黃瓜花葉病毒基因沉默載體的效率和穩定性分析

向志丹，張震霄，李 超，杜志游

(浙江理工大學 生命科學學院，浙江 杭州 310018)

黃瓜花葉病毒基因沉默載體的效率和穩定性分析

向志丹，張震霄，李 超，杜志游*

(浙江理工大學 生命科學學院，浙江 杭州 310018)

病毒誘導的基因沉默(virus-induced gene silencing， VIGS)已被廣泛應用于植物基因的功能研究。試驗以八氫番茄紅素脫氫酶(phytoene desaturase， PDS)作為指示基因，在本生煙體內分析黃瓜花葉病毒(Cucumbermosaicvirus， CMV)作為VIGS載體對植物內源PDS mRNA的沉默效率。采用分子克隆的方法，將Fny-CMV 2b ORF替換為不同長度的PDS序列，并分析了其在本生煙植物上誘導的PDS沉默效率。結果表明，該重組病毒能誘導上部系統葉的光漂白表型，且沉默效率與插入片段長度呈一定的正相關性，但在頂端新生葉中均不引起明顯的光漂白現象，過長的片段插入(≥518 nt)影響病毒基因組的遺傳穩定性，導致插入片段的部分缺失。CMV作為 VIGS載體，最適合的插入片段約為350 nt。

病毒誘導的基因沉默；黃瓜花葉病毒；2b；八氫番茄紅素脫氫酶

病毒誘導的基因沉默 (virus induced gene silencing， VIGS)是一種分子遺傳學技術，即利用病毒作為一個外源基因片段的載體，通過病毒復制和寄主RNA沉默機制產生外源片段的siRNA，進而通過siRNA途徑沉默靶標mRNA。由于該技術具有周期短和操作簡便等優點，已被廣泛地應用于植物的基因功能研究。到目前為止，已有眾多VIGS載體的報道。其中，應用最為廣泛的VIGS載體為煙草脆裂病毒(Tobaccorattlevirus， TRV)[1]。

黃瓜花葉病毒(Cucumbermosaicvirus， CMV)是屬于雀麥花葉病毒科(Bromoviridae)黃瓜花葉病毒屬(Cucumovirus)的典型成員。CMV可侵染包括茄科、十字花科、豆科及葫蘆科等重要經濟作物在內的1 000多種植物[2]。CMV基因組由3條正義單鏈RNA(RNA1-3)組成。RNA1和RNA2可直接作為模板翻譯合成1a和2a(RdRp)蛋白，負責病毒的復制；此外，RNA2還通過其亞基因組RNA4A編碼產生約12～15 ku的2b蛋白。2b ORF 5’端與2a ORF的3’端有240個堿基的重疊。2b蛋白是一種多功能蛋白，包括病毒致病因子和RNA沉默的抑制子。RNA3編碼3a蛋白(即移動蛋白，MP)和外殼蛋白(CP)，負責病毒的細胞間移動、長距離移動和病毒粒子的包裝[2-3]。

CMV的VIGS載體能有效地誘導本生煙和玉米植物內源mRNA的沉默[4-6]，但是報道的CMV載體均保留了2b蛋白的N端約80個氨基酸序列，內含RNA沉默抑制子活性的功能域。因此，保留的2b序列有可能會影響病毒誘導的基因沉默。為此，本試驗利用一段八氫番茄紅素脫氫酶(phytoene desaturase， PDS)cDNA完全替換Fny-CMV株系的2b ORF，在本生煙體內分析該CMV重組體對植物內源PDS mRNA的沉默效率；在此基礎上，進一步分析PDS插入片段的長度與CMV誘導沉默效率的關系，以及插入片段的遺傳穩定性，從而明確CMV VIGS載體的最適插入片段長度。

