偽狂犬病毒gE、gI和US9三基因缺失株的構建

樊 毅，李 碧 ，郭萬柱，李 萍，黃劍波，楊 凡，姜子義，趙 軍，許思遙， 鄧益超，殷 玥，毛汐語，呂雯婷，徐志文，2，朱 玲，2，*

(1.四川農業大學 動物醫學院，四川 溫江 611130； 2.四川農業大學 動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，四川 溫江 611130)

偽狂犬病毒gE、gI和US9三基因缺失株的構建

樊 毅1，李 碧1，郭萬柱1，李 萍1，黃劍波1，楊 凡1，姜子義1，趙 軍1，許思遙1， 鄧益超1，殷 玥1，毛汐語1，呂雯婷1，徐志文1，2，朱 玲1，2，*

(1.四川農業大學 動物醫學院，四川 溫江 611130； 2.四川農業大學 動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，四川 溫江 611130)

偽狂犬病毒(pseudorabies virus，PRV)是一種皰疹病毒，在自然界具有極廣泛的宿主類群，是中國養豬業發展主要威脅之一。為了研究病毒的神經傳導機制，實驗采用Lipofectamine?3 000轉染試劑，將PP63質粒與偽狂犬病毒Fa株基因組DNA共轉染BHK-21細胞，空斑篩選得到gI/gE/US9重組缺失病毒，并命名為SA215-T。采用PCR、基因測序、Western Blot、電鏡檢查和生長曲線測定等方法檢測重組病毒PRV-SA215-T。研究結果顯示，Western Blot未發現gE基因的表達，SA215-T株的電鏡形態與野毒株無明顯差異，SA215-T株與親本毒株Fa株在細胞中的生長曲線差異不明顯且均達到了較高的病毒滴度。

偽狂犬；gE/gI/US9；重組病毒；基因缺失

偽狂犬病毒(pseudorabies virus，PRV)，為皰疹病毒科，α皰疹病毒亞科，水痘病毒屬，豬皰疹病毒Ⅰ型病毒(suid hepervirusⅠ，SHV-Ⅰ)[1-2]，具備α亞型皰疹病毒典型的粒子結構[3-4]。本試驗所用偽狂犬毒株屬于閩A株(Fa株)偽狂犬病毒，為福建省農科院畜牧獸醫研究所分離、鑒定、保存，并對其進行基因測序，是偽狂犬病毒相關研究所用標準毒株。偽狂犬病毒基因組長約150 kb，由UL(unique long)，US(unique short)區和中間間隔的IRS和TRS重復序列組成。由于重組類型的不同，UL和US可順向或反向連接，形成兩種不同的異構體[5]。偽狂犬病毒能夠侵染并標記神經細胞，并且滿足神經傳導所需要的跨突觸傳導、自我復制和宿主范圍廣的要求[6]且進行動物神經生物學實驗較其他病毒安全。偽狂犬病毒神經傳導具有方向性[7]：野毒株雙向傳導(順行傳導/逆向傳導)，減毒活疫苗株單向傳導(逆向傳導)[8]。病毒順行傳導由US9，gE和gI基因決定[9-10]，它們是偽狂犬病毒軸突內順行轉運的必需基因[11]。US9基因表達產物與神經細胞內微管驅動蛋白3相結合介導病毒順行傳導過程[12]。同時，gE/gI可影響病毒順行傳導至軸突末端后的出胞運動，因此US9，gE和gI都是病毒順行傳導的必需基因。本實驗采用Lipofectamine3000轉染試劑，將PP63質粒與偽狂犬病毒Fa株基因組DNA共轉染BHK-21細胞，空斑篩選得到gI/gE/US9重組缺失病毒，并命名為SA215-T。基因缺失重組病毒SA215-T感染宿主，可使宿主的致死時間更長，并且在突觸間病毒將執行嚴格的逆向轉運，為后續其神經傳導的探索奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

PP63質粒、偽狂犬病病毒閩A株(Fa)株、兔源PRV gE抗體、BHK-21細胞和PK-15細胞由四川農業大學動物生物技術中心提供；脂質體轉染試劑LipofectamineTM3000 Reagent，購于Invitrogen公司；胎牛血清，DMEM，NEAA培養基購自Lifetechnology公司；HS-Taq酶，2×GC bufferⅡ，dNTP購自TaKaRa公司；gE/gI上下游引物由TaKaRa公司合成(表1)；0.8%瓊脂糖培養基自配。

