不同組織染色法在周圍神經虛擬三維重建中的應用評估

羅 鵬, 張 毅, 劉小林, 梁江山, 林 陽,周 斌, 劉 科, 馮 嘯, 戚 劍

(1. 廣東省深圳市第六人民醫院, 廣東 深圳, 518052;2. 中山大學附屬第一醫院, 整形修復外科, 廣東 廣州, 510080;3. 中山大學附屬第一醫院 顯微創傷手外科, 廣東 廣州, 510080;4. 廣東醫學院附屬深圳南山醫院 手足顯微外科, 廣東 深圳, 518052;5. 湖南中醫藥大學, 湖南 長沙, 410007;6. 北京大學第四臨床醫學院(北京積水潭醫院), 北京, 100035)

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不同組織染色法在周圍神經虛擬三維重建中的應用評估

羅 鵬1, 張 毅2, 劉小林3, 梁江山1, 林 陽1,周 斌4, 劉 科5, 馮 嘯6, 戚 劍5

(1. 廣東省深圳市第六人民醫院, 廣東 深圳, 518052;2. 中山大學附屬第一醫院, 整形修復外科, 廣東 廣州, 510080;3. 中山大學附屬第一醫院 顯微創傷手外科, 廣東 廣州, 510080;4. 廣東醫學院附屬深圳南山醫院 手足顯微外科, 廣東 深圳, 518052;5. 湖南中醫藥大學, 湖南 長沙, 410007;6. 北京大學第四臨床醫學院(北京積水潭醫院), 北京, 100035)

目的 評估各染色方法在周圍神經虛擬三維重建中應用可行性。方法 采集臨床脛神經標本，將處理好的標本切片分別用Karnovsky-Roots染色、乙酰膽堿酯酶染色、膽堿乙酰轉移酶染色和碳酸酐酶染色4種不同染色，拍照觀察，評估各染色方法。結果 Karnovsky-Roots和膽堿乙酰轉移酶染色部位與背景區域視覺差異明顯，而乙酰膽堿酯酶染色和碳酸酐酶染色部位與背景區域視覺差異不明顯。Karnovsky-Roots染色步驟最為簡單。結論 Karnovsky-Roots法較為適合應用于周圍神經虛擬重建。

三維重建; Karnovsky-Roots染色; 乙酰膽堿酯酶染色; 膽堿乙酰轉移酶染色; 碳酸酐酶染色

周圍神經虛擬三維重建可深入內部獲取周圍神經信息，對周圍神經損傷治療具有重要的指導意義[1-2]。三維重建的基本前提是得到結構顯示良好的連續二維切片圖像[3-4]。因此評估現有的神經組織切片染色方法，尋求合適的用于三維重建方法并獲取連續的高質量二維圖像是很有必要的[5]。乙酰膽堿是膽堿能神經的重要的神經遞質，在神經沖動傳導中發揮作用。乙酰膽堿酯酶是其水解酶，膽堿乙酰轉移酶是其合成酶。已知運動神經，全部副交感神經和小部分交感神經節后纖維屬于膽堿能神經，而感覺神經不是膽堿能神經，因此運動神經纖維和感覺神經纖維聚集區域這兩種酶分布也有明顯的差異[6]。基于此理論基礎，常用的神經組織染色法Karnovsky-Roots染色、乙酰膽堿酯酶染色、膽堿乙酰轉移酶染色和碳酸酐酶染色。Karnovsky-Root染色利用不同性質神經纖維中乙酰膽堿酯酶的含量和位置差異來判斷神經纖維的性質和分布特點[7]。自Karnovsky-Roots染色方法問世以來，國內外研究報道其染色結果圖像中不同性質神經纖維特征一致，至今仍是周圍神經研究的常用方法。乙酰膽堿酯酶和膽堿乙酰轉移酶染色利用抗原抗體反應，不僅能夠較為特異的顯示乙酰膽堿酯酶和膽堿乙酰轉移酶的分布特點，而且還能在不破壞所用標本切片完整前提下提供相應染色結果的二維圖像，是目前周圍神經相關研究中運動神經纖維的定性、定位常用的實驗方法[8-11]。碳酸酐酶染色結果顯示運動神經纖維和感覺神經纖維的染色結果有明顯的不同，但該物質在神經中的具體作用，還缺乏明確的理論基礎[12-13]。本研究比較分析Karnovsky-Roots染色、乙酰膽堿酯酶染色、膽堿乙酰轉移酶染色和碳酸酐酶染色4種常用的染色方法，現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1例新鮮自愿捐獻的因右股骨遠端骨肉瘤截肢的成年男性右下肢踝管部脛神經標本。

