一株真菌的發酵液對番茄抗鹽的促進作用及菌株初步鑒定

劉國麗，龔 娜，陳 珣，王 娜

(1.遼寧省農業科學院 微生物工程中心，遼寧 沈陽 110161； 2.遼寧省農業科學院 植物營養與環境資源研究所，遼寧 沈陽 110161)

一株真菌的發酵液對番茄抗鹽的促進作用及菌株初步鑒定

劉國麗1，龔 娜1，陳 珣1，王 娜2，*

(1.遼寧省農業科學院 微生物工程中心，遼寧 沈陽 110161； 2.遼寧省農業科學院 植物營養與環境資源研究所，遼寧 沈陽 110161)

為篩選獲得能提高番茄耐鹽性的真菌發酵液，試驗采用真菌的發酵液處理75 mmol·L-1Ca(NO3)2脅迫下的番茄種子，通過測定種子發芽率、發芽勢，選擇對種子發芽有促進作用的菌株發酵液，研究其對Ca(NO3)2處理下番茄幼苗根干質量、苗干質量等農藝性狀指標及植株內源激素等的影響，結果顯示，其中部分菌株發酵液能不同程度地提高番茄種子發芽率和發芽勢，并能提高根干質量、苗干質量；結合種子發芽指標及幼苗干質量和內源激素含量來看，其中菌株DL12發酵液處理綜合效果最好，種子發芽率、發芽勢、株高、根干質量、苗干質量較對照分別提升了29%、200%、17.6%、26.8%、18.9%。DL12處理后葉片中IAA含量是對照組的49.6倍。采用真菌通用引物ITS1和ITS2擴增菌株DL12 18S rDNA序列，并與GenBank已知序列比對后，結果顯示，菌株DL12與Schizophyllumcommune相似度達到99%，推測菌株DL12是Schizophyllum屬真菌。

番茄；抗鹽；真菌；發酵液

近年來，我國設施番茄栽培發展迅速，已成為農民增收的重要途徑之一。然而，由于設施栽培是封閉栽培方式，缺少自然雨水淋洗，高溫、高濕且通氣不良，設施農田土壤又長期處于高集約化、高復種指數、高肥料施用量的生產狀態，生態環境和生產狀態綜合導致了土壤次生鹽漬化、養分失調、土壤酸化等諸多問題，其中以土壤次生鹽漬化問題最為突出[1]。并且隨著種植年限的增加，設施土壤次生鹽漬化現象非常普遍，在連續栽培蔬菜 3 年以上的日光溫室和塑料大棚中，土壤可溶性鹽表積現象比較明顯，土壤可溶性鹽積累嚴重[2]。鹽漬化導致的鹽害通常表現為生理干旱，引起蔬菜生長發育不良，植株抗病性下降，病蟲害加重等后果，此外鹽漬化導致的鹽脅迫影響作物對養分的吸收，引起植物根細胞吸收土壤水分困難或是脫水[3]，嚴重影響蔬菜的產量和品質，造成蔬菜生長受阻，產量降低，因此土壤鹽漬化是蔬菜栽培的重要限制因子，嚴重制約著設施蔬菜栽培的進一步發展。

番茄是我國主要的設施蔬菜作物之一，在農業生產中有重要經濟價值，易受土壤鹽漬化影響。因此探索研究解決土壤鹽漬化，緩解番茄鹽害的方法，對于提高設施園藝生產效率具有重要的理論意義和實踐價值。而通過生物途徑使植物充分適應鹽漬環境，以提高植物在鹽漬土壤上的生產力極具發展潛力[4-5]。

本試驗以番茄品種L402為材料，分析比較了不同外源真菌發酵液對鹽脅迫下番茄種子發芽情況、幼苗生長的影響，探討不同外源真菌發酵液對番茄鹽脅迫的緩解作用，篩選獲得緩解番茄鹽害的菌種，以期找到提高番茄耐鹽性的有效途徑，為提高番茄在鹽漬化上的生產力提供科學依據和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 番茄品種

