冷鮮雞污染微生物磺胺類和喹諾酮類耐藥基因分析

何祥祥，楊 華，戴寶玲，夏效東，肖英平，*

(1.西北農林科技大學 食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100； 2.浙江省農業科學院 農產品質量標準研究所，浙江 杭州 310021； 3.浙江省植物有害生物防控省部共建國家重點實驗室培育基地，浙江 杭州 310021)

冷鮮雞污染微生物磺胺類和喹諾酮類耐藥基因分析

何祥祥1，2，3，楊 華2，3，戴寶玲2，3，夏效東1，肖英平2，3，*

(1.西北農林科技大學 食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100； 2.浙江省農業科學院 農產品質量標準研究所，浙江 杭州 310021； 3.浙江省植物有害生物防控省部共建國家重點實驗室培育基地，浙江 杭州 310021)

動物養殖業的發展過程中抗生素的長期使用，導致耐藥菌的快速發展。這些耐藥菌在動物養殖過程中逐漸被抗生素篩選，在動物性食品生產鏈中容易被攜帶傳播，對人類食品安全產生很大的威脅。試驗選取浙江省紹興市8個大型超市和11個農貿市場銷售的冷鮮雞為檢測對象，采用PCR和測序驗證的技術手段，對冷鮮雞表面微生物中的2種磺胺類耐藥基因sulⅠ、sulⅡ和8種喹諾酮類基因qnrA、qnrB、qnrC、qnrD、qnrS、qepA、oqxA與oqxB進行檢測。在所檢測的樣品中，檢測出sulⅠ、sulⅡ、qnrD、qnrS、qepA和oqxB基因，檢出率分別為100%、100%、100%、89.5%、100%和89.5%。并對所檢出的耐藥基因進行測序和NCBI收錄的耐藥基因序列進行Blast比對驗證，比對結果同源性分別為100%、99.44%、100%、92.74%、99.82%和100%。試驗結果將為冷鮮雞中耐藥基因的風險評估提供有力支持。

冷鮮雞；細菌；磺胺類；喹諾酮類；耐藥基因

目前國內多數城市如上海、北京和杭州已經全面禁止活禽買賣交易[1]，冷鮮雞因其肉質純熟，適合烹飪和口味鮮美的特點代替了“活殺雞”走向百姓的餐桌[2]。然而，在禽類養殖中抗生素的普遍使用引起了人們較大的關注[3-6]。抗菌藥物在歐洲[7-8]和北美[9]已經被廣泛使用了近半個世紀，在提高肉制品產量的同時也導致了細菌耐藥性的產生[10-11]。例如Yildirim等[12]在200份零售的冷鮮雞中分離出68株沙門氏菌，通過對耐藥基因的檢測，這些沙門氏菌對青霉素、苯唑西林、克林霉素、萬古霉素、紅霉素和氨芐西林等抗生素具有不同程度的耐藥性，同時也有半數以上的沙門氏菌對四環素、鏈霉素、新霉素和頭孢霉素產生耐藥性。動物性食品中耐藥性基因的出現引起了人們的極大關注，因為耐藥性基因是通過可移動的介質比如質粒、轉座子或染色體[13-14]來傳播，另外抗生素耐藥基因也可以在細菌之間相互傳播[15]。冷鮮雞在從養殖到宰殺、運輸儲藏再到消費者餐桌上[16-17]的過程的產業鏈中也會攜帶大量的耐藥細菌，對食品安全和人們的健康將產生很大的威脅[18]。

本試驗從浙江紹興市19個不同的農貿市場和超市分別采冷鮮雞，然后通過直接提取表面微生物的DNA，通過PCR擴增耐藥基因的方法，檢測總細菌的耐藥性。試驗結果將為冷鮮雞表面微生物的耐藥監測提供有力依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品來源

19只冷鮮雞樣品于2016年8月6日采自浙江省紹興市的8個大型超市和11個農貿市場，編號為1～19。

1.1.2 儀器與試劑

PCR擴增儀(美國bio-rad公司)，凝膠成像系統(美國bio-rad公司)，微量核酸蛋白分析儀(Thermo Fisher公司)。BPW培養基(杭州微生物試劑有限公司)，微生物基因組DNA提取試劑盒(Zymo Research Fungal/Bacterial DNA MiniPrepTM)。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理

將從市場上采集來的冷鮮雞放置于無菌袋中，按照每500 g冷鮮雞加入500 mLBPW沖洗液，密封后于搖床上振蕩(200 r·min-1)15～20 min，然后取50 mL沖洗下來的BPW溶液于37 ℃烘箱，培養12 h。

1.2.2 基因組DNA提取

將增菌后的BPW沖洗液按照微生物基因組DNA提取試劑盒(Zymo Research Fungal/Bacterial DNA MiniPrepTM)說明書，提取總細菌DNA。然后用微量核酸蛋白質分析儀(Nanodrop)對所提取的DNA進行含量和純度(D260/D280)的測定。