1.2 取材方法

脛神經標本于肢體完全離斷后2 h內獲得，具體操作步驟為：解剖右下肢踝管部取出長約1 cm的脛神經; 修剪神經外膜，去除周圍脂肪、肌肉等組織; 將分離的脛神經兩端用大頭針固定于軟木壓舌板上，維持其伸展狀態; 冷凍包埋劑(OCT)包埋, -80 ℃速凍; 組織標本包埋后，將兩端固定的大頭針去除，置于-24 ℃的恒溫冷凍切片機橫斷面連續切片，片厚6 μm; 將切片貼于防脫載玻片上，室溫下干燥，選取形態完好的切片40張，以備后續染色使用。

1.3 切片分組

將40張標本切片隨機分為A、B、C和D組，每組10張切片。A、B、C和D組切片分別采用Karnovsky-Roots染色、乙酰膽堿酯酶染色、膽堿乙酰轉移酶染色和碳酸酐酶染色4種不同的染色方法。

1.4 Karnovsky-Roots染色

硫代乙酰膽堿酯酶12.5 mg, 30 mM硫酸銅2.5 mL, 5 mM鐵氰化鉀2.5 mL, 0.1 M檸檬酸三鈉1 mL, 0.1 M磷酸緩沖液16 mL, 0.1 M磷酸氫二鈉9 mL, 0.1 M磷酸二氫鉀7 mL, 蒸餾水2 mL, 配制染色孵育液。染色步驟為：將標本切片置于孵育液中4℃孵育24 h, 清水洗去多余染液，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.5 乙酰膽堿酯酶染色

染色步驟為：將標本切片置于3%雙氧水中，靜置15 min; PBS緩沖液浸洗標本, 3 min/次; 10%山羊血清常溫封閉30 min; 1∶400配制兔抗人乙酰膽堿酯酶抗體工作液; 配制的工作液孵育切片, 4 ℃孵育36 h; PBS緩沖液浸洗標本, 3 min/次; 生物素標記的羊抗兔二抗室溫孵育1 h; PBS緩沖液浸洗標本, 3 min/次; 辣根過氧化物酶HRP標記的鏈酶親和素抗體室溫孵育30 min; PBS緩沖液浸洗標本, 3 min/次; 顯色工作液DAB顯色10～15 min, 清水洗去多余顯色液。

1.6 膽堿乙酰轉移酶染色

染色步驟為：將標本切片置于3%雙氧水中，靜置15 min; PBS緩沖液浸洗標本, 3 min/次; 10%山羊血清常溫封閉30 min; 1∶400配制兔抗人膽堿乙酰轉移酶抗體工作液; 配制的工作液孵育切片, 4 ℃孵育48 h; PBS緩沖液浸洗標本, 3 min/次; 生物素標記的羊抗兔二抗室溫孵育1 h; PBS緩沖液浸洗標本, 3 min/次; 辣根過氧化物酶HRP標記的鏈酶親和素抗體室溫孵育30 min; PBS緩沖液浸洗標本, 3 min/次; 顯色工作液DAB顯色10～15 min, 清水洗去多余顯色液。

1.7 碳酸酐酶染色

0.1 M硫酸鈷5 mL, 0.5 M 硫酸3 mL, 1/15 M磷酸二氫鉀0.5 mL, 蒸餾水充分溶解定容至8.5 mL, 配制染液A; 碳酸氫鈉380 mg, 蒸餾水充分溶解定容至20 mL, 配制染液B。使用前將染液A和染液B等比例混合震蕩4 min, 靜置4 min, 1 500 r/min離心4 min備用。

染色步驟為: 4%多聚甲醛固定標本切片, 30 min; 梯度蔗糖過夜; 用混合后的A、B液對切片常溫染色, 4～12 min。0.01 M磷酸氫二鈉溶液浸洗標本, 1～3 min/次; 2%～3%硫化銨溶液液顯色1～2 min; 清水洗去多余浮色后, 0.01 M醋酸溶液浸洗切片。

1.8 染色結果觀察和圖像獲取

使用正立顯微鏡(DM 2500B)觀察不同染色標本的染色結果，比較標本的紋理特征。每張切片隨機選取5個視野(×100)進行顯微攝像，圖像保存為TIFF格式。攝像參數設置: ISO值設定為200, 光圈設定為8, 焦距37.15 mm, 曝光補償為0, 圖像大小2591 ×1938像素，分辨率300 dpi。

2 結 果

2.1 Karnovsky-Roots染色結果

100倍光學顯微鏡下觀察Karnovsky-Roots染色結果并拍照，整體觀察呈棕黃色的著色部位與背景區域視覺差異明顯。其中呈棕黃色的部位顯示具有乙酰膽堿酯酶活性，分散的棕黃色色斑構成神經束區域，神經束膜、神經束間結締組織不著色。而不同性質的神經纖維所呈現的色斑特性有所差異。運動神經纖維色斑形狀為較規則的橢圓形，染色較淺，成群排列; 感覺神經纖維不著色; 交感神經纖維色斑形狀為不規則著色，分散在感覺神經纖維間，著色較深，成群排列。見圖1。