供試番茄品種為L402。

1.1.2 供試菌株及發酵液的配制

從遼寧不同鹽堿環境區的土壤和植株中自行分離出真菌菌株27株。無菌操作條件下將供試菌株分別接種于PDA培養基中，28 ℃，200 r·min-1培養5 d，離心取上清，并調節發酵液濃度為干質量1 mg·mL-1，備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設計

發芽試驗：選取大小一致、飽滿的番茄種子在2% (m/V)次氯酸鈉溶液中浸泡15 min，進行消毒，然后用去離子水將種子清洗干凈，進行發酵液拌種處理，對照用同等體積水替代處理，晾干后，置于9 cm直徑培養皿中，里面鋪兩層濾紙，加入10 mL 75 mmol·L-1Ca(NO3)2，然后在25 ℃的恒溫培養箱內催芽，每個平皿20粒番茄種子，定期補充水分，每天觀察統計種子發芽數，共統計14 d。

盆栽試驗：盆栽試驗于塑料花盆中進行，每盆種一穴，每穴單株種植。當長至3葉1心時，用不同的發酵液噴淋番茄幼苗的葉片并至根部，共噴 30 mL 1 mg·mL-1發酵液，開始進行發酵液處理，對照組噴淋同等體積水。7 d后，每3 d每穴澆30 mL 75 mmol·L-1Ca(NO3)2，開始鹽脅迫處理，共澆10次，每個處理3個平行。鹽處理結束后取樣，測定番茄植株生物量、內源激素等指標。

1.2.2 指標測定方法

發芽勢及發芽率按下列公式：發芽率=總發芽的種子數/種子總數×100%；發芽勢=前3 d發芽的種子數/種子總數×100%。

植株生物量的測定：首先，將番茄植株從花盆中連根取出，用去離子水小心沖洗，并保持根系的完整。按地上部和地下部分開，置于鼓風干燥箱中105 ℃下殺青 30 min，于80 ℃下烘干至恒質量，稱得干質量。

內源激素提取與檢測[6-7]：采集盆栽試驗后的番茄幼苗葉片，提取內源激素樣品，并用0.22 μm孔徑的有機濾膜過濾，棄去初濾液，續濾液作為樣品溶液。檢測條件：運行緩沖液75 mmol·L-1硼砂緩沖液(pH 9.0)；檢測波長205 nm；分離電壓20 kV。

1.2.3 菌株ITS序列擴增與測序

將篩選到的菌株接種至PDA液體培養基中，28 ℃搖床150 r·min-1培養36 h，采用真菌DNA 試劑盒提取菌株總DNA，菌株DNA提取后，經0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性，并通過微量核酸定量儀檢測其濃度。采用真菌通用引物ITS1和ITS2擴增18S rDNA 的ITS區域，PCR擴增產物送至上海生物工程技術服務有限公司測序。將測得的序列與GenBank已知序列進行BLAST比對(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，并利用MEGA 4.1進行系統發育樹構建。

1.3 數據處理

試驗數據采用Microsoft Excel軟件系統分析。

2 結果與分析

2. 1 真菌發酵液對番茄種子發芽率及發芽勢的影響

由表1可以看出，75 mmol·L-1Ca(NO3)2脅迫下，L402種子發芽率受到了明顯的抑制，發芽速度很慢。不同真菌發酵液處理后番茄種子發芽率和發芽勢表現差異很大，相對于對照組，部分菌株抑制了種子的發芽率和發芽勢，而DWJ2、DL2、DL12等顯著促進了種子的萌發。其中DL12處理組番茄種子發芽率和發芽勢分別比對照組高29%和200%。

2.2 真菌發酵液對番茄植株株高和生物量影響

綜合考慮真菌發酵液對發芽率和發芽勢的影響，以發芽勢或發芽率不小于對照作為篩選標準，挑選效果好的DL2、DL3等13種真菌發酵液進行盆栽試驗。

從表2中可以看出，采用各真菌發酵液進行噴淋處理后，對植株株高、干質量影響各不相同，部分對種子發芽有促進作用的菌株也能促進幼苗的生長，說明在一定程度上緩解了Ca(NO3)2對番茄幼苗的傷害。其中DL2、DL12、DL15、DWJ2、DWR3對番茄植株的株高和生物量積累作用較大，顯著高于對照。

