纖維素降解菌的篩選、鑒定和糖化水平研究

鄭 麗，張海鵬，宋艷培，劉孟浩，何時雨，馬旭東，覃新導(dǎo)，李伯松

（1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院廣州實驗站，廣東 廣州 510140；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣東 廣州 510642；3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)材料與能源學(xué)院，廣東 廣州 510642；4.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院，海南 海口 571101）

纖維素降解菌的篩選、鑒定和糖化水平研究

鄭 麗1，2，張海鵬2，宋艷培3，劉孟浩3，何時雨1，馬旭東1，覃新導(dǎo)4，李伯松1

（1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院廣州實驗站，廣東 廣州 510140；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣東 廣州 510642；3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)材料與能源學(xué)院，廣東 廣州 510642；4.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院，海南 海口 571101）

將前期從木薯生境中分離、保存的298個菌株，通過平板測試，篩選到57個可產(chǎn)纖維素酶活的菌株，其中酶活性效果最好的菌株（水解圈最大，將其賦值得分為3）所占比例為40.9%，酶活性依次減弱的菌株所占比例（賦值得分為2和1）分別占27.9%和24.6%。采用DNS法測定57個菌株的糖化水平和酶活力，結(jié)果顯示，10株細菌具有較好潛力降解纖維素，其中菌株HWY-3-9的糖化和酶活力最好，產(chǎn)糖量為0.1852 mg/mL，酶活力為0.0012 U/mL，經(jīng)鑒定為解淀粉芽孢桿菌。

細菌；纖維素酶；糖化水平

隨著化石能源的不斷開發(fā)利用，人類正面臨著能源枯竭的危機。纖維素作為一種生物質(zhì)能源倍受矚目，它在自然界中分布廣泛，主要存在于可再生的木質(zhì)纖維素材料中［1］。隨著我國農(nóng)業(yè)及農(nóng)產(chǎn)品加工產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，農(nóng)業(yè)廢棄物不斷增加，給環(huán)境帶來沉重負擔(dān)［2-3］。其中秸稈廢棄物的主要組成為半纖維素和木質(zhì)素，它們交織在一起形成難降解的復(fù)合物［4］。因此，篩選能降解纖維素的菌株成為近年的研究熱點。國內(nèi)外對纖維素降解菌的研究有相關(guān)報道，如馮玉杰等［5］篩選出具有較好降解纖維素活性的菌株，根據(jù)菌株本身產(chǎn)酶特點進行復(fù)配，實現(xiàn)纖維素的快速水解，利用纖維素降解菌株群和酵母菌進行聯(lián)合作用，最終實現(xiàn)纖維素類物質(zhì)較高水平的利用；羅萍等［6］從自然發(fā)酵的菠蘿渣中分離得到了降解菠蘿纖維素菌株；林捷等［7］從自然界中篩選出了6株纖維素分解菌并進行復(fù)配，大幅提高纖維素酶活力以及對還原糖的耐受力；李嘉薇等［8］對纖維素酶水解糖化木薯秸稈工藝條件進行優(yōu)化，結(jié)果表明，在溫度為45℃，反應(yīng)體系pH為4.5，酶用量為2 g/L，反應(yīng)時間為42 h，還原糖得率最大；盧月霞等［9］將細菌和放線菌經(jīng)過混菌培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，組合菌株的酶活相當(dāng)于其各自單獨培養(yǎng)時的兩倍；王麗等［10］、張曉倫等［11］也發(fā)現(xiàn)類似的結(jié)果。二戰(zhàn)期間分離得到的纖維素降解菌“瑞氏木霉”，其強大的纖維素分泌能力得到驗證并已被廣泛應(yīng)用于纖維素酶生產(chǎn)及合成的研究［12］。據(jù)報道，好氧細菌以胞外酶形式分泌3種纖維素酶水解纖維素，厭氧細菌則可將3種纖維素酶組裝成纖維小體［13］；Faterstam等［14］也發(fā)現(xiàn)兩種外切酶（CBHⅠ、CBHⅡ）聯(lián)合降解結(jié)晶纖維素的毒素和程度是單組分酶的兩倍。