1.2 實驗方法

1.2.1 SA215-T構建

PP63-△gI△Us9是由郭萬柱等[13]構建的偽狂犬病毒重組質粒，該質粒是在偽狂犬 Fa株BamH-7片段的基礎上，通過NcoⅠ酶，敲除了完整的gE基因和部分的gI和US9基因。保留下來的部分△gI、△US9基因片段可作為偽狂犬重組的同源臂。限制性酶切位點NcoⅠ位于gI基因的第889 bp處，StuⅠ位于gI基因的第355 bp處，NcoⅠ位于US9和US2基因的第230 bp處，NcoⅠ切gI后剩余890 bp左右，NcoⅠ-StuⅠ約540 bp，因此gI剩余約350 bp作為同源重組左臂，NcoⅠ切去后US9和US2基因剩余部分約230 bp作為同源重組右臂。因此如果重組病毒構建成功，擴增的目的片段gI約為296 bp，gE基因為0 bp(圖1)。

1.2.2 質粒的制備

圖1 SA215-T構建圖Fig.1 SA215-T schematic diagram

表1 引物序列

Table 1 Sequenses of the primers

引物Primer引物序列Primerssequence(5’-3’)片段長度Lengthoffragment/bpgI-F(121630—121651)CCCTGGACGCGAACGGCACGATFa:2948; SA215-T:296gI-R(124577—124552)CTCCGAGGAGCGCAGCACCACGTGTTgE-F(123224—123248)CATGGTGCTGGGGCCCACGATCGTCFa:531; SA215-T:0gE-R(123754—123731)CGTTGAGGTCGCCGTCGAGGTCAT

采用堿裂解法抽提PP63 DNA，用35 μL Elution Buffer溶解DNA沉淀，振蕩混勻存儲于-20 ℃冰箱備用。

采用氯仿-飽和酚法抽提偽狂犬病毒Fa株的DNA ，用35 μL Elution Buffer溶解DNA沉淀，振蕩混勻存儲于-20 ℃冰箱備用。

1.2.3 PP63質粒和偽狂犬病毒Fa株DNA同源重組

參照Lipofectamine 3000脂質體轉染系統說明書，取3支EP管分別標記為A，B，C。在A管中分別加入3.75 μL Lipofectamine 3000試劑和125 μL DMEM培養基并混勻。在B管中依次加入PP63質粒DNA 7 μL、PRV Fa株DNA 10 μL、P3000試劑5 μL和125 μL DMEM培養基并混勻。取A、B管中各125 μL液體加入C管中，漩渦震蕩后，靜置孵育5 min。將C管中的DNA-脂質體復合物加入至BHK-21細胞中，37 ℃，5% CO2溫箱內孵育細胞2～4 d，至70%的細胞出現細胞病變(CPE)時，收獲重組病毒。將重組病毒液進行10倍比稀釋，每個稀釋度取60 μL依次接種入PK-15細胞六孔盤中，在37 ℃，5% CO2恒溫培養箱內吸附1 h，棄去病毒液，并用無鈣鎂水清洗細胞盤3次，每孔加預熱的0.8%瓊脂糖2 mL，置37 ℃，5% CO2恒溫溫箱中培養，48 h后用萬分之一中性紅染色，待空斑出現。顯微鏡下用鉑耳無菌挑取空斑，加200 μL DMEM搗碎瓊脂塊，反復凍融3次后離心收獲病毒液。將120 μL病毒液接種PK-15單層細胞中對病毒進行擴大培養，收獲病毒液。

1.2.4 重組病毒PCR鑒定

擴增Fa和SA215-T 的gI/gE基因，PCR反應采用20 μL反應體系，gI/gE基因擴增程序為：95 ℃預變性4 min，94 ℃變性40 s，64.5 ℃退火1 min，72 ℃ 延伸1 min，重復35個循環，72℃終延伸10 min，12 ℃終止反應，反應完成后進行瓊脂糖凝膠電泳檢測和DNA測序。