1 材料與方法

1.1 試劑

AMV逆轉錄酶、RNA酶抑制劑、高保真PyrobestTMDNA 聚合酶、限制性內切酶均購于TaKaRa公司。T4 DNA連接酶購于NEB公司。RiboMax體外轉錄試劑盒、m7GpppG Cap類似物和Klenow大片段均購于Promega公司。其他試劑購于上海生工。

1.2 植物及其生長

本生煙(Nicotianabenthamiana)幼苗于22～28 ℃、16 h光周期的植物培養室中培養。

1.3 質粒及其構建

CMV株系Fny基因組RNA1-3的侵染性克隆pF109、pF209和pF309由Dr. Peter Palukaitis提供[7]。2b缺失質粒pF209Δ2b由本實驗室構建[8]。根據前期報道的方法，構建pF209Δ2b-PDS353重組質粒。擴增片段Ⅰ和片段Ⅲ的PCR引物以及方法完全參照前期描述的方法[8]。片段Ⅱ為PDS序列，利用引物NbPDS1437F和NbPDS1879R (表1)，以本生煙的mRNA作為模板，通過常規RT-PCR擴增獲得353 bp大小的DNA片段。然后，通過重疊PCR，將片段Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ混合作為PCR模板，進行PCR擴增。擴增產物經HindⅢ和PstⅠ酶切，克隆至pF209質粒，產生pF209Δ2b-PDS353重組質粒。值的一提的是，我們在PDS片段的上下游分別引入ApaⅠ和MluⅠ克隆位點，便于后續PDS片段的克隆。

為了構建含有不同長度的PDS片段的重組質粒，我們利用不同的上游引物與NbPDS1879R組合，PCR擴增獲得104、219、518、750和1 030 bp的PDS DNA片段。經ApaI和MluI酶切，克隆至預先經ApaI/MluI酶切的pF209Δ2b-PDS353質粒，構建產生重組質粒PDS104、PDS219、PDS518、PDS750和PDS1030。所有重組質粒都經測序確定。

表1 用于構建質粒PDS重組質粒的引物序列

Table 1 List of primers used for constructing PDS recombinant plasmids

引物名稱Primername引物序列Primersequence(5’-3’)質粒plasmidsNbPDS760FGGGCCCAGAACTAGGGATTGATGATCPDS1030NbPDS1040FGGGCCCAGGGTGACAGATGAGGPDS750NbPDS1272FGGGCCCAGCTGAATGAGGATGGPDS518NbPDS1437FCCAACAAACAGCGAAAGAATTATTGATA-AGGGCCCTGGGAGTTCCTGTGATAAATGTCPDS353NbPDS1571FGGGCCCCAATCAGTCTATGTTGGAPDS219NbPDS1686FGGGCCCTTTCGGCAGATCAGAGPDS104NbPDS1879RAGATGCGGAAGGGGAGGTTTCAACGCGTCCGACAGGGTTCACAACCT—

1.4 體外轉錄和病毒接種

pF109、pF309、pF209及其突變體和PDS重組體經PstI酶切線性化，然后利用RiboMax體外轉錄試劑盒合成相應的RNA。將CMV的三條基因組以1∶1∶1的比例混合，摩擦接種至5～6葉期的本生煙。

1.5 病毒RNA的雜交檢測

根據Trizol試劑的使用操作說明，提取葉組織總RNA。總RNA經nanodrop定量和1×TBE瓊脂糖電泳的質量檢測。總RNA的瓊脂糖-甲醛變性電泳、轉膜以及Northern雜交檢測參考文獻報道的方法[8]。

1.6 PDS mRNA的相對定量

利用Trizol試劑提取CMV重組病毒侵染的本生煙光漂白葉組織的總RNA，然后參考先前描述的方法進行實時熒光定量PCR檢測[9]分析PDS mRNA的相對水平。EF1α作為內參基因，引物序列詳見文獻[9]。PDS 特異的上下游引物分別為NbPDS405F: 5’-CCACGACCCGAAGATTGAC-3’和 NbPDS511R: 5’-TAACGCCGCCTCCAAATAG-3’。

