汽蒸前后六堡茶中優勢微生物的分離鑒定

歐惠算，鄧旭銘，張靈枝，張均偉，馬士成，邱瑞瑾

（1.華南農業大學園藝學院，廣東 廣州 510642；2.梧州中茶茶業有限公司，廣西 梧州 543001；3.梧州市農業科學研究所，廣西 梧州 543000；4.梧州市六堡茶研究院，廣西 梧州 543000）

汽蒸前后六堡茶中優勢微生物的分離鑒定

歐惠算1，鄧旭銘1，張靈枝1，張均偉2，馬士成3，4，邱瑞瑾3，4

（1.華南農業大學園藝學院，廣東 廣州 510642；2.梧州中茶茶業有限公司，廣西 梧州 543001；3.梧州市農業科學研究所，廣西 梧州 543000；4.梧州市六堡茶研究院，廣西 梧州 543000）

選取汽蒸前、后六堡茶茶樣，分離純化得到7株優勢菌，采用傳統方法觀察菌落特征、利用光學顯微鏡觀察菌株的形態，結合分子生物學水平對菌株進行DNA序列分析，通過ITS序列進行同源性搜索比對、對系統發育樹分析。結果共鑒定出六堡茶汽蒸前的優勢菌為塔賓曲霉、黑曲霉、膠紅酵母、LB3青霉、灰黃青霉、鞘氨醇單胞菌以及阿姆斯特丹散囊菌。而在汽蒸后的六堡茶里沒有塔賓曲霉以及黑曲霉，說明其在高溫汽蒸時已被殺死，而其余5種微生物因耐高溫而保留下，對六堡茶的陳化起到重要作用。

六堡茶；優勢微生物；分離；鑒定

六堡茶，因原產于廣西省梧州市蒼梧縣六堡鄉而得名，屬于黑茶類。我國著名的茶學教授莊晚芳先生根據南北朝時期的《桐君錄》考證：六堡茶的歷史可以追溯到1 500多年前。《蒼梧縣志》記載：“茶產多賢鄉六堡，味醇隔宿而不變，茶色香味俱佳”［1］。六堡茶與其他黑茶相比，其加工過程中的特殊之處為兩次“渥堆”和兩次高溫汽蒸，其傳統加工工藝分為兩步：六堡初制加工與六堡茶精制加工，即毛茶和成品茶加工，精制加工流程為：六堡毛茶—加水—翻拌—高溫汽蒸—渥堆—高溫汽蒸—裝簍—陳化—六堡茶［2］。該獨特的工藝使得六堡茶具有獨特的檳榔香味和“紅、濃、陳、醇”的品質特征。在渥堆過程中，有大量微生物生成，溫志杰等［3］分析了六堡茶渥堆發酵中微生物的變化，檢測到其中存在數量巨大的細菌、酵母、霉菌。廖慶梅［4］發現六堡茶后期陳化的六堡茶有許多金黃色的“金花”，是有益品質的黃霉菌，它能分泌淀粉酶和氧化酶，可催化茶葉中的淀粉轉化為單糖。徐書澤［5］通過傳統形態學鑒定結合真菌分子鑒定技術從中分離鑒定得到黑曲霉、煙曲霉、桔青霉、西弗射盾子囊霉等5屬18種的微生物。汽蒸，是六堡茶加工的關鍵工藝，汽蒸前后的微生物類群，決定了六堡茶后期陳化的品質，渥堆后的六堡茶，通過高溫汽蒸，將不耐高溫的微生物殺死，提高茶葉的安全性。本試驗以第2次汽蒸前后的六堡茶為樣品，分離純化其中的優勢菌，用光學顯微鏡觀察菌落形態，再結合現代分子生物學進行DNA測序，在分子水平上對六堡茶汽蒸前后的優勢菌進行鑒定，為提高六堡茶的渥堆技術及安全性提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