2.3 DL12發酵液處理對番茄幼苗內源激素的影響

表1 真菌發酵液對番茄種子發芽率及發芽勢的影響

Table 1 Effects of fungus fermentation liquid on germination rate and germination potential of tomato seeds

菌株編號No.發芽率Germinationrate/%發芽勢Germinationpotential/%DL143.31.7DL250.08.3DL365.013.3DL433.31.7DL536.711.7DL731.710.0DL951.75.0DL1153.36.7DL1266.715.0DL1323.30.0DL1541.76.7DWJ263.311.7DWR141.70DWR251.76.7DWR356.713.3DWR446.73.3XN118.30XN443.30XN536.71.7XN631.70XN740.03.3XN845.05.0XN1050.06.7XN1156.78.3XN1225.00XN1345.00XN1938.33.3CK51.75.0

表2 真菌發酵液噴淋對番茄植株株高和生物量的影響

Table 2 Effects of fungus fermentation liquid on plant height， root dry weight and seedling dry weight of tomato

菌株編號No.株高Plantheight/cm根干質量Rootdryweight/g苗干質量Seedlingdryweight/gDL217.17cd0.457bc2.097cdDL314.40a0.359a1.627aDL515.83abc0.383a1.857abcDL714.43a0.390a1.700abDL914.57ab0.413ab1.697abDL1116.07bc0.407ab1.833abcDL1218.23d0.511cd2.197dDL1518.03d0.483cd2.260dDWJ218.06d0.541d2.220dDWR216.16bc0.390a1.807abcDWR318.13d0.490cd1.973bcdXN1016.00bc0.420ab1.767abXN1115.57ab0.392a1.880abcCK15.50ab0.403ab1.847abc

表中同列數據后無相同小寫字母的表示差異顯著(P<0.05)。

Values within a column followed by different lowercase letters indicate the significant difference (P<0.05).

植物激素通常作用于植物激素受體，通過信號轉導引發下游基因表達和相應的生理生化反應，進而影響根、莖、葉、花、果實等器官的形態建成[8]。生長素(IAA)和脫落酸(ABA)是植物的內源激素，可促進或抑制與種子萌發有關酶類的活性從而調節代謝進程，進而促進或抑制種子的萌發和早期生長。通過檢測DL2、DL12、DL15、DWJ2、DWR3發酵液對番茄植株內源激素含量的影響，結果見表3和圖1，DL12、DL15、DWJ2均檢測到IAA，同等條件下未檢測到ABA。只有DL2檢測到ABA含量0.431 μg·mL-1。DWR3未檢測到ABA和IAA。DL12發酵液處理后有效提高了葉片中IAA的濃度，為14.473 μg·mL-1，而對照組檢測結果僅為0.290 μg·mL-1，DL12發酵液處理番茄葉片IAA含量是對照組的49.9倍。

表3 真菌發酵液對番茄葉片內源激素含量的影響

Table 3 Effect of fermentation liquid on endogenous hormones content in tomato leaves

樣品編號No.吲哚乙酸含量IAA/(μg·mL-1)脫落酸含量ABA/(μg·mL-1)DL2—0.431DL1214.473—DL150.075—DWJ20.220—DWR3——CK0.290—

“—”表示未檢測到。

“—”stands for no detection.

a、b、c依次為標準品、DL12處理、CK組葉片圖譜a， Standard sample; b， HPCE chromatograms of IAA in tomato leaves treated by fermentation liquid of DL12; c， CK圖1 番茄葉片中IAA毛細管電泳圖譜Fig.1 The HPCE chromatograms of IAA in tomato leaves

2.4 菌株ITS rDNA序列分析

利用ITS1和ITS2 rDNA特異引物對菌株進行PCR擴增得到的目的DNA片段，利用Blast軟件與GenBank的序列進行同源性比較(圖2)，結果顯示菌株DL12與Schizophyllumcommune相似度達到99%，初步推測DL12為Schizophyllum屬真菌。

圖2 菌株DL12基于ITS rDNA 序列同源性構建的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain DL12 and other reference species