本研究通過纖維素降解菌的篩選得到1株具有較好纖維素酶活性菌株，并對該菌株進行纖維素酶活力和糖化水平測定，纖維素降解菌有利于減少各種農(nóng)業(yè)纖維化廢棄物對環(huán)境帶來的影響，還可以變廢為寶，為燃料乙醇的原料提供來源，為可持續(xù)發(fā)展帶來較好的經(jīng)濟和社會效益。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗菌株由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院廣州實驗站植保實驗室保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株纖維素酶活性的篩選 將前期分離得到的298個菌株，參照文獻 ［15］的方法進行纖維素酶活性測定。把準(zhǔn)備好的菌株接到纖維素酶活性測定平板（蛋白胨 10 g，酵母粉 10 g，羧甲基纖維素鈉 10 g，氯化鈉 5 g，磷酸二氫鉀 1 g，瓊脂 18 g，定容至 1 000 mL，pH=7.0），30℃培養(yǎng) 48 h，用 1 g/L剛果紅染 1 h ，倒掉染液后用1 mol/L NaCl 浸泡 1 h。檢測透明圈的有無并測量其內(nèi)徑和外徑。

1.2.2 糖化水平測定 還原糖（葡萄糖）測定采用DNS顯色法［16］，將培養(yǎng)好的細菌接種到纖維素富集的液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h后進行離心，獲得粗酶液，50℃水浴30 min后，立即加入DNS試劑測定還原糖的含量。

1.2.3 酶活力測定 將1.2.2糖化水平測得的葡糖糖含量進行酶活力測定，在50℃、pH為4.8的條件下，1 min內(nèi)可以將底物轉(zhuǎn)化成1 μmol葡萄糖所需要的酶量定義為一個酶活力單位（U/mL）［16］。

1.2.4 賦值評估 根據(jù)抑菌圈（抑菌圈外徑與內(nèi)徑之差）的大小，將產(chǎn)纖維素酶活性的菌株賦值得分：0分，無水解圈；1分，0 mm ＜水解圈 ≤ 3.0 mm；2分，3.0 mm ＜ 水解圈≤ 6 mm；3分，水解圈＞ 6 mm。

1.2.5 菌株鑒定 采用試劑盒（賽百盛公司）提取細菌基因組后，參照文獻［17］的方法從基因組中擴增出16S rRNA基因片段的PCR擴增。所得產(chǎn)物在華大基因測序分析，并將相關(guān)序列在NCBI上進行比對。

2 結(jié)果與分析

2.1 細菌產(chǎn)纖維素酶活性

從298株細菌中，篩選到57株產(chǎn)纖維素酶的菌株。按以上賦值方法，結(jié)果（表1，圖1）賦值得分為3的菌株占比為40.9%；賦值得分為2和1的菌株，分別占供試菌株總數(shù)的27.9%和24.6%。說明不同菌株之間的纖維素酶活性存在差異。

圖1 不同細菌水解纖維素酶活性

2.2 糖化水平與酶活力測定

對獲得的57個菌株分別測定其糖水平，發(fā)現(xiàn)大部分菌株產(chǎn)糖水平較低，挑選其中10株具有較好糖化潛力的細菌進行復(fù)篩選（葡萄糖測定標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為Y=1.523X-0.0526，R2=0.9902），結(jié)果（圖2）顯示，HWY-3-9菌株產(chǎn)糖量為0.1852 mg/mL；DHNY-3-4 和DDNR-3-3的產(chǎn)糖量分別為0.1644 mg/mL和0.1532 mg/mL，且二者差異不顯著；產(chǎn)糖量最低的菌株為DDWR-4-4，僅0.0643 mg/mL。同時，對這10株細菌進行酶活力測定，結(jié)果（圖3）表明，10株細菌的酶活力存在差異，其中HWY-3-9菌株的酶活力最高，達0.0012 U/mL；其次是DHNY-3-4菌株，達0.0011 U/mL；酶活力最低的菌株為DHS-4-1，僅0.0004 U/mL。

圖2 10個菌株糖化水平測定結(jié)果

圖3 菌株酶活力測定結(jié)果

2.3 菌株鑒定

對4個產(chǎn)糖能力和酶活力水平存在差異的菌株進行測序分析，結(jié)果見表2、圖4～圖7，產(chǎn)糖水平和酶活力最高的菌株HWY-3-9為解淀粉芽孢桿菌；僅次于HWY-3-9的菌株為DHWS-3-6，經(jīng)過鑒定該菌株為成團泛菌；產(chǎn)糖水平和酶活力最低的菌株為DHS-4-1，鑒定為短小芽孢桿菌。

