of DMSO. Then half-dose of morphine was injected to reinstate conditioned place preferences after extinction. The results indicted both groups produced reinstatement and there was no significant difference between the bufalin group and the DMSO group. Conclusion Bufalin promotes the extinction of morphine addictive rats, while it does not affect half-dose of morphine reinstatement.

neoplasms/*pathology；neoplasms/*therapy；morphine dependence；disease models, animal

2016-09-13

國家自然科學青年基金(81100998)；福建省自然科學基金(2016J01364)；國家級大學生創新創業訓練計劃項目(201510392008)

福建醫科大學,福州 350122 1.臨床醫學部；2.基礎醫學院 生理學與病理生理學系

陳宇涵,男,福建醫科大學2013級臨床醫學專業學生

陳愛琴. Email:jesseaqc@163.com

R332； R730.1； R730.2； R730.5

A

1672-4194(2017)01-0006-04