1.2.5 重組病毒SA215-T gE蛋白的Western Blot印跡分析

提前24 h預備兩瓶PK-15細胞，將親本病毒Fa和重組病毒SA215-T分別接種PK-15細胞，待70%的細胞出現CPE時，反復凍融細胞3次，4 ℃，4 000g離心10 min收獲病毒上清液，再將病毒上清液超離后獲得蛋白質沉淀。取適量沉淀加入5×SDS-PAGE loading Buffer上樣緩沖液，煮沸10 min。樣品用12.5%分離膠和4%濃縮膠進行SDS-PAGE電泳，90 V電泳至溴酚藍進入分離膠后，調電壓120 V進行電泳。約4 h后當指示劑到達分離膠前沿2～3 cm處時，即可取出凝膠。取出凝膠加入配制好的考馬斯亮藍R-250染色液中染色過夜。然后用雙蒸水洗掉凝膠表面多余染料，而后加入到脫色液脫色。使用三明治法按陰極夾板、海綿、二層濾紙、凝膠、硝酸纖維素膜、濾紙、海綿、陽極夾板的順序制備夾心。然后將夾心放入Western電泳盒中，4 ℃，90 V，電泳6 h，將凝膠中的蛋白質轉移到硝酸纖維素膜上。將硝酸纖維素膜甲醇固定后置3%牛血清白蛋白(BSA)中室溫下封閉1 h。PBS-T洗滌3次后加PRV gE抗體，37 ℃濕盒作用1 h。繼續用PBS-T洗滌3次，加入酶標SPA，37 ℃濕盒作用1 h。PBS-T洗滌3次后加入新鮮配制的4-氯-1-萘酚底物溶液，待條帶特異性顯色后加入冰乙酸終止反應。

1.2.6 重組病毒形態學鑒定

PRV Fa株和PRV SA215-T株以感染復數(multiplicity of infection，MOI)為1接種PK15單層細胞，感染后48 h，細胞CPE約為70%時收集細胞，4 ℃，4 000g低速離心8 min成小球，棄上清后取細胞沉淀，用含有2.5%的戊二醛固定1 h，低熔點瓊脂糖包埋。在乙醇中逐級脫水，在氧化丙烯中透明。包埋于812環氧樹脂中，59 ℃聚合作用4 d。超薄切片并用乙酸雙氧鈾染色后，使用H600透射電鏡照相。

1.2.7 病毒生長曲線測定

取兩個長寬約為6 cm × 10 cm的細胞瓶，各接種6 mL的PK-15消化細胞，細胞濃度約為2×106個·mL-1，在37 ℃，5% CO2的恒溫培養箱內培養過夜，待細胞形成致密單層時各按MOI數值約為0.1的比例接種偽狂犬病毒Fa和重組病毒SA215-T。分別于6，12，24，36和48 h時吸取病毒上清液通過病毒空斑實驗測定計算出病毒滴度。

2 結果與分析

2.1 PRV基因缺失病毒SA215-T構建和 PCR鑒定

采用Lipofectamine 3000轉染試劑，將PP63質粒與偽狂犬病毒Fa株基因組DNA共轉染BHK-21細胞，經過空斑篩選，獲得了PRVgI/gE/US9重組缺失病毒，命名為SA215-T。

使用PK-15單層細胞對重組病毒空斑進行擴大培養后，收獲病毒液。提取病毒DNA，通過PCR方法鑒定收獲的病毒液gE/gI/US9是否缺失，結果如圖2所示，重組病毒SA215-TgI引物擴增的片段為296 bp，gE基因無電泳條帶，與預期的結果一致，表明SA215-T的gE和gI基因有效缺失。

2.2 重組病毒SA215-T gE蛋白免疫印跡

PRV重組病毒SA215-T及其親本毒Fa株Western Blot檢測結果見圖3，結果顯示重組病毒SA215-T株并不能與gE抗體顯色，而對照組親本株Fa株可見到特異性的染色條帶，蛋白大小與預期一致。