2.2 乙酰膽堿酯酶染色結果

100倍光學顯微鏡下觀察乙酰膽堿酯酶染色結果并拍照，整體觀察呈藍色的著色部位與背景區域視覺差異不明顯。其中具有乙酰膽堿酯酶活性的部位染色為藍色，神經束間結締組織無特異著色，神經束膜呈藍色。不同性質的神經纖維色斑聚集分布，髓鞘輪廓著色較淺，運動神經纖維軸索部位著色為藍色，感覺神經纖維軸索不著色，交感神經纖維色斑位于髓鞘外。見圖2。

黑色箭頭指示運動神經纖維色斑,白色箭頭指示交感神經纖維色斑圖1 Karnovsky-Roots染色結果圖像 100倍

黑色箭頭指示運動神經纖維色斑,白色箭頭指示交感神經纖維色斑圖2 乙酰膽堿酯酶免疫組化染色結果圖像 100倍

2.3 膽堿乙酰轉移酶染色結果

100倍光學顯微鏡下觀察膽堿乙酰轉移酶染色結果并拍照，整體觀察呈棕黃色的著色部位與背景區域視覺差異較明顯。其中呈棕黃色的部位顯示具有膽堿乙酰轉移酶活性。神經束膜、神經束間結締組織均呈棕黃色染色，神經束區域由分散的棕黃色色斑構成。運動神經纖維軸索部位呈棕黃色著色，感覺神經纖維軸索不著色，交感神經纖維色斑位于髓鞘外。見圖3。

2.4 碳酸酐酶染色

100倍光學顯微鏡下觀察膽堿乙酰轉移酶染色結果并拍照，整體觀察灰黑色著色部位與背景區域視覺差異不太明顯。其中呈灰黑色的部位顯示具有碳酸酐酶活性。神經束膜呈灰黑色著色，著色較淺，神經束間結締組織呈現不均勻的淺灰色。同時還可觀察到髓神經纖維髓鞘輪廓著色，而髓神經纖維軸索部分著色，部分觀察不到著色。見圖4。

黑色箭頭指示運動神經纖維色斑,白色箭頭指示交感神經纖維色斑圖3 堿乙酰轉移酶免疫組化染色圖像 100倍

黑色箭頭指示軸索著色的有髓神經纖維,白色箭頭指示軸索未著色的有髓神經纖維圖4 碳酸酐酶染色結果圖像 100倍

2.5 各組染色方法比較

分別從染色時間、染色步驟和顯色階段是否需人工監督3個方面對Karnovsky-Roots染色、乙酰膽堿酯酶染色、膽堿乙酰轉移酶染色和碳酸酐酶染色4種染色方法進行比較。各組染色方法比較結果見表1。

表1 各組染色方法比較

其中Karnovsky-Roots染色步驟最為簡單，并且顯色階段無需人工監督。染色時間為24～36 h; 膽堿乙酰轉移酶染色步驟繁瑣，染色時間最長，為50～52 h, 并且顯色階段需人工監督; 乙酰膽堿酯酶染色步驟雖然繁瑣，但染色時間較膽堿乙酰轉移酶染色方法短，為38～40 h, 同樣顯色階段也需人工監督; 碳酸酐酶染色染色步驟較簡單，并且染色時間最短, 2～3 h即可完成染色，顯色階段需人工監督。

3 討 論

周圍神經虛擬三維重建是將組織學與解剖學結合起來的有效途徑[1-2, 14]。周圍神經虛擬三維重建的目的是再現神經內部空間結構。高質量的二維圖像是三維重建的重要基礎。周圍神經虛擬三維重建，需要二維圖像中明確顯示神經束和神經纖維的分布，因此，所需要的圖像需具有較強的紋理特征[15-17]。本研究提示，Karnovsky-Roots染色區域和背景區域區分明顯，但是圖像中各性質的神經纖維紋理特征差異不明顯。而乙酰膽堿酯酶染色和碳酸酐酶染色部位與背景區域視覺差異不明顯。Karnovsky-Roots染色結果中，只有乙酰膽堿酯酶分布區域著色，神經束膜、神經束間結締組織不著色，因此乙酰膽堿酯酶著色部位形成的棕黃色色斑與背景間的視覺差異明顯[18-20]。色斑主要分布在運動神經纖維和交感神經纖維軸索位置，兩種神經纖維的特征色斑有較明顯的視覺差異，與國內外研究中人體標本的染色結果是一致的。乙酰膽堿酯酶染色和膽堿乙酰轉移酶染色過程中會有明顯的有非特異染色。乙酰膽堿酯酶染色的非特異染色主要顯示為同陽性部位顏色接近的色斑，有許多色斑與陽性部位形狀接近，肉眼不易區分，會影響準確分析神經束功能性質; 膽堿乙酰轉移酶染色中，不僅有非特異著色色斑，神經束膜同神經束間結締組織著色接近，不易從圖像中準確辨識神經束區域和不同性質神經纖維分布特點[21-23]。碳酸酐酶染色結果圖像中，有髓神經纖維的髓鞘普遍著色，呈淺灰色，碳酸酐酶陽性部位位于部分有髓神經纖維軸索位置，神經束膜著淺灰色，與髓鞘顏色接近，神經束間結締組織基本不著色。各部分組織結構的視覺差異小。研究[24-25]證明，不論是使用動物標本，還是使用人周圍神經標本，在碳酸酐酶染色結果中，并不是所有的感覺神經軸索著色，也有部分運動神經纖維軸索著色，而且著色的神經纖維無明確可供區分的特征，難以準確區分。

