一株牛源肺炎克雷伯氏菌的分離鑒定與耐藥基因型檢測

蒙正群，冷依伊，任梅滲，劉亞東，王 印，2，姚學萍，楊澤曉，*

(1.四川農業大學 動物醫學院，四川 溫江 611130； 2.動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，四川 溫江 611130)

一株牛源肺炎克雷伯氏菌的分離鑒定與耐藥基因型檢測

蒙正群1，冷依伊1，任梅滲1，劉亞東1，王 印1，2，姚學萍1，楊澤曉1，*

(1.四川農業大學 動物醫學院，四川 溫江 611130； 2.動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，四川 溫江 611130)

從病死犢牛肺臟組織中分離到一株革蘭陰性短桿菌，進行了細菌分離純化、生化試驗、16SrDNA測序鑒定、小鼠致病性試驗、藥敏試驗，及碳青霉烯類酶與產超廣譜β-內酰胺酶(ESBLs)等7種耐藥基因的PCR檢測。結果鑒定該菌為肺炎克雷伯氏菌，其16S rDNA擴增序列與GenBank中肺炎克雷伯氏菌同源性達99%。對小鼠致病性強。該菌分離株對氨芐西林、頭孢呋辛、復方新諾明、紅霉素耐藥，而對碳青霉烯類、第四代頭孢等受試藥物均為敏感。耐藥基因PCR檢測僅擴增出約862 bp的SHV基因片段，與公布的SHV-1基因序列同源性達99.3%。該牛源克雷伯氏菌分離株耐藥表型與耐藥基因檢測結果一致。

肺炎克雷伯氏菌；分離鑒定；耐藥基因

肺炎克雷伯氏菌為腸桿菌科克雷伯氏菌屬的條件致病性革蘭陰性桿菌。該菌在人和動物腸道、呼吸道，以及外界環境中廣泛存在，當人和動物機體免疫力下降時，可引起肺炎、呼吸道感染、泌尿系統感染、腹膜炎，甚至菌血癥、敗血癥等[1]。近年來，該病在全世界范圍內廣泛流行，耐藥性嚴重，且多為多重耐藥，在大多數研究報告中該菌對碳青霉烯類，β-內酰胺類抗生素具有耐藥性，對碳青霉烯類的耐藥性主要是產生碳青霉烯酶(Klebsiellapneumoniaecarbapenemases， KPC)，同時產超廣譜β-內酰胺酶，導致其對β-內酰胺類抗生素產生了廣泛的耐藥性，從而為該病的治療造成了很大的困難，在臨床上引起了高度的關注[2-5]。

2016年3月，四川溫江區某牛場送檢一頭病死30日齡犢牛，主述出現發熱、食欲減退癥狀，第2天呼吸道癥狀加重，經磺胺類藥物治療未見好轉，次日死亡。臨床檢查無明顯癥狀，解剖可見肺臟出現水腫和肉變區，其他組織器官未見明顯病變，疑似為克雷伯氏菌肺炎。為此，本試驗采用常規微生物學實驗技術，通過純化分離、生化試驗、16S rDNA擴增測序、動物試驗、藥敏試驗及7種耐藥基因的PCR擴增分析，對臨床送檢疑似克雷伯氏菌感染的病死犢牛肺臟組織中細菌進行了檢測，以期為臨床上肺炎克雷伯氏菌病的防治與耐藥性相關研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑和儀器

營養瓊脂培養基、麥康凱瓊脂培養基、微量生化反應管、碳青霉烯類抗生素藥敏紙片、頭孢吡肟、頭孢匹羅、頭孢噻吩、四環素、萘啶酸、呋喃妥因、氨曲南購自溫州市康泰生物科技有限公司，其他藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司。2×Taq PCR MasterMix、凝膠回收試劑盒、大腸埃希菌感受態DH5α等均購自天根生化科技(北京)有限公司。頭孢菌素β-內酰胺酶(AmpC酶)、DHA-1陽性豬肺炎克雷伯氏菌系本實驗室保存，pMD19-T載體購自寶生物(大連)有限公司。