2.3 重組病毒SA215-T電鏡檢測

對重組病毒SA215-T與親本毒偽狂犬Fa株分別進行電鏡檢測，發現兩者存在相似的病毒粒子形態，均呈現偽狂犬病毒的典型結構(圖4)。

2.4 重組病毒SA215-T生長曲線測定

通過對重組病毒SA215-T生長曲線的測定，發現6 h取樣時SA215-T和Fa的病毒滴度水平(pfu·mL-1)均保持在6左右，6 h后Fa病毒的增

M1，DL 2000；M2，250 bp DNA Ladder Marker；1，SA215-T gE基因擴增；2，Fa gE基因擴增；3，SA215-T gI基因擴增；4，Fa gI基因擴增。Lanes: M1， Marker DL2000; M2， 250 bp DNA Ladder Marker; 1， Samples of SA215-T amplified by gE-F/R primers; 2， Fa amplified by gE-F/R primers; 3， SA215-T amplified by gI-F/R primers; 4， Fa amplified by gI-F/R primers.圖2 重組病毒SA215-T gE/gI基因的PCR鑒定Fig.2 Identification of Fa and recombinat PRV by PCR amplication of gE/gI genes

M，蛋白質marker；Fa，Fa株gE蛋白(約62.8 ku)；SA215-T，SA215-T株gE蛋白M， Marker；Fa， gE protein in Fa；SA215-T， gE protein in SA215-T圖3 Western Blot免疫印跡圖Fig.3 Western Blotting of gE protein

長速度略微快于SA215-T的速度，并且兩者在12 h時都開始進入病毒生長的平穩期。24 h到48 h時兩株病毒滴度無明顯差異，并且都保持在8.5左右的較高滴度水平(pfu·mL-1)(圖5)。病毒空斑檢測方法見圖6，箭頭所指處為病毒在PK-15細胞中形成的空斑。

A，SA215-T細胞電鏡圖(×40 000)；B，Fa細胞電鏡圖(×30 000)；黑色箭頭所指是病毒顆粒A：Electron microscope of SA215-T (×40 000); B： Electron microscope of Fa (×30 000); Two types of virus particles are indicated by the black arrow圖4 PK-15細胞感染偽狂犬SA215-T和Fa細胞電鏡圖Fig.4 Electron microscope analysis of PK-15 cells infected by PRV SA215-T and Fa

圖5 SA215-T和Fa在PK-15細胞中生長曲線圖Fig.5 Growth curve analysis of the recombinant SA215-T

箭頭所指處為病毒空斑Arrows indicate to viral plaques圖6 重組病毒空斑試驗Fig.6 Plaque-formation assay for selecting recombinant virus

3 討論

目前，偽狂犬病毒弱毒株主要是通過自然致弱和人工改造完成。其中自然致弱毒多數是由雞胚傳代獲得，如Bartha株。人工致弱毒又以重組改造為主，偽狂犬病毒具有復雜而龐大的基因組，其基因難以通過酶切、定點突變等方式敲除，而同源重組是解決這個問題的有效途徑。本實驗所用PP63-△gI△US9是由郭萬柱，王琴構建的偽狂犬病毒重組質粒[13]，該質粒是在偽狂犬Fa株BamHⅠ-7 片段的基礎上，通過NcoⅠ酶，敲除了完整的gE基因和部分的gI和US9基因。保留下來的部分△gI、△US9基因片段可作為偽狂犬病毒基因重組的同源臂。有研究表明，脂質體法有比磷酸鈣法更高的DNA轉染效率[14]，因此本實驗采用Lipofectamine 3000脂質體轉染體系將PP63質粒和偽狂犬Fa株基因組共轉染入BHK-21細胞中。但是鑒于重組技術的效率問題，體系中除含有gI/gE/US9缺失的重組病毒外，還含有大量的偽狂犬野毒和部分的PP63質粒，因此還需要對重組病毒進一步進行純化。本實驗采用倍比稀釋法，將重組病毒液進行10倍倍比稀釋，然后將最高稀釋倍數的病毒接種到盛有PK-15細胞的六孔盤中，經過反復10次的空斑篩選和PCR鑒定，最終獲得了gI/gE/US9成功缺失的重組病毒SA215-T。