六堡茶茶樣取自廣西梧州中茶茶廠，2015 年11月產，蒸前樣為剛渥堆好的發酵樣；蒸后樣為渥堆好汽蒸后的蒸壓樣，于陰涼避光處保存。

分離培養基：PDA培養基、查氏培養基；純化鑒定培養基：查氏培養基、20%蔗糖查氏培養基（CZA20S）、改良的20%蔗糖查氏培養基（加2%的六堡毛茶茶湯）。

1.2 試驗方法

1.2.1 汽蒸前后六堡茶微生物的分離純化 分離：分別稱量10 g蒸前樣、蒸后樣六堡茶于250 mL三角瓶中（含玻璃珠），加入90 mL無菌水，于振蕩器中振蕩15 min，即制成10-1倍菌懸液，在超凈工作臺上吸取1 mL10-1倍菌懸液加入到裝有9 mL無菌水的試管中，得10-2倍稀釋菌懸液，以此類推，依次稀釋至10-7倍菌懸液。分別取1 mL各稀釋濃度的菌懸液置于PDA平板上，用無菌三角玻璃板均勻涂布，每個濃度3次重復，于恒溫培養箱內28℃培養7 d。

純化：選擇生長適宜的平板用接種針挑取少許菌絲，用劃線分離法在查氏、20%蔗糖查氏、改良蔗糖查氏培養基上進行多次分離培養得到純種菌株、編號，用試管斜面培養，4℃保存。

1.2.2 菌株的形態學觀察 將保存的菌種取出，于28℃活化培養24 h，用三點接種法將菌株接于PDA培養基、20%蔗糖查氏培養基、改良的20%蔗糖查氏培養基上，置于28℃恒溫培養箱倒置培養，每天觀察菌落的生長情況并做好記錄。根據菌株的形態，初步判定菌株的類別，根據類別選擇不同的方法進行光學顯微鏡觀察。

（1）真菌用插片法觀察：將滅菌的蓋玻片呈45～50°插入查氏和20%蔗糖察氏培養基，待菌絲擴展至蓋玻片，取出將其放在載玻片上（粘有菌絲的一面朝上），在光學顯微鏡下觀察并拍照。（2）細菌用油鏡觀察法：革蘭氏染色后，用油鏡進行顯微觀察，拍照記錄。（3）酵母菌用直接觀察法：酵母為單個細胞，呂氏美藍染液染色后，用光學顯微鏡觀察。

1.2.3 菌株的DNA序列分析 用劃線法培養菌株5 d后，按照生工真菌基因組DNA快速抽提試劑盒、細菌基因組DNA快速抽提試劑盒的說明書進行菌株DNA的提取，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的DNA基因組，對成像單一且較亮的基因組進行PCR擴增。

（1）真菌PCR擴增。引物：ITS1F（5′-CTT GGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′）；ITS4（5′-TCC TCCGCTTATTGATATGC-3′）。

反應體系（25 μL）：DNA模板1.5 μL；ExTaq酶（TaKaRa）12.5 μL；IFS1F引物（10 μmol/L）各0.5 μL；ddH2O補足至25 μL。反應條件為：95℃預變性3 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35個循環，72℃延伸10 min。

（2）細菌PCR擴增。引物：27F（5′-AG AGTTT-GATCCTGGCTCAG-3′）；1492R （5′-GGTTACCTTG TTACGACTT-3′）。

反應體系（50 μL）：2×Premix Taq （TaKaRa） 25 μL，引物（10 μmol/L） 各2 μL，DNA模板2 μL，加ddH2O補足至50 μL。反應條件為：94℃預變性5 min; 94℃變性1 min，58℃退火1 min，72℃延伸3 min，進行30個循環，72℃后延伸10 min，

PCR產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，成像系統拍照。將PCR純化產物送至上海生工生物技術有限公司進行測序。將得到的序列在NCBI數據庫中使用Blastn 軟件進行同源序列比對，通過MEGA6 軟件構建系統發育樹。選用鄰位相連法（Neighbor-joining）構建進化樹，用自展檢驗（Bootstrap ）做驗證的進化樹分析，隨機搜索設置為1 000。