1.2.3 耐藥基因的PCR擴增

本試驗從磺胺類和喹諾酮類耐藥基因中共選取了10種耐藥基因，其中包括2種磺胺類基因(sulⅠ、sulⅡ)和8種喹諾酮類基因(qnrA、qnrB、qnrC、qnrD、qnrS、qepA、oqxA和oqxB)。所用引物參照文獻[19]，見表1。PCR擴增反應程序為95 ℃，5 min預變性，然后94 ℃，30 s，58 ℃，30 s；72 ℃，1 min，共32個循環；最后16 ℃保存。擴增反應后進行瓊脂糖凝膠電泳并成像。

表1 PCR反應引物

Table 1 PCR primers used in this study

目的基因Targetgene引物序列(5’-3’)Primersequence產物長度Length/bpsulⅠF:CGCACCGGAAACATCGCTGCACR:TGAAGTTCCGCCGCAAGGCTCG163sulⅡF:TCCGGTGGAGGCCGGTATCTGGR:CGGGAATGCCATCTGCCTTGAG191qnrAF:AGAGGATTTCTCACGCCAGGR:TGCCAGGCACAGATCTTGAC580qnrBF:GGATGAAATTCGCCACTGR:TTTGCGCGCCAGTCGAA264qnrCF:GGGTTGTACATTTATT-GAATCGR:CACCTACCCATTTATTTTCA307qnrDF:CGAGATCAATTTACGGGGAA-TAR:AACAAGCTGAAGCGCCTG465qnrSF:GCAAGTTCATTGAACAGGGTR:TCTAAACCGTCGAGTTCGGCG428qepAF:CCAGCTCGGCAACTTGATACR:ATGCTCGCCTTCCAGAAAA570oqxAF:CTCGGCGCGATGATGCTR:CCACTCTTCACGGGAGACGA392oqxBF:TCCTGATCTCCATTAACGCCCAR:ACCGGAACCCATCTCGATGC131

1.2.4 檢出耐藥基因的測序和序列比對

將目的條帶割膠后送至杭州浩基生物公司，對PCR產物切膠回收，加尾后和pGM-Simple-T Fast Vector進行連接，轉化到感受態細胞DH5α，篩選陽性克隆進行測序。將返回的測序結果通過NCBI網站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)比對。

2 結果與分析

2.1 基因組DNA提取和耐藥基因檢測結果

通過對浙江省某市超市和農貿市場上共19只冷鮮雞的表面微生物提取總DNA如圖1，然后以總DNA為模板，對10種耐藥基因的檢測，共檢測出6種耐藥基因如表2和圖2。其中包括2種磺胺類耐藥基因(sulⅠ、sulⅡ)和4種喹諾酮類耐藥基因(qnrD、qnrS、qepA、oqxB)。

2.2 被檢出的耐藥基因測序比對結果

將測序結果使用NCBI網站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)的BLAST進行序列同源性比對，發現檢測到的耐藥基因PCR產物與以往文獻報道的耐藥基因有較高的同源性。在BLAST中進行的序列比對同源性結果如表3。

M，DNA Marker(DL5000); 1～8分別為來自大型超市的樣品M, DNA ladder; 1-8, Samples from supermarkets圖1 基因組DNA電泳圖Fig.1 Electrophoretic results of genome DNA

表2 耐藥基因的PCR檢測結果

Table 2 The PCR results of antibiotic genes

耐藥基因Drugresistancegene檢出率Detectionrate/%超市樣品Samplesfromsupermarket農貿市場樣品Samplesfromfarmersmarket磺胺類sulⅠ100100SulfonamidessulⅡ100100喹諾酮類qnrA00QuinolonesqnrB00qnrC00qnrD100100qnrS10081.8qepA100100oqxA00oqxB87.590.9

M: DNA marker(DL5000); 1～8:來自大型超市的樣品M: DNA ladder; 1-8: Samples from supermarkets圖2 耐藥基因電泳結果Fig.2 Electrophoretic results of antibiotic resistance gene

表3 耐藥基因序列同源性比對結果

Table 3 The results of antibiotic resistance gene sequences comparing to ones who have been deposited into the GenBank

耐藥基因DrugresistancegeneNCBI中基因序列號AccessionnumberinGenBank相似度Similarity/%sulⅠJN003421100sulⅡHQ44116999.44qnrDHM056769100qnrSHQ64066192.74qepAFJ74412199.82oqxBHQ674771100

3 結論與討論

由于抗生素的大量使用，導致家禽養殖中細菌耐藥性的提高。岳磊等[20]對廣東地區分離得到的84株雞源腸桿菌進行藥敏檢測，結果表明，這些雞源腸桿菌對氟羅沙星(98.8%)，恩諾沙星(84.5%)等喹諾酮類抗生素產生不同程度的抗性。磺胺類藥物在家禽養殖中，主要被用來治療和預防雞白痢。然而近些年的廣泛使用，逐漸造成雞白痢沙門氏菌對磺胺類藥物的耐藥性[21]。董洪燕等[22]對江蘇東臺地區分離得到的33株雞白痢沙門氏菌檢測，94.4%的菌株含有耐藥基因sulⅠ。寧家寶等[23]對珠江三角洲地區分離到的69株雞白痢沙門氏菌進行檢測，其中sulⅠ和sulⅡ基因的檢出率分別為33.3%和79.7%。