2 結果與分析

2.1 CMV沉默載體的構建和沉默效率的測定

CMV 2b蛋白是一個有效的RNA沉默抑制子，其抑制活性位于其N端61氨基酸[10]，且該蛋白在多數植物上對病毒的復制和移動是非必需的[3]，因此，我們將Fny-CMV的2b ORF替換為353 bp的PDS片段，構建了pF209Δ2b-PDS353重組質粒(圖1-A)。通過體外轉錄，將其與Fny-CMV RNA1和RNA3的體外轉錄產物混合接種本生煙，產生重組病毒Fny-CMVΔ2b-PDS353；同時，以接種2b基因缺失的突變體Fny-CMVΔ2b作為對照。在整個病毒癥狀觀察期間，對照病毒Fny-CMVΔ2b僅引起輕微的花葉癥狀。然而，接種后7 d，Fny-CMVΔ2b-PDS353侵染引起上部系統葉出現明顯的沿脈褪綠；接種后25 d，以上系統葉則發展為大面積的光漂白表型(白色箭頭所示，圖1-B)。然而，頂部新生葉僅呈現局部有限的光漂白現象(灰色箭頭所示，圖1-B)。以上結果表明，在病毒侵染的早中期，Fny-CMVΔ2b-PDS353侵染能有效地誘導上部系統葉中PDS mRNA的沉默，然而，沉默效率在新生葉中受到明顯的抑制。

A， pF209與pF209Δ2b-PDS353的侵染性克隆示意圖；B， 本生煙接種病毒或緩沖液后(mock)的表型，接種25 d后拍照；C， pF209Δ2b-PDS353轉接3代后引起的本生煙表型，轉接14 d后拍照A， Diagram of infectious constructs pFny209 and its mutant pF209Δ2b-PDS353; B， Phenotype of N. benthamiana plants inoculated with virus or inoculation buffer (mock). The photos were taken at 25 dpi; C， Phenotype of N. benthamiana plant with infection of pF209Δ2b-PDS353 after three passages. The photo was taken at 14 dpi圖1 CMV誘導的PDS沉默Fig.1 PDS silencing induced by CMV

為了分析Fny-CMVΔ2b-PDS353重組病毒的遺傳穩定性，對該病毒進行了3次轉接本生煙。第三次轉接后14 d，接種植物的系統葉同樣表現明顯的光漂白表型(圖1-C)。然后，通過RT-PCR和測序分析，結果表明，插入PDS序列沒有出現任何片段缺失和突變(數據未顯示)，這說明該重組病毒在植物體內能穩定遺傳，而且新生葉中減弱的沉默效率不是由于PDS插入片段的不穩定性導致。

2.2 PDS插入片段的大小對CMV誘導沉默效率的影響

為了分析不同插入片段對CMV誘導沉默效率的影響，我們將2b ORF系列替換為不同長度的PDS片段：104 bp(PDS104)、219 bp(PDS219)、353 bp(PDS353，即Fny-CMVΔ2b-PDS353)、518 bp(PDS518)、750 bp(PDS750)和1030 bp(PDS1030)(圖2-A)。將以上重組質粒的體外轉錄產物分別與RNA1和RNA3混合接種本生煙。接種后14 d，以上重組病毒在上部系統葉中引起差異的光漂白效果。PDS104幾乎不引起光漂白現象，葉片輕微出現少量的褪綠表型。PDS219則出現大面積褪綠，但光漂白現象不明顯。PDS518表現與PDS353相近的光漂白程度，而PDS750和PDS1030二者表現最為嚴重的光漂白表型。然而，在頂部的新生葉上，PDS518引起的光漂白最為明顯，而PDS750和PDS1030則與PDS104和PDS219相似，沒有引起明顯的PDS沉默表型(圖2-B)。