表2 菌株鑒定結(jié)果

圖4 菌株HNR-3-7的系統(tǒng)進化樹

圖5 菌株HWY-3-9的系統(tǒng)進化樹

圖6 菌株DHWS-3-6的系統(tǒng)進化樹

圖7 菌株DHS-4-1的系統(tǒng)進化樹

3 結(jié)論與討論

本研究的298個菌株分離自木薯不同生境，前期經(jīng)過聚類分析，發(fā)現(xiàn)豐度較好。通過分析細菌的纖維素降解酶活性，并測定酶活性較好菌株的糖化水平，找到1株綜合效率最好的解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。

纖維素酶主要由外切葡聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶組成，3種酶之間相互協(xié)調(diào)作用將復(fù)雜的纖維素多糖降解為易于利用的單糖［15］。β-葡萄糖苷酶是纖維素酶體系產(chǎn)葡萄糖的重要組成部分，調(diào)節(jié)另外兩部分的功能，其活性影響了纖維素酶的總活性，從而影響葡萄糖的產(chǎn)量［16］。本研究通過CMC法測定菌株的纖維素酶活性，DNS法測定高酶活性菌株的產(chǎn)葡萄糖能力，發(fā)現(xiàn)不同菌株的糖化水平和酶活力存在差異，原因可能有兩個：一是和菌株本身特性有關(guān)，不同種屬菌株的纖維素酶種類和活力存在差異會影響其酶活力和糖化能力。金迪等［17］分離得到的1株降解纖維素菌株，在28℃、pH為7.0～7.5和32 h條件下，其羧甲基纖維素酶（CMCase）活力為 651.75 U/mL；葛春輝［18］篩選出一株纖維素降解菌，其酶活力為0.581 U/mL；陳麗燕等［19］篩選出兩株纖維素降解菌，經(jīng)鑒定該菌株為地衣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌，液體搖瓶培養(yǎng)4 d，其CMC酶活力分別可達 163.3、167.17 U/mL，而本研究解淀粉芽孢桿菌的酶活力為0.0012 U/mL。楊培周等［20］對康寧木霉、綠色木霉、黑曲霉和里氏木霉表達纖維素酶的酶學(xué)特性初步研究結(jié)果表明，不同屬菌株的產(chǎn)酶活性存在差異，其中黑曲霉產(chǎn)酶活性最好，是發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的理想菌株；徐杰［21］對水稻主產(chǎn)區(qū)的土壤進行分離得到10株細菌，發(fā)現(xiàn)在相同條件下，10株細菌對纖維素分解能力表現(xiàn)不一，這與本研究結(jié)果一致。另一個原因可能是菌株發(fā)酵通氣量、發(fā)酵液濃度、碳氮源以及平板測定抑菌圈所用培養(yǎng)基類型等影響菌株產(chǎn)酶能力和活性。林捷等［7］利用木薯渣進行纖維素分解菌混合發(fā)酵工藝研究表明，菌株發(fā)酵通氣量、發(fā)酵液濃度等對菌株產(chǎn)酶能力有很大影響；羅萍等［6］發(fā)現(xiàn)功能菌株在6種不同培養(yǎng)基平板上的 FPA 酶活性表現(xiàn)不一，并最終選出最適合該菌的培養(yǎng)基為蛋白胨纖維素培養(yǎng)基；發(fā)酵液中微生物產(chǎn)酶和還原糖也具有反饋作用，Guo等［22］對產(chǎn)黃纖維單胞菌的葡萄糖耐受力進行試驗，結(jié)果表明，葡萄糖含量高于5.0 μg/mL時，該菌的纖維酶活力急劇下降；Wang等［23］報道，黑曲霉在還原糖濃度為1.5 μg/mL時產(chǎn)酶受阻。

