高效豬毛角蛋白降解菌株的分離與鑒定

雷 平，劉 標，尹紅梅

(湖南省微生物研究院，湖南 長沙 410009)

高效豬毛角蛋白降解菌株的分離與鑒定

雷 平，劉 標，尹紅梅

(湖南省微生物研究院，湖南 長沙 410009)

為了篩選能高效降解豬毛角蛋白的微生物，從長期堆放廢棄豬毛的土壤中取樣，采用以豬毛粉為唯一碳氮源的培養基分離角蛋白降解菌，并對其產角蛋白酶條件進行了研究。通過馴化培養后，篩選到5株能夠降解豬毛角蛋白的菌株，其中菌株E-2降解效果最佳。將E-2接種到以豬毛為唯一碳氮源的培養基中培養5 d后，豬毛降解率達58.6%，發酵液中角蛋白酶活為46.6 U·mL-1。結合形態學觀察、生理生化特征及ITS序列分析，鑒定該菌株為解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)。E-2產酶影響條件實驗結果表明，培養108 h后酶活性最高，產角蛋白酶最適條件為pH值6.0～7.0，溫度35～40 ℃，豬毛粉添加量15 g·L-1。E-2能降解豬毛、雞毛、羊毛，但降解活性及產酶活性均不同。該菌株的分離篩選為微生物降解豬毛角蛋白提供了新的菌種資源，至今未見解脂耶氏酵母在降解毛發角蛋白方面的相關報道。

豬毛角蛋白；角蛋白降解菌；解脂耶氏酵母

隨著生豬規模化養殖的發展，如何無害化處理病死豬是所有養殖場必須面對和解決的問題[1]。根據中國農業部2013年頒布的《病死動物無害化處理技術規范》，中國病死動物無害化處理技術主要包括4類，即焚燒法、化制法、掩埋法和發酵法，其中，發酵法是指將動物尸體與稻糠、木屑等輔料混合，加入特定的微生物，發酵動物尸體，最后將病死動物變為有機肥的過程。國內外研究表明，堆肥發酵法可以較好地分解畜禽尸體，且堆肥過程中產生的高溫能有效殺死其中的病原微生物，是一種低成本的死畜禽(因重大動物疫病和人畜共患病死亡的動物尸體除外)處理方法，目前已經在國內外得到了較多的研究與應用[2-7]。

目前，畜禽尸體堆肥使用的菌劑對堆體中豬毛的降解效果不佳，導致堆肥產品中豬毛含量高，不但影響肥料的品質，而且會污染環境。豬毛的主要成分是角蛋白，含量達95%以上，它是一種結構蛋白，性質非常穩定，不容易被一般的蛋白酶水解[8]。近年來，利用微生物降解羽毛角蛋白的研究報道較多，已分離出能降解羽毛角蛋白的微生物包括細菌[9-10]、真菌[11-12]和放線菌[13]等，而專門針對豬毛角蛋白降解的研究較少報道。因此，本實驗擬從長期堆積廢棄豬毛的周邊土壤中取樣，分離能高效降解豬毛角蛋白的微生物菌株，旨在為豬毛的降解提供微生物資源，促進堆肥法在處理畜禽死體方面的應用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土樣

土壤采集自長沙市某生豬屠宰場長期堆積廢棄豬毛處。

1.1.2 角蛋白材料

豬毛及豬毛粉：收集生豬屠宰場廢棄的豬毛，用蒸餾水洗凈，60 ℃烘箱中烘干至恒質量。將烘干豬毛粉碎后過60目篩即制成豬毛粉。

雞毛、羊毛：收集屠宰場周圍廢棄的雞毛、羊毛，用蒸餾水洗凈，烤箱烘干至恒質量。

1.1.3 培養基

馴化培養基：豬毛粉10.0 g·L-1，K2HPO41.0 g·L-1，KH2PO40.5 g·L-1，NaCl 0.5 g·L-1，pH 7.0。

篩選培養基：在馴化培養基的基礎上添加2%的瓊脂粉。

降解培養基：豬毛粉10.0 g·L-1(或豬毛10.0 g·L-1)，K2HPO41.0 g·L-1，KH2PO40.5 g·L-1，NaCl 0.5 g·L-1，pH 7.0。