A， pF209Δ2b攜帶不同長度的PDS插入片段的示意圖；B， 重組病毒在本生煙植物上引起的光漂白表型，接種后25 d拍照；C， 實時定量PCR分析重組病毒引起的PDS mRNA的下調，PDS mRNA 提取自下部呈現光漂白的葉片(非頂葉)A， Diagram of pF209Δ2b harboring PDS inserts in different sizes. B， Photobleaching phenotype on N. benthamiana plants with infection of the recombinant viruses. Photos were taken at 25 dpi. C， Analysis of down-regulation of PDS mRNA by the recombinant viruses using real-time PCR. PDS mRNA was extracted from the leaf tissues showing photobleaching， rather than the top leaves圖2 不同長度的PDS插入對CMV誘導PDS沉默效率的影響Fig.2 Effect of PDS insertion in different sizes on CMV-induced PDS silencing

利用熒光定量PCR方法，對上述表現光漂白表型的上部系統葉(非頂部葉片)中的PDS mRNA水平進行相對定量，結果如圖2-C所示。PDS104與PDS219侵染分別只降低了11%和25%；PDS353侵染則顯著降低了PDS mRNA水平，降低效率為65%。與mock相比，PDS518、PDS750和PDS1030分別降低了73%、82%和80%。以上結果說明，CMV誘導的PDS沉默效率與PDS插入片段的大小呈一定的相關性。

2.3 重組病毒的遺傳穩定性分析

為分析以上重組病毒的遺傳穩定性，對重組病毒進行了3次轉接。轉接后第14天，通過Northern雜交對系統葉中的病毒子代RNA進行檢測。結果顯示(圖3-A)，在轉接的植物中均檢測到病毒RNA條帶，且各重組病毒間基因組含量沒有顯著區別。但是，我們注意到PDS1030、PDS750和PDS518三者的基因組RNA2遷移速率比PDS353快，這與理論大小不相符，說明前三者的RNA2很可能發生PDS片段的缺失。為此，通過RT-PCR和測序分析，我們發現，PDS353、PDS219和PDS104病毒的PDS插入片段沒有發生缺失和突變，但是，PDS1030、PDS750和PDS518在插入片段的5’端分別缺失813、542和332 nt(圖3-B)。這些結果說明，CMV作為沉默載體，最適插入片段為350 nt左右。

3 討論

到目前為止，已有多達40個植物病毒的VIGS載體報道[11]，這說明許多病毒都具有誘導基因沉默的能力。但是，不同病毒的沉默效率可能存在著差異性。Ratcliff等[1]發現：相比于馬鈴薯X病毒(Potatovirusx， PVX)、煙草花葉病毒(Tobaccomosaicvirus， TMV)和番茄金花葉病毒(Tomatogoldenmosaicvirus， TGMV)，TRV具有明顯的沉默效率優勢：表現為更高的沉默程度和更久的持續時間。PVX不能有效地誘導頂部新生葉的PDS沉默，但是TRV則能有效地誘導沉默，這方面的差異很可能與二者病毒能否侵染植物頂端分生組織有關[1]。TRV由于其編碼的RNA沉默抑制子16k，使得該病毒能有效地侵染植物的頂端分生組織[12]，但是PVX則不能[1]。

A， RNA 雜交分析病毒子代RNA的積累，總RNA 提取自病毒轉接3代后第14天的系統葉；B， CMV病毒中PDS插入片段的缺失示意圖，網格方形代表PDS序列的缺失部分，括號中數字代表缺失的堿基數目，其他數字表示缺失片段在原插入片段中的位置，灰色代表在病毒基因組中保留的序列部分A， Analysis of viral progeny RNAs by RNA blotting. Total RNA was extracted from the upper systemic leaves at 14 dpi after 3 passages; B， Diagrams of PDS deletion from the PDS inserts in CMV. Rectangles with grids indicate deletion from the inserted PDS fragments. The numbers in brackets indicate deletion size. Other numbers represent the positions of deletion fragment in the original inserts. Gray rectangles indicate the sequence remained in the viral genomes after passages圖3 CMV重組病毒的遺傳穩定性分析Fig.3 Analysis of genetic stabilities of CMV recombinants