本試驗所選取的2個磺胺類耐藥基因和8個喹諾酮類耐藥基因，具有一定的代表性。這些耐藥基因在家禽類的養殖中較為常見，對于細菌耐藥基因在環境中的傳播、擴散具有一定的指示作用。本試驗沒有采用細菌的分離培養的方法，而是直接對冷鮮雞表面總細菌進行DNA的提取，對具有代表性的磺胺類和喹諾酮類耐藥基因進行PCR擴增和電泳，共有6種基因被檢測出來，經過序列比對后，所檢出的基因相似度均在92.74%以上，說明檢測結果可靠。其中包括2種磺胺類耐藥基因(sulⅠ、sulⅡ)和3種喹諾酮類耐藥基因(qnrS、qnrD、qepA、oqxB)。從電泳圖中亮度可以看出，sulⅠ、sulⅡ、qnrD、qnrS和oqxB基因在樣本間的差異不大，qepA在樣品間的差異較大。這可能與樣品采自不同市場有關。而其他5個喹諾酮類耐藥基因(qnrA、qnrB、qnrC、oqxA、oqxB)均未檢出。

細菌的耐藥性與耐藥基因產生的關系。微生物的耐藥基因的產生一方面來源于微生物固有的耐藥基因，另一方面來源于自身基因突變或通過微生物之間的的接合、轉化、轉導等相互作用而獲得[24-25]。細菌的抗生素耐藥基因主要有三種作用機制，第一種是通過產生抗生素的水解酶，使抗生素失去活性或分解。比如aac(6’)-Ib-cr可以編碼滅活酶，使喹諾酮類抗生素滅活而失去活性[26]。第二種是通過改變抗生素作用的靶點，降低抗生素與細菌的結合能力，這種方式比較普遍。比如四環素耐藥基因tetM、tetW、tetO、tetQ介導的耐藥機制就是通過產生的核糖體保護蛋白，抑制核糖體與四環素的相互作用[27]。第三種機制是通過改變細菌膜的通透性而形成藥物外排系統，將藥物外排，使得菌體內抗生素達不到有效作用濃度。比如tetC等基因介導的耐藥機制[27]。

綜合本試驗對磺胺類和喹諾酮類耐藥基因的檢測結果，可以得出家禽養殖場的耐藥基因可能會通過微生物攜帶到冷鮮雞的表面，對消費者的健康會產生一定的影響。另一方面，養殖場抗生素殘留和耐藥基因產生的相關性有待進一步研究，這對于分析耐藥基因的產生是由于自然因素還是人為因素導致的，意義重大。

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(責任編輯 張 韻)

Detection of the antibiotic genes of sulfonamides and quinolones of bacteria in refrigerated chicken

HE Xiangxiang1，2，3， YANG Hua2，3， DAI Baoling2，3， XIA Xiaodong1， XIAO Yingping2，3，*

(1.CollegeofFoodScienceandEngineering，NorthwestA&FUniversity，Yangling712100，China；2.InstituteofQualityandStandardforAgro-products，ZhejiangAcademyofAgriculturalSciences，Hangzhou310021，China；3.StateKeyLaboratoryBreedingBaseforZhejiangSustainablePestandDiseaseControl，ZhejiangAcademyofAgriculturalSciences，Hangzhou310021，China)

The long-term use of antibiotics in the animal farming industry has caused rapid expansion of drug resistant bacteria. These drug resistant bacteria are screened during the process of animal farming， and are easily transmitted in the animal production chain， which is a huge threat to human’s food safety. In this study， we aimed at testing the safety of refrigerated chicken collected from eight supermarkets and eleven agricultural markets in Shaoxing city， Zhejiang Province. We detected the antibiotic genes of sulfonamides and quinolones of surface microorganisms of the samples by PCR reaction and sequencing. We detectedsulⅠ，sulⅡ，qnrD，qnrS，qepAandoqxBin the samples and the detection rate was 100%， 100%， 100%， 89.5%， 100% and 89.5%， respectively. We also sequenced the antibiotic genes with the sequences in NCBI and the coincidence rate was 100%， 99.44%， 100%， 92.74%， 99.82% and 100%， respectively. This study will provide effective support for risk assessment of antibiotic genes in the refrigerated chicken.

refrigerated chicken; bacteria; sulfonamides; quinolones; drug-resistance genes

http://www.zjnyxb.cn何祥祥，楊華，戴寶玲，等. 冷鮮雞污染微生物磺胺類和喹諾酮類耐藥基因分析[J].浙江農業學報，2017，29(4)： 555-559.

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.04.06

2016-11-07

浙江省公益技術運用研究項目(2016C32073)；浙江省植物有害生物防控重點實驗室——省部共建國家重點實驗室培育基地(2010DS700124-ZM1608)

何祥祥(1991—)，男，河南洛陽人，碩士研究生，研究方向為食品科學。E-mail:xianghe2009@126.com

*通信作者，肖英平，E-mail: ypxiaozju@126.com

S879.2

A

1004-1524(2017)04-0555-05

浙江農業學報ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2017，29(4): 555-559