在4組染色的過程中, Karnovsky-Roots染色步驟最簡便，只要將孵育液按比例配置，放置于4 ℃環境中，將標本完全浸入孵育液24 h, 就可以得到比較滿意的結果。由于過程中不需要標本反復出入染液，因此很少出現標本的破損和脫落，且適合大量切片同時染色，有利于保持圖像中紋理、顏色等一致。

乙酰膽堿酯酶和膽堿乙酰轉移酶的免疫組化染色以及碳酸酐酶染色步驟較為繁瑣，染色過程中必需由操作者嚴密觀察顯色步驟，避免背景顏色過深，影響對識別圖像中的感興趣區域。為了減少染色過程中出現的非特異著色干擾對染色結果的判斷，需要適度洗滌染色后的切片，洗滌過程也許操作者嚴密觀察洗滌效果，避免過度洗滌造成切片組織破損和著色的陽性部位脫色。

綜上所述，通過比較可以看出, Karnovsky-Roots染色鑒別神經纖維功能性質的理論依據最為充分，圖像紋理特征最易辨識，而且操作過程最為簡單，適合大量切片同時染色，但實踐顯示，該染色后圖像不能使用現有圖像分析軟件進行圖像分割，也不適合開發相應圖像分析軟件，因此還需要改良染色結果，使之適合用于周圍神經虛擬三維重建。

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Evaluation of different histochemical staining in three-dimensional reconstruction of peripheral nerves

LUO Peng1, ZHANG Yi2, LIU Xiaolin3, LIANG Jiangshan1, LIN Yang1, ZHOU Bin4, LIU Ke5, FENG Xiao6, QI Jian5

(1.TheSixthPeople′sHospitalofShenzhen,Shenzhen,Guangdong, 518052; 2.DepartmentofPlasticandReconstructiveSurgery,TheFirstHospitalAffiliatedtoZhongshanUniversity,Guangzhou,Guangdong, 510080; 3.DepartmentofMicrosurgicalHandSurgery,TheFirstHospitalAffiliatedtoZhongshanUniversity,Guangzhou,Guangdong, 510080; 4.DepartmentofHandandFootSurgery,ShenzhenNanshanHospitalAffiliatedtoGuangdongMedicalCollege,Shenzhen,Guangdong, 518052; 5.HunanUniversityofChineseMedicine,Changsha,Hunan, 410007; 6.TheFourthClinicalMedicalCollegeofPekingUniversity,BeijingJishuitanHospital,Beijing, 100035)

Objective To explore the feasibility of different histochemical staining in three-dimensional reconstruction of peripheral nerves. Methods The samples were collected from fresh adult common tibial nerve, which were serially horizontally sliced with the thickness of 6 (m. All slices were randomly divided into four groups with different staining such as Karnovsky-Roots staining, acetylcholinesterase staining, acetyltransferase staining or carbonic anhydrase staining. The stain characteristics in various stain phrases were observed under optic-microscope.Results The character of nerve fibers could be distinguished clearly by Karnovsky-Roots, acetylcholinesterase, acetyltransferase and acetyltransferase staining. It took 50 to 52 hours to finish the staining by using Karnovsky-Roots staining. Carbonic anhydrase staining was the simplest method. Conclusion Among the four staining methods, Karnovsky-Roots staining is suitable for three-dimensional reconstruction of peripheralnerves.

peripheral nerves; three-dimensional reconstruction; Karnovsky-Roots staining; acetylcholinesterase staining; acetyltransferase staining; carbonic anhydrase staining

2017-02-05

廣州省深圳市南山區科技計劃項目(2014028)

戚劍

R 651.3

A

1672-2353(2017)07-059-05

10.7619/jcmp.201707016