牛肉膏蛋白胨培養基：牛肉膏3.0 g·L-1，蛋白胨10.0 g·L-1，NaCl 5.0 g·L-1，pH 7.0。

PDA培養基：馬鈴薯200 g·L-1，葡萄糖20 g·L-1，瓊脂 15 g·L-1，自然pH，115 ℃高溫滅菌30 min。

以上培養基除PDA外，其余均121 ℃高溫滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 豬毛角蛋白降解菌的分離及初篩

稱取10.0 g土樣加入到內含90 mL無菌0.9% NaCl的錐形瓶中，充分混勻，靜置30 min。取5 mL上清液加入到含有100 mL馴化培養基的錐形瓶中，30 ℃、180 r·min-1培養96 h。取馴化后的菌液10倍梯度稀釋后，涂布在含有豬毛粉的篩選培養基平板上，篩選生長良好的單菌落，牛肉膏蛋白胨試管斜面保存待用。

1.2.2 豬毛角蛋白降解率測定

采用失重法測定豬毛的降解率。將1.2.1節中初篩獲得的5株菌株分別接種至牛肉膏蛋白胨培養基中，30 ℃、180 r·min-1培養24 h制成種子液。將各種子液以2%接種量分別接種到含豬毛的降解培養基中，30 ℃、180 r·min-1培養，觀察豬毛的降解狀況。培養5 d后，將培養液利用濾紙過濾，收集殘渣至干燥箱內烘干至恒質量，稱量，計算菌株對豬毛的降解率。

豬毛降解率=(豬毛干質量-殘留豬毛干質量)/豬毛干質量×100%。

1.2.3 菌株角蛋白酶活性的測定

將初篩獲得的5株菌株接種到牛肉膏蛋白胨培養基中制成種子液，將各種子液以2%接種量分別接種到含豬毛的降解培養基中，30 ℃、180 r·min-1培養5 d后測定培養液中角蛋白酶活性。角蛋白酶活性的測定參照王繼勇等[14]方法進行。

1.2.4 高效豬毛角蛋白降解菌E-2的菌種鑒定

從形態學、生理生化特征和ITS序列方面對篩選的豬毛角蛋白降解率最高的菌株E-2進行菌種鑒定。菌株生理生化特征的檢測參照《微生物學實驗教程》(第2版)中相關方法進行[15]。

采用生工生物工程(上海)股份有限公司生產的酵母菌基因組DNA快速抽提試劑盒提取菌株E-2基因組DNA，用真菌通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)進行ITS序列擴增。PCR反應體系：10×PCR Buffer 5.0 μL，dNTP(25 mmol·L-1)4.0 μL，引物(10 μmol·L-1)各2.0 μL，Taq酶(5 U·μL-1)0.5 μL，DNA模板2 μL，補ddH2O至50 μL。PCR反應條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，51 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，30個循環；72 ℃ 10 min，4 ℃終止反應。將PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，利用膠回收試劑盒純化，交由生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

測得的序列通過NCBI比對分析，利用Mega 5.0軟件中N-J法構建ITS序列系統發育樹，用bootstrap進行檢驗，重復1 000次，確定該菌的分類地位。

1.2.5 菌株E-2產角蛋白酶曲線

接種菌株E-2到PDA培養基中，30 ℃、180 r·min-1培養24 h制成種子液。將種子液以2%接種量接種到含豬毛粉的降解培養基中，30 ℃、180 r·min-1培養，分別在12、24、36、48、60、72、84、96、108、120、132、144 h測定發酵液中活菌數和上清液的角蛋白酶活性。

1.2.6 環境因素對E-2產角蛋白酶的影響

以降解培養基為基礎培養基，豬毛粉含量10 g·L-1，pH 7.0，溫度30 ℃，轉速180 r·min-1，接種量2%，培養時間108 h為初始培養條件，研究不同環境因素對E-2角蛋白酶活性的影響。條件如下：(1)培養基初始pH為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0；(2)溫度為25、30、35、40、45、50 ℃；(3)培養基中豬毛粉添加量為5、10、15、20、25、30 g·L-1；(4)培養基中分別添加豬毛粉、雞毛粉、羊毛粉，添加量均為10 g·L-1。

