不同雞種DMA基因序列比較分析

孔令琳，鄭圣晗，陳 穎，朱鵬飛，吳 允，郭其新，陳國宏，常國斌

(揚州大學 動物科學與技術學院，江蘇 揚州225009)

不同雞種DMA基因序列比較分析

孔令琳，鄭圣晗，陳 穎，朱鵬飛，吳 允，郭其新，陳國宏，常國斌*

(揚州大學 動物科學與技術學院，江蘇 揚州225009)

DMA(major histocompatibility complex， class Ⅱ， DM alpha)基因是雞MHC Ⅱ類典型基因座，與免疫反應和抗病性密切相關。試驗對25個不同雞種的DMA基因序列進行目標捕獲測序，以NCBI上Gallusgallus的DMA基因序列作為參考序列，通過MEGA6軟件進行序列比對分析，篩選出不同雞種DMA基因序列上的SNPs和Indels(insertion-deletion)位點以及氨基酸的變化，并根據基因序列的差異構建系統進化樹，探究不同雞種間的同源性。結果表明，DMA基因呈現出豐富的多態性，突變和缺失位點集中于外顯子上，且多個雞種在第2外顯子發生多位堿基缺失，導致其氨基酸序列發生極大改變，可能是不同雞種產生抗性差異的主要因素；同時進化樹也顯示，斗雞、藏雞等抗性較好的雞種間有相近的親緣關系，同源性較高。以上結果表明，DMA基因有豐富的遺傳多樣性，且與不同雞種的先天免疫與抗病特性差異相關，第2外顯子中94 496～94 552的Indels可以作為雞免疫特性的候選標記。

雞；DMA基因；MHC；SNPs；Indels；進化樹

DMA(major histocompatibility complex， class Ⅱ， DM alpha)基因是雞主要組織相容性復合體(MHC)基因家族一個Ⅱ類典型基因座。禽類MHC又被稱為B復合物，位于16號染色體，其結構較哺乳動物的MHC更加緊湊短小，核心區域BF/BL區包含19個基因，DMA即為其中一個典型基因座，位于ClassⅡ區[1]，與DMB1、DMB2基因合稱DM基因，都與抗原加工與呈遞有關，它們共同編碼DM分子，DMA與DMB分別編碼DM分子的α鏈和β鏈，研究發現，DM分子為非經典分子，不像其他經典ClassⅡ區分子一樣表達于細胞表面，而是作為Ⅱ類分子的分子伴侶在MHC Ⅱ類分子的抗原呈遞過程中起決定性作用，作用為移除恒定鏈并使外源性抗原結合到抗原槽中。由于DM分子所處位置及其特殊功能，與DM分子相關聯的疾病幾乎都與自身免疫有關，這表明DMA基因在免疫性疾病的發病過程中發揮了一定的作用[2-3]。目前針對DMA基因的研究大多集中于人類或小鼠等哺乳動物上，家禽這方面的研究相對較少，而雞作為人類的主要肉類來源之一，針對其抗性及抗病育種的研究都有重要意義。因此，本研究利用目標捕獲測序法對25個不同雞種DMA基因序列進行測序，探究抗性不同的雞種中DMA基因發生的SNPs、Indels并對其進行系統分類比對分析，以探明該基因的遺傳多樣性，為家禽免疫遺傳學和抗病育種提供參考依據。

1 材料與方法

本研究共選取25個雞品種，其中白耳雞(BE)、茶花雞(CH)、大骨雞(DG)、斗雞(DJ)、固始雞(GS)、狼山雞(HL)、鹿苑雞(Lu)、泰和烏骨雞(WG)、仙居雞(XJ)、蕭山雞(XS)、北京油雞(YJ)、藏雞(ZJ)等12個地方雞種來自于中國農業科學研究院家禽科學研究所，紅色原雞(HY)采自云南省野生動物救護中心，安卡雞(AK)、廣西黃雞(GX)、 SPF-來航雞(SPF-LH)、東鄉綠殼蛋雞(LK)、羅斯雞(LS)、溧陽雞(LY)、青腳麻雞(QJ)、如皋黃雞(RG)、太湖雞(TH)、文昌雞(WC)、雪山雞(XC)、隱性白羽雞(YB)等12個雞種來自揚州大學動物科學與技術學院遺傳資源實驗室禽種資源基因庫。每個雞種隨機選取10羽雞，翅下靜脈采血2 mL，用苯酚-氯仿法提取DNA，DNA樣品濃度要求大于50 ng·μL-1，4 ℃冷藏保存。將DNA樣品送深圳華大基因公司(BGI)進行目標序列捕獲測序。