2 結果與分析

2.1 形態學鑒定結果

通過對汽蒸前后兩個六堡茶茶樣微生物的分離培養（圖1，封三），得到的菌株根據其形態特征初步歸類劃分，依次編號為LB1～LB7，六堡茶汽蒸前的優勢菌為7株，汽蒸后的樣品中沒有檢測到LB5菌株和LB7菌株，說明高溫汽蒸使這兩株菌致死，而剩余的5株菌，由于耐高溫而存活下來。將LB1、LB2、LB5、LB6、LB7分別接種于PDA與查氏培養基上，LB3接種于查氏與改良的20%蔗糖查氏培養基上，LB4接種于查氏與20%的蔗糖查氏培養基上，進行菌落形態，以及光學顯微鏡觀察，結合真菌鑒定手冊對其進行初步鑒定。

2.1.1 LB1菌株形態 菌落在PDA上易生長，菌落小，直徑約1.2 cm，圓形或者橢圓形，表面濕潤光滑，呈黃色，中凸，粘稠，不透明，后期濕潤菌落易散開。根據上述對該菌菌落及顯微鏡觀察結果，初步鑒定該菌株為細菌（圖2，封三）。

2.1.2 LB2菌株形態 菌落呈圓球，中央隆起，邊緣整齊，濕潤不透明，膠狀，表面具有光澤，直徑約1.2 cm。正面呈深紅色，背面呈粉紅色。光學顯微鏡下，用呂氏美藍染液染色觀察，細胞呈球形或卵圓形，直徑約4 μm，單個、成對或成鏈。根據上述對該菌菌落及顯微鏡觀察結果，結合《中國真菌志》及《真菌鑒定手冊》該菌株初步鑒定為酵母屬（圖3，封三）。

2.1.3 LB3菌株形態 LB3菌株在PDA上長得很慢，在20%蔗糖查氏上長得較快，在加了2%六堡毛茶茶湯的20%蔗糖查氏培養基上長得最快，最茂盛，菌落呈蘑菇狀，菌絲為白色，絨絲狀，菌落底部有較硬的褐色梗，菌落背面有裂紋，成熟后為深褐色，菌絲分布較雜亂，菌絲交叉處有紅褐色近球形或橢圓形子囊，無孢子。根據上述對該菌菌落及顯微鏡觀察結果，結合《中國真菌志》及《真菌鑒定手冊》該菌株初步鑒定為：青霉屬（圖4，封三）。

2.1.4 LB4菌株形態 菌落在察氏瓊脂培養基上生長緩慢，在20%蔗糖察氏培養基生長較快，其生長速度為75 mm/14d，菌落為絨狀，中間微隆起，整體呈金黃色，有同心環紋路，中間部位較邊沿更黃，黃色閉囊殼豐富，成熟后為黃褐色，菌落中心部位有長放射性脊，菌絲有隔，呈不對稱分枝，培養5 d左右其上分布暗灰綠色的分生孢子頭，分生孢子梗莖較長，分生孢子串生，為球形或者近球形，尺寸為4.5～4.9 μm，表面粗糙，培養7 d，有大量成熟的分生孢子脫落在菌絲周圍。菌落背面呈棕褐色，衰老后顏色變深，無脊光滑。結合《中國真菌志》及《真菌鑒定手冊》該菌株初步鑒定為散囊菌屬（圖5，封三）。

2.1.5 LB5菌株形態 LB5菌落在查氏瓊脂培養基上，于28℃條件下培養7 d，直徑達4.8 cm，菌絲體白色，質地絲絨狀，菌落灰褐色；有同心圓，無滲出液；菌落反面為淡灰黃色。分生孢子近球形，結構較密，易產分生孢子，分生孢子近球形，直徑3 μm，壁近光滑。菌落在PDA培養基上生長迅速，菌絲茂盛，灰黑色，菌落有同心圓，背面為灰色，培養5天即可產生大量孢子，孢子成近球形。根據上述對該菌菌落及顯微鏡觀察結果，結合《中國真菌志》及《真菌鑒定手冊》該菌株初步鑒定為曲霉屬，塔賓曲霉（圖6，封三）。

2.1.6 LB6菌株形態 LB6菌落在查氏培養基上于28℃條件下培養7 d直徑1.2 cm，生長快，菌落近圓形，正面為深綠色，邊緣白色，質地平坦，背面呈黃綠色，每枝的末端細胞分裂成串的分生孢子，形成掃帚狀，分生孢子梗壁近光滑。分生孢子一般呈藍綠色，孢子較多，易脫落，成熟后隨風飛散，遇適宜環境，萌發成菌絲。根據上述對該菌菌落及顯微鏡觀察結果，結合《中國真菌志》及《真菌鑒定手冊》該菌株初步鑒定為：青霉屬，灰黃青霉（圖7，封三）。