1.3 數據分析

試驗數據利用軟件SPSS 18.0和Microsoft Excel 2003進行統計分析和作圖。試驗結果以平均值±標準差表示，數據間差異顯著性比較采用One-way ANOVA方法進行分析。

2 結果與分析

2.1 菌株分離篩選

經過馴化后，共分離獲得5株在以豬毛粉為唯一碳氮源的篩選培養基上生長良好的菌株，分別編號為E-1、E-2、E-3、E-4、E-5。將5株菌株接種至牛肉膏蛋白胨平板培養，通過菌落形態及顯微形態觀察，初步判定菌株E-2為酵母菌，其他菌株為細菌。將初篩獲得的5株菌株接種到含豬毛的降解培養基中培養5 d后，各菌株對豬毛均有不同程度的降解，其中，接種E-2的錐形瓶中豬毛大部分已降解，培養液變渾濁，而未接菌的對照組豬毛基本沒有變化(圖1)。5株初篩獲得的豬毛角蛋白降解菌的豬毛降解率及發酵上清液中的角蛋白酶活性見表1。結果顯示，培養5 d后，菌株E-2發酵上清液角蛋白酶活為46.6 U·mL-1，對培養基中豬毛的降解率可達58.6%，顯著高于其他4株菌株(P<0.05)。因此，選取菌株E-2作進一步的研究。

A， 對照Control； B， E-2圖1 菌株E-2發酵5 d降解豬毛的效果Fig.1 The pig hair degradation effect by E-2 after 5 days fermentation

表1 不同菌株分解豬毛角蛋白的能力

Table 1 The degradation ability of different strains to pig hair keratin (n=3)

菌株Strains豬毛降解率Degradingrate/%角蛋白酶活性Keratinaseactivity/(U·mL-1)E-132.9±3.0b27.3±3.2bE-258.6±3.7a46.6±2.4aE-321.3±2.0c25.5±3.6bE-424.3±0.9c15.7±2.2cE-517.5±1.8c12.8±1.1c

同列數據后無相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。表2同。

Data marked without the same lowercase letter in each column indicated significant differences atP<0.05. The same as table 2.

2.2 E-2菌種鑒定

2.2.1 菌株形態及生理生化特征

將菌株E-2接種在PDA平板上，30 ℃培養72 h后，可以觀察到菌落呈乳白色，圓形，表面光滑，邊緣整齊。在顯微鏡下，大部分細胞呈橢圓形(圖2)。生化實驗結果表明，菌株E-2的葡萄糖發酵、蔗糖發酵、麥芽糖發酵、木糖發酵、石蕊牛奶實驗均為陽性，明膠液化、尿素分解、1%醋酸生長實驗均為陰性。

2.2.2 PCR擴增結果

以E-2基因組DNA為模板，引物ITS1、ITS4擴增產物的測序結果顯示，E-2 ITS序列長度為693 bp。在NCBI中進行Blast分析，結果表明，菌株E-2與解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)的同源性最高，達98%。根據同源性比對結果，利用Mega 5.0軟件構建ITS序列系統發育樹，如圖3所示。結合形態學觀察、生理生化特征和ITS序列分析的結果，初步將菌株E-2鑒定為解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)。

圖2 菌株E-2的細胞形態Fig.2 Cellular morphology of strain E-2 cells

2.3 高效降解菌E-2產角蛋白酶曲線

圖4顯示，菌株E-2在以豬毛粉為唯一碳氮源的培養基中生長速度較慢，在60～96 h處于對數生長期，96～108 h處于穩定期，108 h后開始進入衰亡期。菌株產酶曲線表明，在0～60 h產角蛋白酶較少，進入對數期后酶活性逐漸增大，108 h時達到酶活性最大，菌株進入衰亡期后，角蛋白酶活性趨于降低，但幅度較小。