1.1.2 病料和試驗動物

病死犢牛肺臟組織來自四川溫江某牛場；健康小鼠購自四川大學華西實驗動物中心。

1.1.3 引物

參照文獻[6-8]，設計細菌16S rDNA 基因通用引物P1/P2，常見耐受碳青霉烯類藥物的耐藥基因KPC、OXA-48、NDM-1和引起耐受青霉素、單酰胺類(氨曲南)、β-內酰胺類抗生素相關酶的耐藥基因CTX-M1、TEM、SHV、DHA-1等7種耐藥基因的PCR擴增引物P3～P16(表1)，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，按照說明書稀釋至10 μmol·L-1，-20 ℃保存備用。

表1 試驗用引物序列

Table 1 Primer sequences used in this experiment

基因名稱Genename引物序列Primersequence(5’-3’)片段長度Productslength/bp擴增基因名稱Amplifiedgenename16SrDNAP1:AGTTTGATCCTGGCTCAG1500細菌鑒定P2:TTACCTTGTTACGACTBacterialidentificationKPCP3:ATCGCCGTCTAGTTCTGC638碳青霉烯酶P4:GTGTTTCCCTTTAGCCCarbapenemaseOXA-48P5:GGTGGCATCGATTATCGG743碳青霉烯酶P6:GCACTTCTTTTGTGATGGCCarbapenemaseDHA-1P7:CTTTCACAGGTGTGCTGGGT405產頭孢菌素β-內酰胺類酶P8:GTACGCATACTGGCTTTGCAmpCbeta-lactamaseCTX-M1P9:GCGCTTTTGCCGTCGTCTAAG944產超廣譜β-內酰胺類酶P10:CCATGGTTAAAAAATCACTGCExtendedSpectrumbeta-lactamasesNDM-1P11:TTGGCGATCTGGTTTTC621碳青霉烯類酶P12:AATGGCTCATCACGATCCarbapenemaseTEMP13:AAATTCTTGAAGAC1075產超廣譜β-內酰胺類酶P14:CCAATGCTTAATCAExtendedSpectrumbeta-lactamasesSHVP15:CGTTATATTCGCCTGTG862產超廣譜β-內酰胺類酶P16:GCGTTGCCAGTGCTCGExtendedSpectrumbeta-lactamases

1.2 方法

1.2.1 培養基制備

5%血平板、麥康凱培養基、普通平板等均按照文獻[9]中方法配制。凝固后用保鮮膜包好放于4 ℃備用。

1.2.2 細菌的分離純化

采集病理剖檢有典型病理變化的組織，無菌操作，接種于血平板進行分離培養，37 ℃恒溫培養18～24 h，同時采集病料進行厭氧培養。對各培養條件下細菌菌落進行觀察，將分離株純培養細菌經革蘭氏染色鏡檢，觀察細菌的個體形態及染色特征，然后接種于麥康凱培養基觀察其培養特征。

1.2.3 生化試驗

將以上純培養得到的細菌接種于普通營養瓊脂中培養24 h，按常規方法將菌液接種微量生化管進行生化試驗。

1.2.4 16S rDNA 基因鑒定

以純培養細菌染色體DNA為模板，擴增16S rDNA基因片段。反應體系25 μL：2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL，P1、P2各1.0 μL，模板2.0 μL，反應條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，30個循環；72 ℃ 10 min。PCR產物經10 g·L-1的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并純化回收目的片段，由擎科生物技術有限公司測序。

1.2.5 小鼠致病性實驗

按照參考文獻[10]的方法進行小鼠致病性試驗，將挑純菌株接種普通培養基培養24 h后，以無菌生理鹽水沖洗菌苔，采用麥氏比濁法測定菌液濃度后稀釋至1×108cfu·mL-1。將8只小鼠隨機分為2組，每組4只，每只腹腔注射菌液0.2 mL測定其致病力，對照組注射0.2 mL生理鹽水。