3 結論與討論

通過比較篩選不同來源的真菌發酵液對番茄發芽及生物量等指標的作用，獲得一株對Ca(NO3)2脅迫下番茄發芽和生長有促進作用的菌株DL12，DL12發酵液處理后能提高Ca(NO3)2脅迫下番茄種子發芽率、發芽勢，較對照分別提升了29%、200%；株高、根干質量、苗干質量較對照分別提升了17.6%、26.8%、18.9%。內源激素檢測表明，DL12能明顯提高幼苗的內源激素IAA含量。

目前我國耕地面積不斷減少，土地鹽堿化不斷惡化，通過生物途徑使植物充分適應鹽漬環境，增強植株對鹽堿的耐受范圍，以提高植物在鹽漬土壤上的生產力極具發展潛力，可為鹽漬化土地的利用提供新的途徑。近年來，關于鹽脅迫下促生菌的報道越來越多，涉及很多屬種，包括細菌、真菌等[9-15]。但關于Schizophyllum屬菌株與植物促生抗逆的報道較少，僅李莎[16]報道了分離得到的一株Schizophyllum屬TTS-5菌株，不僅對立枯絲核菌有拮抗作用，接種至油松幼苗后，油松苗成活率、生長狀況及根系活力均高于對照。本試驗結果表明，DL12發酵液處理可以提高番茄種子在Ca(NO3)2脅迫下的萌發，噴淋處理后，可以促進幼苗的生長，顯著影響番茄植株的內源激素含量，緩解鹽脅迫對番茄幼苗的毒害作用，從而增強番茄對鹽脅迫的抗性。本試驗為提高設施蔬菜在鹽漬化土地上的抗性提供了新的思路和方法。

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(責任編輯 張 韻)

Promotion effect of fungus DL12 fermentation liquid on salt-resistance ability of tomato and primary identification of strain

LIU Guoli1， GONG Na1， CHEN Xun1， WANG Na2，*

(1.CenterofMicrobialEngineering，LiaoningAcademyofAgriculturalSciences，Shenyang110161，China；2.InstituteofPlantNutrientsandEnvironmentalResources，LiaoningAcademyofAgriculturalSciences，Shenyang110161，China)

In order to screen fungi that could improve the salt-resistance ability ofLycopersiconesculentum， firstly， the fermentation liquid of different fungi were used to treat the seeds ofLycopersiconesculentumunder 75 mmol·L-1Ca(NO3)2stress. Then the seedlings were sprayed by fermentation liquid of different fungi which had good effects on germination of seeds through evaluation of germination rate and germination potential. The plant height and biomass of seedlings after treatment were recorded. Effect of fermentation liquid from strains DL2， DL12， DL15， DWJ2， DWR3 on endogenous hormones content of seedlings were also measured through HPCE chromatograms. Results showed that several fungi strains could partially improve germination rate and germination potential of seeds， and increase the dry weight. DL12 had the best effects among all the fungi. The germination rate， germination potential of seeds， plant height， root dry weight， and seedling dry weight were increased by 29%， 200%， 17.6%， 26.8%， 18.9%， respectively， compared with the control group. The IAA content was 49.6 times of the control group. The fungus general primers ITS1 and ITS2 were used to amplify 18S rDNA sequences of strain DL12， and alignment with the known sequences from GenBank was carried out， results showed that the similarity between strain DL12 andSchizophyllumcommunewas 99%. It was concluded that DL12 may belong toSchizophyllumsp.

tomato; salt-resistance; fungus; fermentation liquid

http://www.zjnyxb.cn

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.04.13

2016-12-21

遼寧省自然科學基金項目(2014027026)；遼寧省科學事業公益研究基金項目(2015002006)

劉國麗(1986—)，女，山東菏澤人，碩士，助理實習員，從事植物內生菌方向研究。E-mail: liugl12@163.com

*通信作者，王娜，E-mail: wnsxh1999@126.com

S182

A

1004-1524(2017)04-0605-06

浙江農業學報ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2017，29(4): 605-610

劉國麗，龔娜，陳珣，等. 一株真菌的發酵液對番茄抗鹽的促進作用及菌株初步鑒定[J].浙江農業學報，2017，29(4)： 605-610.