雞的MHC基因位于16號染色體上，針對此區域，進行目標區域捕獲測序，雞的MHC基因長約98 kb。針對此區域捕獲是利用SureSelectTargetEnrichment Kit定制試劑盒并按照Aglient(中國)公司的說明書通過基因組DNA與設計的RNA探針雜交完成的。將捕獲的基因組DNA運用IlluminaHiSeq 2000測序儀進行PE 100雙末端測序，測序的流程為：首先對樣本進行濃度及完整性的檢測；質檢合格后進行文庫的構建，運用超聲破碎的技術將基因組打碎，回收長度約為500 bp的DNA片段，兩端進行修復以及加接頭，橋式PCR完成文庫的構建；庫檢合格后上機測序即可。

針對目標捕獲測序結果的初始數據，首先去除reads中的接頭污染，然后將reads中超過50%的低質量堿基去除(quality value ≤ 5 (E))，確保分析數據的高質量性。以NCBI上Gallusgallus(GG)的DMA基因堿基序列為參考序列，利用MEGA6軟件對25個雞種的核苷酸序列與參考序列進行比對，分析核苷酸突變位點和插入缺失位點以及氨基酸變化位點，最后運用鄰接法(neighbour joining)構建進化樹(phylogenetic tree)。

2 結果與分析

2.1DMA基因序列分析

本研究以NCBI上Gallusgallus的DMA基因(Gene ID: 417050)堿基序列為參考序列。由圖1可知，Gallusgallus的DMA基因位點為93 874～96 249，共2 210 bp，其中外顯子4個，內含子3個。

2.2 不同雞種中DMA基因SNPs位點及Indels位點統計

目標捕獲測序結果中目標區域測序深度達6×以上，覆蓋度達89.2%。使用MEGA6軟件比對26段DMA基因序列(包括參考序列)后發現，DMA基因在25個雞種中共有52個SNPs和Indels位點，基本位于Exon2、Exon3、Exon4上，多數集中于Exon2，僅5個SNPs和Indels位點位于內含子，可見DMA基因有較好的多態性(表1)。

2.3 DMA基因外顯子SNPs位點分布

由表2可知，25個雞種中，僅羅斯雞沒有SNPs位點，黑狼山雞、茶花雞、東鄉綠殼蛋雞等雞種存在較少SNPs位點，而斗雞、固始雞、SPF-來航雞等雞種的SNPs位點較多，大部分突變位點為有義突變，這表明DMA基因的SNPs位點與雞種的抗病力密切相關，抗性較好的雞種SNPs普遍多于抗性差的雞種。

圖1 NCBI中紅色原雞DMA基因序列Fig.1 DMA gene sequences of Gallus gallus in NCBI

表1 不同雞種中DMA基因外顯子和內含子核酸變化

Table 1 Nucleotide variations in exons and introns ofDMAgene

位置Sites范圍Range長度Length/bpSNPs及Indels個數NumbersofSNPsandIndels比例Percentage/%外顯子1Exon193874—9400012700外顯子2Exon294450—947162673412.73外顯子3Exon395639—9592028241.42外顯子4Exon496011—9624923993.77內含子1Intron194001—9444944910內含子2Intron294717—9563892240.53內含子3Intron395921—960109000

表2 不同雞種中DMA基因在外顯子上的突變分布表

Table 2 SNPs distribution ofDMAgene in different breeds

雞種Breeds外顯子2Exon2位點SitesSNPs外顯子3Exon3位點SitesSNPs外顯子4Exon4位點SitesSNPsAK94669C/T95903C/A96059A/GBE94526;94669A/G;C/T95667;95903T/C;C/A96046;96085;96104G/A;C/T;C/TYJ94669C/T95646;95667;95903C/G;T/C;C/A96106C/ACH95646C/GDG96046;96106;96137G/A;C/A;C/TDJ94540;94554;94559;94565;94669G/A;A/G;G/A;A/G;C/T95646;95667C/G;T/C96046G/AGX94565;94669A/G;C/T95667;95903T/C;C/A96137C/TGS94540;94554;94559;94565G/A;A/G;G/A;A/G95667;95903T/C;C/A96106C/AHY95889T/C96046G/ALK95646C/G96108C/TSPF-LH94540;94554;94559;94565;94669;94710G/A;A/G;G/A;A/G;C/T;A/G95667;95903T/C;C/A96046G/AHL95646C/GLu95646;95903C/G;C/ALY94669C/T95646;95667;95903C/G;T/C;C/A96109G/CQJ94595;94669G/C;C/T95646;95903C/G;C/A96137C/TRG94669C/T95646;95903C/G;C/A96046G/ALSTH94669C/T95667;95903T/C;C/A96046G/AWC95667;95903T/C;C/A96046;96062;96085;96104G/A;T/C;C/T;C/TWG94669C/T95646;95889;95903C/G;T/C;C/A96106C/AXC95667;95903T/C;C/A96046G/AXJ95646C/GXS95646;95667;95903C/G;T/C;C/AYB95646C/G96137C/TZJ94669C/T95903C/A96059A/G

“/”前的為突變前的堿基，“/”后的為突變后的堿基。

The base before and after symbol “/” represents the base before and after mutation.