1.2.6 藥敏試驗

采用KB紙片擴散法進行藥敏試驗，參照《全國臨床檢驗操作規程》及CLSI《抗菌藥物敏感性試驗標準》2013版，按抑菌圈直徑大小和各抗菌藥的具體標準評定為敏感、中介和耐藥。

1.2.7 耐藥基因PCR檢測

以分離菌株的純培養物為模板， 用各種耐藥基因引物(表1)進行7種耐藥基因的PCR檢測，同時以實驗室保存DHA-1陽性豬肺炎克雷伯氏菌菌株為檢測對照。反應體系25 μL：2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL，上下游引物各1.0 μL，模板2.0 μL，PCR 反應條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個循環；72 ℃ 10 min。PCR產物經10 g·L-1的瓊脂糖凝膠電泳檢測。將擴增出的特異性DNA條帶進行膠回收，連接轉化，將產物送至生物工程公司進行測序。將測序結果進行BLAST分析。

2 結果與分析

2.1 細菌的分離純化

細菌在血平板和普通瓊脂培養基上為中等大小的菌落，半透明，灰白色，圓凸，閃光，豐富而黏稠，有一部相互交融、表面濕潤的光滑型菌落，拉動成絲線狀。在麥康凱平板上生長形成隆起大而黏液樣粉紅色菌落，經革蘭染色鏡檢顯示為革蘭陰性短球桿狀，如圖1所示。

2.2 生化鑒定

以無菌生理鹽水沖洗菌苔，將菌液接種于生化管中進行生化鑒定，培養特性結果顯示，該菌可以發酵多種糖類，產酸或同時產氣，不產生H2S，可分解尿素，利用枸櫞酸鹽等，為兼性厭氧發酵型無運動能力的革蘭陰性桿菌(表2)，與克雷伯氏菌的生化特征相一致[11]，初步鑒定為牛源肺炎克雷伯氏菌。

2.3 16S rDNA鑒定

挑取純培養的菌落進行PCR擴增測序，分離株的16S rDNA 擴增結果經瓊脂糖凝膠電泳，片段約1 500 bp，與預期目的片段大小一致(圖2)。將純化回收的目的片段測序結果(已提交GenBank，登錄號KX237750)經BLAST分析比對，顯示該菌株16S rDNA 基因部分序列與肺炎克雷伯氏菌同源性達99%，結合培養特性和生化實驗結果，鑒定該菌為牛源肺炎克雷伯氏菌，并命名為CK2016。

圖1 分離菌株的革蘭染色Fig.1 Gram staining of isolated strain

表2 生化鑒定結果

Table 2 Result of biochemical tests

底物Substrate結果Result底物Substrate結果Result葡萄糖Glucose精氨酸Arginine-麥芽糖Maltose甘露醇Mannitol蔗糖Sucrose丙二酸鹽Malonate+乳糖Lactose苯丙氨酸Phenylalanine-硫化氫Hydrogensulfide-水楊酸Salicylicacid+黏液酸Mucusacid-衛矛醇Dulcite-山梨醇Sorbitol鼠李糖Rhamnose+阿拉伯糖Arabinose纖維二糖Cellobiose枸櫞酸鈉Sodiumcitrate+蕈糖Mushroomsugar尿素Urea+鳥氨酸Ornithin+蜜二糖Melibiose半乳糖Galactose+七葉苷Esculoside氰化鉀Editpotassiumcyanide+

“⊕”表示產酸產氣；“+”表示產酸；“-”表示陰性。

“⊕” represented producing acid and gas; “+” represented producing acid; “-” represented negative.