CMV 2b蛋白是該病毒侵染植物的頂端分生組織所必需的[13]。我們所測試的CMV沉默載體由于完全缺失2b基因，從而使得CMV重組病毒喪失了侵染本生煙頂端分生組織的能力，這合理地解釋了該CMV沉默載體無法有效地沉默頂端新生葉組織中PDS的現象。另外一種可能是2b蛋白的缺失，使得病毒無法克服寄主的抗病毒RNA沉默，導致病毒積累顯著降低[9，14]，從而影響了PDS siRNA在體內的豐度。當在特定CMV株系的基因組中保留2b N端約80個氨基酸(包含RNA抑制子的活性結構域)，在其后插入靶標的部分序列，能有效地抑制本生煙和玉米植物體內相應內源基因的RNA沉默[4，6]。由此可見，選擇特定CMV 2b蛋白，并保留其抑制子的功能結構域，對CMV 誘導植物內源的基因沉默是有利的。

Burch-Smith等[15]報道300～500 bp 插入片段的沉默效果最佳。然而，我們發現，插入片段的長度與CMV誘導的沉默效率呈現一定的相關性，353 nt和518 nt的插入片段均能有效地誘導沉默，但是，750 nt片段的插入達到最高的沉默效率(圖2)。盡管長片段的插入增強了沉默效率，但是，插入片段大于518 nt則降低了病毒的遺傳穩定性，出現插入片段的丟失(圖3)。外源片段丟失的現象也在侵染玉米的CMV沉默載體中發生[6]。片段的缺失很可能是由于長片段的插入影響了病毒基因組的病毒粒子組裝和長距離運輸。基于沉默的效率和穩定性，CMV載體的理想插入片段在350 nt左右。

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(責任編輯 張 韻)

Investigation of efficiency and stability ofCucumbermosaicvirus-based gene silencing vector

XIANG Zhidan， ZHANG Zhenxiao， LI Chao， DU Zhiyou*

(CollegeofLifeSciences，ZhejiangSci-TechUniversity，Hangzhou310018，China)

Virus-induced gene silencing (VIGS) has been widely used for analysis of plant gene function. In this work， using phytoene desaturase (PDS) as an indicator， efficiency ofCucumbermosaicvirus(CMV) as a VIGS vector was investigated to silence PDS mRNA inNicotianabenthamiana. Recombinant viruses were generated by replacing the 2b ORF with a set of PDS fragments， and tested inN.benthamianaplants. Results showed that these recombinants induced photobleaching phenotype in the upper systemic leaves and silencing efficiency was correlated with the length of the PDS inserts in some extents， but they did not cause obvious photobleaching phenotype in the newly top leaves and oversized inserts (≥518 nt) reduced genetic stability of viral genome， leading to partial deletion of the inserts. Thus， the optimal insert is about 350 nt in length for CMV-based VIGS vector.

virus-induced gene silencing;Cucumbermosaicvirus; 2b; phytoene desaturase

http://www.zjnyxb.cn

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.04.16

2016-11-30

國家自然科學基金(31470007)

向志丹(1992—)，女，湖北宜昌人，碩士研究生，從事分子植物病毒學研究。E-mail: wjgqzwwl@qq.com

*通信作者，杜志游，E-mail: duzy@zstu.edu.cn

Q933

A

1004-1524(2017)04-0625-06

浙江農業學報ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2017，29(4): 625-630

向志丹，張震霄，李超，等. 黃瓜花葉病毒基因沉默載體的效率和穩定性分析[J].浙江農業學報，2017，29(4)： 625-630.