經比對，25個不同雞種中Indels位點均存在于Exon2，由表3可見，共有15個雞種在94 497～94 511位點發生基因缺失，其中SPF-來航雞和固始雞在94 552～94 565位點也發生了缺失，而20個雞種在624位點都插入了一個堿基G，這些都導致DMA基因Exon2翻譯產物發生巨大的變化，顯示出極高的多態性。

2.4 不同雞種DMA基因進化樹分析

將26個不同雞種(包括參考序列)DMA基因的完整序列整合為FASTA格式，利用MEGA6對25個雞品種的DMA基因序列與參考序列進行對比分析，分析其同源性，如圖2，選用Construct/Test Neighbor-Joining Tree(NJ)法構建進化樹，Bootstrap的值設置成500。Bootstrap consensus tree如圖3。

由圖3可知26個雞種主要分為3大類，東鄉綠殼蛋雞、茶花雞、狼山雞、隱性白羽雞、羅斯雞等雞種類聚在一起；泰和烏骨雞單獨為一類；斗雞、廣西黃雞、藏雞等抗性較好的中國地方雞種類聚在一起。上述結果表明，DMA基因在進化過程中存在豐富的遺傳多樣性，可能對不同雞種的抗性產生了影響。

3 討論

MHC基因家族作為基因組中多態性最高的基因之一，其多態性與物種抵抗多種疾病的能力存在著密切的關系。DM基因的發現是由Cho等[4]通過對小鼠MHC(H2)黏粒的篩選得到3個新的Ⅱ類相關序列而來，這3個序列后被命名為H2-MA、MB1、MB2。隨后Kelly用探針5.22D和5.22C獲得了人HLA的cDNA克隆RING6和RING7，分別命名為HLA-DMA和DMB，目前在許多高等動物中都發現了該基因的同源基因[5]。DMA基因所編碼的DM分子，在抗原加工呈遞過程中，作為經典的MHC Ⅱ類分子的分子伴侶發揮重要作用。

表3 不同雞種DMA基因第二外顯子Indels分布表

Table 3 Indels distribution in exon2 ofDMAgene in different breeds

堿基起始位點InitiationsitesIndels堿基Bases雞種Breeds94496I1GLS、DJ、GS、ZJ、WG、XC、HY、XS、YB、CH、AK、YJ、DG、WC、TH、LY、LK、GX、XJ、BE94497D14ACATCAGTGGGGACZJ、AK、QJ、DG、DJ、WC、YB、XS、CH、LU、RG、YJ、BE、SPF-LH、GS94552D14ACACATCGGTGGGASPF-LH、GS

D和I分別表堿基缺失和插入，后面帶的數字表示堿基數，即I1表示有1個堿基插入。

D and I represents base deletion and insertion， the followed number represents the base number， for example， I1 represents there was one base insertion.

圖2 二十五個雞種間親緣關系分析Fig.2 Genetic relationship analysis of 25 chicken breeds

圖3 不同雞種NJ系統進化樹Fig.3 Neighbor-joining phylogenetic tree of different breeds

本研究結果表明，DMA基因的4個外顯子中，Exon2、Exon3、Exon4上均存在堿基的突變和缺失，Exon1高度保守，多態性主要集中于Exon2，尤其Exon2上多個雞種發生基因缺失導致氨基酸序列發生巨大變化，顯示出DMA基因極高的多態性，且與不同雞種的抗病力和環境適應力直接相關，這與MHC Ⅱ類D區中經典基因的多態主要集中在外顯子2的結論相符。而關于豬的DMA基因相關研究卻并未得出相同結論，這可能與物種差異有關[6]。其中羅斯雞沒有發生位點突變，僅發生一個位點插入，隱性白羽雞也基本沒有SNPs位點，這可能與它們是國外雞種，且生長速度快、性成熟早，抗性差有關。黑狼山雞等中國地方雞種DMA基因序列上的突變位點也相對較少，可能與保種群體相對較小有關。斗雞、藏雞、固始雞這類抗病力好、抗逆性強的中國地方雞種序列上SNPs位點相對較多。25個雞種中有80%在第2外顯子的94 496位點有堿基插入，藏雞、安卡雞、青腳麻雞、大骨雞、斗雞、文昌雞、隱性白羽雞、蕭山雞、茶花雞、鹿苑雞、如皋黃雞、北京油雞、白耳雞、SPF-來航雞、固始雞均在94 497發生了14位Indels，其中固始雞和SPF-來航雞在94 552位點又發生14位Indels，這些可能都與DMA基因所編碼的DM分子在免疫應答中所處位置與作用有關，可將第2外顯子中94 496～94 552的Indels可以作為雞免疫特性的候選標記。其余外顯子及內含子的多態位點則十分有限，這可能與DMA基因并非Ⅱ類經典基因，進化上更為保守有關。系統進化樹將斗雞、藏雞、固始雞這一類抗性好、適應性強的雞種與羅斯雞等外來雞種明顯分開，這進一步表明了DMA基因多樣性能真實反映不同雞種的起源與遺傳背景。隱性白羽雞、羅斯雞等外來雞種與我國地方雞種并沒有形成單獨分類，這可能與這些國外雞種是由我國部分雞種如黑狼山雞雜交育成有關，在進化樹上的位置也離黑狼山雞比較近。文昌雞、大骨雞在進化樹上與其余雞種的位置都相對較遠，這可能與它們的原產地位置偏僻有一定的聯系。泰和烏骨雞單獨分為一類可能與其獨特的血型有關[7]，其余中國地方雞種分布無明顯規律。