2.4 環境因素對E-2產角蛋白酶的影響

2.4.1 初始pH及培養溫度對菌株E-2產角蛋白酶的影響

溫度和pH均是影響微生物生長繁殖和代謝的重要因素，因此，本研究考察了不同培養溫度和初始pH對菌株E-2產角蛋白酶的影響。結果顯示，培養溫度為25～35 ℃時，隨著溫度的升高，發酵液中角蛋白酶活性逐漸增大；溫度為35～40 ℃時，酶活性達到最大值；隨著溫度的繼續升高，菌株E-2的角蛋白酶活性顯著降低(P<0.05)(圖5)。培養基的初始pH也對E-2產角蛋白酶影響較大，如圖6所示，當初始pH值為5.0時，角蛋白酶活性較低；pH值為6.0～7.0時，酶活性達到最大；進一步增大pH值，角蛋白酶活性趨于下降。

圖3 基于菌株E-2 ITS序列的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on ITS sequences of strain E-2

圖4 菌株E-2角蛋白酶活性-時間曲線圖Fig.4 Keratinase activity-time curve of strain E-2

圖5 溫度對菌株E-2角蛋白酶活性的影響Fig.5 Effect of temperature on the keratinase activity of strain E-2

圖6 培養基初始pH對菌株E-2角蛋白酶活性的影響Fig.6 Effect of initial pH on the keratinase activity of strain E-2

2.4.2 培養基中豬毛粉添加量對E-2產角蛋白酶的影響

大多數角蛋白酶為誘導型酶，需要外在的角蛋白類物質作為誘導物，例如毛發、角蛋白粉等[16]。因此，本研究考察了不同豬毛粉添加量對菌株E-2產角蛋白酶的影響。結果表明：隨著豬毛粉含量的增加，角蛋白酶活性逐漸增大；當豬毛粉含量達到15 g·L-1時，酶活性達到最大值(59.9 U·mL-1)；繼續增加豬毛粉含量，酶活性無顯著變化(圖7)。2.4.3 菌株E-2降解不同角蛋白底物能力的比較蛋白底物的誘導下均能產生角蛋白酶，從而降解不同的毛發角蛋白。其中，菌株E-2在等量雞毛誘導下，發酵液中角蛋白酶活性最高，對雞毛的降解程度也最高(P<0.05)。

表2結果表明，菌株在豬毛、雞毛、羊毛等角

圖7 豬毛粉添加量對菌株E-2角蛋白酶活性的影響Fig.7 Effect of pig hair concentration on the keratinase activity of strain E-2

表2 E-2對不同角蛋白底物的降解能力

Table 2 Degradation ability of strain E-2 to different keratins

底物Substrate降解率Degradingdate/%角蛋白酶活性Keratinaseactivity/(U·mL-1)豬毛Pighair53.3±4.2b48.6±2.9b雞毛Chickenfeather79.2±3.8a65.0±3.9a羊毛Wool50.8±6.2b45.3±3.0b

3 結論與討論

從長期堆放廢棄豬毛的土壤中取樣，通過馴化篩選到5株能夠降解豬毛角蛋白的菌株，其中菌株E-2的降解效果最佳。接種菌株E-2到以豬毛為唯一碳氮源的培養基中，培養5 d后，豬毛降解率達58.6%，發酵液中角蛋白酶活為46.6 U·mL-1。通過形態學觀察、生理生化特征及ITS序列分析，將該菌鑒定為解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)。菌株E-2在豬毛粉降解培養基中培養108 h后角蛋白酶活性最大，最佳產酶條件為：培養基初始pH值6.0～7.0，溫度35～40 ℃，豬毛粉添加量為15 g·L-1。以豬毛、雞毛、羊毛作為發酵底物時，均能誘導菌株E-2產生角蛋白酶，但以雞毛為底物的培養液中角蛋白酶活性顯著高于豬毛和羊毛。