M，DL2000 marker；1，分離株16SrDNA ；2，陰性對照M， DL2000 marker; 1， 16S rDNA of isolated strain; 2， Negative control圖2 分離株16S rDNA 基因擴增電泳圖譜Fig.2 Electrophoresis diagram of 16S rDNA gene amplification products of isolated strain

2.4 小鼠致病性試驗

感染組小鼠于接種4 h后，開始表現出精神沉郁，在接種后24 h 內全部死亡。剖檢小鼠組織病變表現為肝臟腫脹，邊緣瘀血，脾臟腫大充血，剖檢后取內臟器官進行細菌的分離，通過革蘭染色鏡檢、生化試驗和16S rDNA PCR 法鑒定， 結果與犢牛病變組織中分離到的細菌一致，對照組無異常反應。

2.5 藥敏試驗結果

按照1.2.6節操作進行分離菌株的藥物敏感性檢測，結果如表3所示，該菌對亞胺培南、美培南、頭孢匹羅等大部分的抗生素敏感，對氨芐西林、頭孢呋辛、復方新諾明以及紅霉素耐藥。對萘定酸、頭孢噻吩、氧氟沙星表現為中敏。

表3 藥敏試驗結果

Table 3 Result of antimicrobial susceptibility

藥物Drug劑量Doses/μg抑菌直徑Bacteriostaticdiameter/mm敏感程度Sensitivelevel丁胺卡那Amikacin3021S頭孢他啶Ceftazidime3021S氨芐西林Principen1000R諾氟沙星Norfloxacin1030S環丙沙星Ciprofloxacin531S慶大霉素Gentamicin1023S亞胺培南Imipenem1024S美羅培南Meropenem1025S厄他培南Ertapenem1026S萘啶酸Nalidixan3018I呋喃妥因macrodantin30018S頭孢匹羅Cefpirome3025S氨曲南Aztreonam3028S頭孢吡肟Cefepime3026S四環素Tetracycline3019S頭孢噻吩Cephalothin3020I紅霉素Erythromycin)1513R氧氟沙星Ofloxacin)513I頭孢氨芐Cephalexin)3020S復方新諾明Co-trimoxazole2513R頭孢呋辛Cefuroxime258R哌拉西林Piperacillin10025S米諾環素Minocycline3021S

S表示敏感；I表示中介；R表示耐藥。

S represented sensitive; I represented intermediary; R represented resistance.

2.6 耐藥基因檢測

按照1.2.7節操作進行分離菌株7種耐藥基因的PCR檢測，結果如圖3所示，僅SHV基因擴增陽性，在862 bp左右出現預期大小DNA條帶(泳道7)，其DNA片段的測序結果BLAST分析顯示與NCBI中公布的SHV-1基因序列(登錄號：X98098)同源性達到99.3%；DHA-1基因型的檢測產物在245 bp左右雖出現一特異性DNA條帶(圖3泳道5和圖4泳道2)，而DHA-1陽性豬肺炎克雷伯氏菌菌株擴增出405 bp大小DNA條帶，二者大小不同。將其DNA擴增條帶的序列測定進行BLSAT分析，DHA-1陽性對照菌株擴增的DNA序列與已公布DHA-1基因序列(登錄號：AY635140)同源性比對達97.2%以上，而菌株CK2016擴增的DNA片段與克雷伯氏菌染色體上基因序列同源性達99%以上。為比較二者序列差異，分別登錄NCBI調取3條DHA-1靶基因序列KJ135976、KJ135977 和KJ135990，以及與菌株CK2016擴增的DNA片段同源性99%的克雷伯氏菌基因序列CP003200、CP003999、CP006648進行比對，結果如圖5所示，該克雷伯氏菌擴增基因片段與耐藥基因DHA-1靶基因片段出現大量缺失，同源性僅有30%左右，提示菌株CK2016的耐藥基因DHA-1陰性。加之碳青霉烯類酶基因、TEM-1和CTX-M1等其他5種耐藥基因的PCR擴增均為陰性(圖3泳道1-6)，表明該牛源克雷伯氏菌菌株CK2016只有SHV-1耐藥基因，與藥敏試驗的結果基本一致。