Nikolich-zugich等[8]發現，雞MHC基因多態性和多種傳染性疾病的遺傳抗性高度相關。目前針對雞的DMA基因的研究報道還相對較少，哺乳動物這方面的研究比較透徹。事實上雞MHC上所有基因在哺乳動物MHC上都有對應基因，雞DMA基因與哺乳動物DMA基因屬于直系同源基因。國際HLA因子命名委員會已認定的DMA和DMB基因的有限等位基因與Ⅰ型糖尿病、類風濕性關節炎和系統性紅斑狼瘡等疾病均存在顯著的相關性，且在不同人種中分布頻率存在一定的差異。許多研究發現DM可能與機體保護性的免疫反應和自身免疫均有關聯。Toussirot等[9]研究發現，DMA基因是風濕性關節炎發病的正性相關基因，且與發病相關部位內皮下淋巴結有關。桑艷梅等[10]發現，DM基因與Ⅰ型糖尿病的相關性之間存在一定的劑量效應規律。Morel等[11]發現，HLA-DM基因多態性對SLE的發生有一定的影響。磨美蘭等[12]通過對SLA-DM等Ⅱ類分子表達研究，表明豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)感染早期對豬肺泡巨噬細胞的外源性抗原加工和遞呈功能產生顯著影響，導致其外源性抗原遞呈功能下降，進而影響機體的體液免疫應答。關于雞DMA基因與疾病間相關性的研究尚不多見，仍有很大的空間。

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(責任編輯 張 韻)

Comparative analysis ofDMAgene sequences in different chicken breeds

KONG Linglin， ZHENG Shenghan， CHEN Ying， ZHU Pengfei， WU Yun， GUO Qixin， CHEN Guohong， CHANG Guobin*

(CollegeofAnimalScienceandTechnology，YangzhouUniversity，Yangzhou225009，China)

DMA(major histocompatibility complex， class Ⅱ， DM alpha) is a typical gene of chicken MHC class Ⅱ， which is closely related to the host immune response and disease resistance. In this study， we detectedDMAgene of 25 different chicken breeds by target capture sequencing and usedDMAgene sequence ofGallusgallusin NCBI as the reference. Then we analyzed gene sequence by MEGA6， screened SNPs (single nucleotide polymorphism) and Indels (insertion-deletion) ofDMAgene sequences in different chicken breeds. Finally， we constructed the phylogenetic tree according to the differences in gene sequences. The results revealed that theDMAgene appeared rich polymorphism. SNPs and Indels were concentrated on exons mostly. Meanwhile， base deletions on exon2 caused the great changes in its translated products. In addition， the phylogenetic tree showed the chickens with better disease resistance such as Tibetan chicken and game chicken had high homology. The above results demonstrated that theDMAgene is rich in genetic diversity which is related to the differences in innate immunity and disease resistance in chicken breeds. The Indels in exon 2 94 496-94 552 can be used as a candidate marker of chicken immune characteristics.

chicken;DMAgene; MHC; SNPs; Indels; phylogenetic tree

http://www.zjnyxb.cn

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.04.07

2016-11-02

國家科技支撐計劃(2015BAD03B03)；江蘇高校優勢學科建設工程資助項目

孔令琳(1994—)，女，江蘇揚州人，碩士研究生，從事家禽遺傳育種研究。E-mail:1921714112@qq.com

*通信作者，常國斌，E-mail: passioncgb@163.com

S831

A

1004-1524(2017)04-0560-06

浙江農業學報ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2017，29(4): 560-565

孔令琳，鄭圣晗，陳穎，等. 不同雞種DMA基因序列比較分析[J].浙江農業學報，2017，29(4)： 560-565.