纖維素降解酶活性高低決定了降解纖維素能力的大小。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)、基因工程及蛋白質(zhì)工程等的發(fā)展，提供了改變纖維素酶分子催化活性、最適溫度和pH等生物特性的方法，為獲得高效轉(zhuǎn)化纖維素提供了可能［24］。Qu Y B［25］對一株嗜酸耐熱纖維素降解菌進行了定點突變，將其降解活性提高了20%；Heinzelman等［26-27］以3種真菌運用SCHEMA 重組方法得到了最高的熱穩(wěn)定性約比熱穩(wěn)定性最強的親本提高7℃；Lin等［28］通過定點突變，實現(xiàn)了β-葡聚糖酶催化活性分別比野生型提高50%和80%；吳華偉等［29］通過易錯PCR技術(shù)，將纖維素酶活提高到59.6、90.8、105.1 U/m L，分別是原始菌株的2.1倍、3.2倍和3.7倍；李永仙等［30］構(gòu)建重組質(zhì)粒，將編碼β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因置于T7啟動子和lac啟動子雙重啟動子的調(diào)控下表達，其催化活性達到1 883.3 U/mL，遠遠超過原始菌株。因此本研究獲得的降解菌株有可能通過這些技術(shù)方法提高其酶活力，從而提高產(chǎn)糖水平。

本研究篩選到的糖化水平最高的菌株，經(jīng)鑒定為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens），關(guān)于該菌株具有纖維分解作用的文獻也有報道。Leelasuphakul等［31］對從芽孢桿菌中提取得到的β-葡聚糖酶進行了產(chǎn)酶條件、酶學(xué)活性、基因克隆等方面的研究；陳麗燕等［19］報道了兩株具有很好纖維素分解作用的菌株均為芽孢桿菌；劉海艷等［32］通過篩選得到一株高效纖維素降解菌短小芽孢桿菌，并針對該菌進行了基因克隆；李紅亞等［33］利用解淀粉芽孢桿菌對玉米秸稈進行降解，發(fā)現(xiàn)該菌的酶活力可達45.4 U/g；羅偉光［34］從土壤中分離得到降解纖維素的枯草芽孢桿菌，劉永生等［35］從舊稻草堆中分離得到了1株具有纖維素降解能力的地衣芽孢桿菌，并針對該菌的一個纖維素基因進行了克隆和測序分析。本研究分離出的解淀粉芽孢桿菌也是芽孢桿菌家族的一員，因此很有可能可以通過分子手段來提高該菌降解纖維素提高糖化水平的能力。

為了得到更好的纖維素降解菌株，有效利用秸稈等農(nóng)業(yè)廢棄物，變廢為寶，在接下來的工作中，可以利用分子生物學(xué)方法對本研究得到的菌株朝著高效利用纖維素的方向進行改造，從而獲得高效分解纖維素的工程菌株。

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（責(zé)任編輯 鄒移光）

Isolation，identification and saccharification level of cellulose degrading bacteria

ZHENG Li1，2，ZHANG Hai-peng2，SONG Yan-pei3，LIU Meng-hao3，HE Shi-yu1，MA Xu-dong1，QIN Xin-dao4，LI Bo-song1
（1. Guangzhou Experimental Station，Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences，Guangzhou 510140，China；2. College of Agriculture，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China；3. College of Materials and Energy，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China；4. Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences，Haikou 571101，China）

In this study，298 bacteria were isolated from cassava microenvironments and 57 strains with cellulase activity were gained by in vitro detection test. Results showed that strains with big hydrolysis circle (the score of 3) accounted for 40.9% and strains with weakly hydrolysis circle（the score of 2 and 1） accounted for 27.9% and 24.6%，respectively. The saccharification level and enzyme activity were tested by DNS method，and we found 10 potential strains with efficient ability of degradation of cellulose，in which strain HWY-3-9 had the best saccharification and enzyme activity， the sugar content was 0.1852 mg/mL and enzyme activity was 0.0012 U/mL，and it was identified as Bacillus amyloliquefaciens.

bacteria; cellulase; saccharification level.

S182

A

1004-874X（2017）02-0104-08

2016-11-14

中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院院本級基本科研業(yè)務(wù)費專項資金（1630052015047）；海南省自然科學(xué)基金（314185）；廣東省科技計劃項目（2015A020209027）

鄭麗（1984-），女，在職博士生，助理研究員，E-mail：catas_lzheng@163.com

李伯松（1982-），男，博士，助理研究員，E-mail：84490477@qq.com

鄭麗，張海鵬，宋艷培，等.纖維素降解菌的篩選、鑒定和糖化水平研究［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，44（2）：104-111.