本研究還對重組病毒基因缺失位點進行了測序，基因測序結果準確描述了SA215-TgI/gE/US9三基因缺失的位點。為了更進一步驗證SA215-T的基因缺失情況，本實驗分別對SA215-T以及親本毒Fa的gE蛋白進行了Western Blot免疫印跡檢驗，結果顯示SA215-T并不能與gE抗體發生反應，說明SA215-T囊膜已不具備gE蛋白結構。成熟的偽狂犬病毒結構包含了核酸，衣殼，間質和囊膜4個部分，通過電鏡檢查可觀察到SA215-T和Fa兩者都保留著皰疹病毒的超微形態，說明gI/gE/US9三基因的缺失并未對病毒的基本結構產生顯著的影響。

本實驗測定了SA215-T與親本株Fa在PK15細胞上的體外生長曲線，結果表明兩者在細胞上的生長特性沒有明顯差異。說明gE基因是偽狂犬病毒復制的非必需基因，雖然gE缺失后會影響病毒在細胞間的擴散作用，但是gC對細胞的黏附作用能彌補gE缺失后病毒擴散能力的不足，因此缺失株仍能保證較高的感染滴度。三基因缺失病毒SA215-T滴度隨時間的延長增長速率會略低于親本毒Fa，但是12 h后兩種病毒都可以達到較高的滴度，表明gE基因缺失在一定程度上影響了病毒在細胞上的生長速率，但是累積的病毒數量卻未發生明顯變化。這為后續SA215-T小鼠體內神經侵染實驗奠定了良好的基礎。

[1] 劉中原，劉石，徐衛松，等. 利用PCR技術對豬偽狂犬疫苗含毒量的評價 [J]. 浙江農業科學，2013 (4)：475-477. LIU Z Y， LIU S， XU W S， et al. Using PCR technology to the pig pseudo rabies poisonous content evaluation. [J].JournalofZhejiangAgriculturalSciences， 2013 (4)：475-477. (in Chinese)

[2] 邵定勇，黃紅亮，唐兆新，等. 豬偽狂犬病病毒TK/gE雙基因缺失株PRV/TK-/gE-的構建及其生物學特性[J]. 中國獸醫科學，2013， 43(11)：1127-1132. ZHAO D Y， HUANG H L， TANG Z X， et al. Construction and biological characterization ofTK/gE-null recombinant pseudorabies virus [J].ChineseVeterinaryScience， 2013， 43(11)：1127-1132. (in Chinese with English abstract)

[3] WANG Y， QIAO S， LI X， et al. Molecular epidemiology of outbreak-associated pseudorabies virus (PRV) strains in central China.[J].VirusGenes， 2015， 50(3)：401-9.

[4] 耿文學，唐波，華濤，等. 免疫增強劑對豬偽狂犬滅活疫苗的免疫增強作用 [J]. 浙江農業學報，2016，28(11)：1828-1833. GENG W X， TANG B， HUA J B， et al. Improved immune efficiency of inactivated vaccine of pseudorabies virus by immunopotentiator [J].ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2016， 28(11)：1828-1833. (in Chinese with English abstract)

[5] 范克偉，戴愛玲，李曉華，等. 豬源偽狂犬病病毒福建龍巖分離株的鑒定及其TK基因和gE基因的分子特征 [J]. 中國獸醫科學，2015，45(10)：1021-1030. FAN K W， DAI A L， LI X H， et al. Identification of pseudorabies virus isolated from swine in Longyan of Fujian province and molecular characteristics ofTKandgEgenes of the isolate [J].ChineseVeterinaryScience， 2015， 45(10)：1021-1030. (in Chinese with English abstract)

[6] KLUPP B G， HENGARTNER C J， METTENLEITER T C， et al. Complete， annotated sequence of the pseudorabies virus genome [J].JournalofVirology， 2004， 78(1)：424-440.

[7] BEIER K T， SAUNDERS A， OLDENBURG I A， et al. Anterograde or retrograde transsynaptic labeling of CNS neurons with vesicular stomatitis virus vectors [J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica， 2011. 108(37)：15414-15419.

[8] TONG W， LIU F， ZHENG H， et al. Emergence of a Pseudorabies virus variant with increased virulence to piglets [J].VeterinaryMicrobiology， 2015， 181(3/4)：236-240.