豬毛、羽毛等畜禽毛發的主要成分是角蛋白，而角蛋白中含有高強度的二硫鍵[17]，不容易被降解。在畜禽死體堆肥中，豬毛等畜禽毛發得不到充分降解，不但浪費了大量的蛋白質資源，而且會污染環境。近年來，利用能夠分泌角蛋白酶的微生物降解動物毛發角蛋白作為一種經濟環保的方法引起了研究者們的關注。真菌是最早被報道能夠降解角蛋白的微生物，但多數為致病菌，影響了它們在實際中的應用[10]。本研究從長期堆放豬毛的土壤中分離篩選到的菌株E-2能夠高效降解豬毛角蛋白，在以往研究中，由于解脂耶氏酵母可利用烷烴類和疏水性物質，如油脂、聚甲基化和氯化的烷烴，且對不良環境抵抗力強、對環境安全，常被用于有機廢棄物的治理[18]，未見有將解脂耶氏酵母用于降解毛發角蛋白的報道。因此，本研究篩選到的菌株E-2豐富了降解毛發角蛋白的微生物資源庫，在廢棄角蛋白的開發利用方面具有潛在的應用前景。

黃林等[17]研究結果表明，弗氏鏈霉菌S-221菌株能夠降解羽毛角蛋白，將角蛋白降解率、角蛋白酶活性及菌體生長量之間進行直線回歸統計分析，發現羽毛角蛋白的降解依賴于菌株角蛋白酶活性的大小，而酶活性大小依賴于菌體生長量的大小。本研究中菌株E-2角蛋白酶活性-時間曲線結果表明(圖4)，發酵液酶活性的大小與菌體的生長量成正相關，與黃林等[17]研究結果相類似。

黃林等[17]在發酵培養基中分別添加豬毛、鴨毛和雞毛，發現菌株S-221均能產生角蛋白酶，但酶活性大小有顯著差異，其中，以雞毛為底物的培養基中酶活性最高。本研究中，菌株E-2在雞毛粉的誘導下，角蛋白酶活性最高，對雞毛的降解率顯著高于豬毛和羊毛。推測可能是由于不同毛發中角蛋白的結構不同，誘導產生的角蛋白酶在底物特異性、反應活性等方面有差異[19-20]，具體原因有待進一步研究。

培養基的初始pH、培養溫度、豬毛粉的添加量等環境因素均會影響菌株的角蛋白酶活性。因此，對于該菌株的最佳產酶發酵條件、酶學性質、降解角蛋白的機理等也有待進一步研究，以深入挖掘該菌在降解角蛋白方面的潛能。

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(責任編輯 侯春曉)

Isolation and identification of a pig hair keratin-degrading strain

LEI Ping， LIU Biao， YIN Hongmei

(HunanMicrobiologyInstitute，Changsha410009，China)

To screening the microorganisms with high pig-hair keratin-degrading capacity， the strains were isolated from environment soil collected from the pig hair waste site by adopting the culture medium taking keratin as sole carbon and nitrogen source and the optimal environmental factors for keratinase activity were investigated. In this study， five strains with pig hair degrading ability were obtained by the method of enrichment and domenstication， while the strain E-2 showed the highest capatity of degrading pig hair keratin. The degrading rate of pig hair keratin was up to 58.6% after 5 days fermentation and the keratinase activty reached 46.6 U·mL-1.The strain E-2 was identified asYarrowialipolyticabased on morphology， physiological characteristics and ITS sequence analysis. Experimental results of environmental factors showed that the optimum cultivation conditions for keratinase activity was pH 6.0-7.0，temperature 35-40 ℃，pig hair content 15 g·L-1and culture time 108 h. E-2 could degrade pig hairs， chicken feathers and wools， while the degrading activtiy and keratinase acticity varied with different keratin substrates. Up to date， little is known about the pig hair keratin degrading byYarrowialipolytica， thus， we provided a new efficient keratin-degarding strain to utilize pig hair.

pig hair keratin; keratin degrading strain;Yarrowialipolytica

http://www.zjnyxb.cn

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.04.19

2016-11-22

湖南省科技重點研發計劃(2016NK2208)；湖南省生豬產業技術體系生豬產業規模養殖與環境控制崗位項目

雷 平(1965—)，男，湖南常德人，碩士，助理研究員，從事農業微生物的基礎與應用研究。E-mail: 280795307@qq.com

S828；X713

A

1004-1524(2017)04-0644-07

浙江農業學報ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2017，29(4): 644-650

雷平， 劉標， 尹紅梅. 高效豬毛角蛋白降解菌株的分離與鑒定[J]. 浙江農業學報， 2017， 29(4): 644-650.