M， DL2000 marker；1、2、3、4、6分別是KPC，CTX-M1，OXA-48，NDM-1，TEM-1；5和7分別是DHA-1(245 bp)，SHV-1(860 bp)M : DL2000 marker; 1， 2， 3， 4， 6 were KPC， CTX-M1, OXA-48， NDM-1， TEM-1， respectively; 5 and 7 were DHA-1(245 bp)， SHV-1(860 bp)圖3 基因PCR擴增電泳Fig.3 Electrophoresis diagram of resistance genes amplification

M，DL2000 marker；1，犢牛分離株(245 bp)；2，豬分離株(405 bp)；3，陰性對照M， DL2000 marker; 1， Strain from calf (245 bp); 2， Strain from swine (405 bp); 3， Negative control圖4 兩株克雷伯氏菌DHA-1 PCR產物電泳圖Fig.4 Electrophoresis diagram of amplification results of two Klebsiella pneumonia strains

3 討論

近年來克雷伯氏菌在人醫臨床上是僅次于大腸埃希菌的條件性致病菌，而且隨著抗生素的大量使用，使該菌變異產生各種抗生素水解酶，對于其治療的首選藥物碳青霉烯類抗生素產生廣泛的耐藥性，使得該病的治療非常棘手[12]。在很多感染克雷伯氏菌的病例報道中，主要是引起肺炎、呼吸道感染、腹膜炎等，奶牛則主要引起乳房炎[13]。本研究根據純化培養結果、鏡檢觀察，以及生化鑒定結果，可以初步認定其為克雷伯氏菌，再通過16S rDNA擴增測序從而確證該病原菌為肺炎克雷伯氏菌，小鼠致病性實驗顯示，該菌的致病性強，提示犢牛死亡可能與該菌密切相關，加之藥敏試驗顯示該菌株對復方磺胺等藥物耐受，這與用藥后病情最終未得到控制相符合。

*為擴增245 bp基因片段測序* indicated 245 bp fragment of amplified gene sequence圖5 DHA-1基因序列及克雷伯氏菌擴增序列Align分析結果Fig.5 Align analysis of DHA-1 gene sequences and amplified Klebsiella pneumoniae gene sequences

SHV為細菌的質粒介導，是巰基變量(sulphydryl variable)的縮寫，為ESBLs的一種基因型，可通過傳導、轉化、轉座、結合轉移和整合等方式將耐藥性在同種或不同種細菌間傳播和擴散，而且其耐藥基因編碼位點往往與喹諾酮類、氨基糖苷類和磺胺類藥物耐藥基因相近而導致多藥耐性。該酶類主要水解β-內酰胺類抗生素，如青霉素、頭孢、單環酰胺類等[14-15]。同時在肺炎克雷伯氏菌中也有染色體介導的SHV-1型基因，該基因所編碼的酶不僅可以水解廣譜β-內酰胺類抗生素，還可以水解亞胺培南[16]。本研究經PCR檢測擴增出了SHV-1耐藥基因，這與該菌耐受氨芐西林、頭孢呋辛等藥物相一致。AmpC酶編碼基因存在于大多數細菌的染色體上，但肺炎克雷伯菌出現質粒介導的AmpC酶，國內以DHA-1基因型為主[17]，該類基因介導的水解酶主要對一代到三代頭孢、氨曲南等藥物水解作用強，該耐藥基因可以通過質粒的復制、轉化以及一些轉座元件的轉移，使得耐藥基因可以在種屬內(間)類擴散[18]。本研究進行DHA-1 的PCR檢測時直接取培養菌液為模板，避免了提取DNA和抽提質粒，結果未擴增出預期大小基因條帶，表明該菌不存在DHA-1耐藥基因，這與該菌株對頭孢匹羅、頭孢他啶、亞胺培南等藥物敏感的表型也是符合的。值得說明的是，將擴增出克雷伯氏菌的非預期大小DNA條帶與DHA-1耐藥基因靶片段序列進行分析顯示，二者存在約30%的同源性，DHA-1耐藥基因靶片段序列更長，從敏感菌株到DHA-1耐藥基因形成是否通過插入突變和點突變形成，抑或通過缺失突變能否將耐藥菌株耐藥性去除將是非常讓人感興趣的問題。