[9] BRITTLE E E， REYNOLDS A E， ENQUIST L W. Two modes of pseudorabies virus neuroinvasion and lethality in mice [J].JournalofVirology， 2004， 78(23)：12951-12963.

[10] CONG X， LEI J L， XIA S L， et al. Pathogenicity and immunogenicity of a gE/gI/TK gene-deleted pseudorabies virus variant in susceptible animals [J].VeterinaryMicrobiology， 2016， 182：170-177.

[11] GU Z， DONG J， WANG J， et al. A novel inactivated gE/gI deleted pseudorabies virus (PRV) vaccine completely protects pigs from an emerged variant PRV challenge [J].VirusResearch， 2015， 195：57-63.

[12] LYMAN M G， FEIERBACH B， CURANOVIC D， et al. Pseudorabies virus Us9 directs axonal sorting of viral capsids [J].JournalofVirology， 2007， 81(20)：11363-11371.

[13] 張銀梅， 郭萬柱，汪銘書，等. 偽狂犬病病毒Fa株gp63(gⅠ)基因轉移載體質粒的構建 [J]. 畜牧獸醫學報，2001，32(4)：338-344. ZHANG Y M， GUO W Z， WANG M S， et al. Construction of transfer vector plasmid of pseudorabies virus-Fa strain [J].ACTAVeterinariaetZootechnicaSinica， 2001， 32(4)：338-344. (in Chinese with English abstract)

[14] PA?VOGEL L， KLUPP B G， GRANZOW H， et al. Functional characterization of nuclear trafficking signals in pseudorabies virus pUL31 [J].JournalofVirology， 2015， 89(4)：2002-2012.

(責任編輯 盧福莊)

ConstructinggE，gIandUS9 gene deletion strain of pseudorabies virus

FAN Yi1， LI Bi1, GUO Wanzhu1， LI Ping1，HUANG Jianbo1， YANG Fan1， JIANG Ziyi1， ZHAO Jun1， XU Siyao1,DENG Yichao1， YIN Yue1， MAO Xiyu1， LYU Wenting1， XU Zhiwen1，2， ZHU Ling1，2，*

(1.VeterinaryMedicineCollegeofSichuanAgriculturalUniversity，Chengdu611130,China; 2.KeyLaboratoryofAnimalDiseaseandHumanHealthofSichuanProvince，SichuanAgriculturalUniversity，Chengdu611130，China)

Pseudorabies virus (PRV)， a member of Herpes virus has an extremely broad range in nature and threatens the pig-industry development in our country. To explore the mechanism of nerve conduction of PRV， a virus mutant with a deletion ingE，gIandUS9 genes was constructed. Plasmid of PP63 and pseudorabies virus Fa strain genomic DNA were co-transfected into BHK-21 cells by using Lipofectamine 3000 transfection reagent， and a recombinant virus with the deletion ofgI/gE/US9 ， named SA215-T， was screened and purified by plaque assay. PCR， gene sequencing. Western Blot， electron microscope and growth curve were used for identification of the deletion of genes， and features of the recombinant. The results showed that SA215-T was with effective deletion ofgIandgEgene by PCR，and was absent in the expression ofgEgene by Western Blot. There were no obvious differences in the morphology and growth curve of the recombinant virus as compared to its parental virus， they both achieved a high viral titer in cells.

pseudorabies virus;gI/gE/US9 gene; recombinant virus; gene deletion

http://www.zjnyxb.cn

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.04.04

2016-11-13

國家“十二五”科技支撐計劃項目(2015BAD12B04)；四川省科技支撐計劃(2014NZ0043,2017NZ0038)；長江學者與創新團隊發展計劃(IRT13083)

樊毅(1990—)，男，四川資陽人，碩士研究生，研究方向為動物傳染病病原分子生物學。E-mail: 348840733@qq.com

*通信作者，朱玲，E-mail: abtcxzw@126.com

S852.65；[Q812]

A

1004-1524(2017)04-0542-06

浙江農業學報ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2017，29(4): 542-547

樊毅，李碧，郭萬柱，等. 偽狂犬病毒gE、gI和US9三基因缺失株的構建[J].浙江農業學報，2017，29(4): 542-547.