肺炎克雷伯氏菌作為醫院細菌感染的重要成員，且隨著耐藥基因的變體增加，多重耐藥嚴重，同時質粒介導類的耐藥基因在種類間的轉移，使得耐藥基因很容易擴散，已成為臨床工作中不容忽視的問題。人醫臨床上，抗生素使用種類多，碳青霉烯類常作為治療該菌感染的首選藥物，所以人醫臨床上有大量的耐藥性研究報道。而本研究分離的克雷伯氏菌對大部分碳青霉烯類、第四代頭孢等敏感抗生素敏感，宏觀上講很可能與獸醫臨床上相關抗生素尤其是碳青霉烯類抗生素使用較少相關。這從一個側面說明在獸藥管理和使用方面，應嚴防人藥用于畜禽養殖。總之，本研究通過細菌分離鑒定、藥敏試驗和耐藥基因的檢測對該例犢牛死亡的原因進行了細菌學檢測與耐藥表型和基因分析，為克雷伯氏菌感染的臨床用藥提供了科學參考，也為克雷伯氏菌耐藥機理的相關研究提供了科學材料。

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(責任編輯 盧福莊)

Isolation， identification and drug resistance detection of a calfKlebsiellapneumoniaestrain

MENG Zhengqun1， LENG Yiyi1， REN Meishen1， LIU Yadong1， WANG Yin1，2， YAO Xueping1，YANG Zexiao1，*

(1.CollegeofVeterinaryMedicine，SichuanAgriculturalUniversity，Wenjiang611130，China; 2.KeyLaboratoryofAnimalDiseaseandHumanHealthofSichuanProvince，Wenjiang611130，China)

A gram-negative bacillus was isolated and purified from the lung of a died calf， and was identified by morphological and cultured characteristics， biochemical tests， 16S rDNA gene sequencing， pathogenicity tests， and drug sensitivity tests. Then its drug-resistance genes were detected and analyzed by PCR methods using 7 pairs of primers for drug-resistance genes that produce carbapenemase and extended-spectrum β-lactamase (ESBLs) etc. The results showed that this isolate was identified as cow-derivedKlebsiellapneumoniae， which was pathogenic to mice. Its 16S rDNA gene sequence shared 99% homology withKlebsiellapneumoniaegene sequences published in GenBank. The isolate was highly resistant with penbritin， cefuroxime， co-trimoxazole and erythromycin， while sensitive to the gross antibiotics such as carbapenems and the fourth generation cephalosporin. A resistance gene fragment about 862 bp in the length ofSHVgene was amplified by PCR， which had a 99.3% homology with publishedSHV-1 gene sequences in GenBank. The cow-derivedKlebsiellapneumoniaestrain had strong virulence and drug-resistance， and its drug-resistant phenotype was consistent with the drug-resistant testing results.

Klebsiellapneumoniae; isolation and identification; drug resistance genes

http://www.zjnyxb.cn

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.04.03

2016-10-26

“十二五”國家科技支撐計劃(2013BAD12B04)；四川農業大學學科建設雙支計劃(03571806)

蒙正群(1992—)，女，貴州甕安人，碩士研究生，研究方向為預防獸醫學。E-mail: m15983544718_1@163.com

* 通信作者，楊澤曉，E-mail: yzxyang2003@126.com

S858.23；S855.1+2

A

1004-1524(2017)04-0534-08

浙江農業學報ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2017，29(4): 534-541

蒙正群，冷依伊，任梅滲，等. 一株牛源肺炎克雷伯氏菌的分離鑒定與耐藥基因型檢測[J]. 浙江農業學報，2017，29(4): 534-541.