2.1.7 LB7菌株形態 LB7菌落在查氏瓊脂培養基上，生長迅速，于28℃條件下培養7 d，直徑達4.8 cm，菌絲質地絲絨狀，長滿黑色分生孢子，表面呈暗褐色或炭黑色，正面有同心圓，菌落反面呈灰褐色。分生孢

了頭為球形，直徑約50 μm，分生孢子梗壁光滑，分生孢子近球形，直徑約3 μm。分生孢子成熟后易脫落。根據上述對該菌菌落及顯微鏡觀察結果，結合《中國真菌志》及《真菌鑒定手冊》該菌株初步鑒定為：曲霉屬，黑曲霉（圖8，封三）。

2.2 分子鑒定結果

將以ITS1F與ITS4為引物擴增得到的序列片段在NCBI數據庫的BLAST工具中進行比對，應用MEGA6軟件構建發育樹，確定菌株的歸屬，結果見圖9。

圖9 六堡茶分離菌株的基因組DNA純度檢測以及ITS-PCR產物電泳圖

基于序列相似性達到97%以上的基因克隆子才能定義為同一種物質，而分離出的LB3菌株的相似性只有88%，所以只能確定該菌株為青霉屬。經過大量的文獻查閱以及反復驗證得出：該菌株可能是茶葉中特有的菌種，目前尚未有相關的分子鑒定報道，在NCBI數據庫中沒有相應的序列記錄，所以比對的相似性比較小。由于LB1分子序列在Blast上的比對結果中，前十幾種都為鞘氨醇單孢菌，且相似性均在99%以上，所以沒有進行發育樹的構建，確定LB1為鞘氨醇單孢菌（Sphingomonas sp.，表1）。

根據以上分子序列比對結果以及所構建的系統發育樹系統（圖10、圖11），鑒定得出5個屬7種微生物，包括細菌1種：鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas sp.）；酵母屬1種：膠紅酵母（Rhodotorula mucilaginosa）；散囊菌屬1種：阿姆斯特丹散囊菌（Eurotium amstelodami）；青霉屬2種：灰黃青霉（Penicillium griseofulvum）、Capsulatum 青霉；曲霉屬2種：黑曲霉（Aspergillus niger）、塔賓曲霉（Aspergillus tubingensis）。

2.3 菌株最終鑒定結果分析

菌株的ITS分子鑒定結果結合菌株的形態學鑒定結果，最終得到5個屬7個種微生物，其中形態學無法鑒定的LB1、LB2、LB4菌株通過分子學方法分別鑒定為鞘氨醇單胞菌、膠紅酵母、阿姆斯特丹散囊菌。而LB3在NCBI數據庫中的比對結果相似性小于97%，只能確定其為青霉屬。本試驗用傳統的形態學觀察法結合現代分子生物學技術來鑒定菌株，使結果更加科學嚴謹。試驗得出：六堡茶汽蒸前的優勢菌為塔賓曲霉、黑曲霉、膠紅酵母、LB3青霉、灰黃青霉、鞘氨醇單胞菌以及阿姆斯特丹散囊菌；而在汽蒸后沒有塔賓曲霉以及黑曲霉，說明其在高溫汽蒸時已被殺死，而其余的5種微生物因為

耐高溫而保留下來。所以汽蒸后的優勢菌為膠紅酵母、LB3青霉、灰黃青霉、鞘氨醇單胞菌以及阿姆斯特丹散囊菌。

表1 六堡茶分離菌株的Blastnd的比對結果

圖10 菌株LB2、LB3、LB4、LB5、LB6系統發育樹

圖11 菌株LB7系統發育樹

3 結論與討論

LB3菌株雖然還不能確定到種，但本試驗可以肯定其屬于六堡茶中的真菌，因為在分離汽蒸前后的六堡茶優勢菌時都得到該菌，且在分離過程中，用玻璃棒涂布平板時，該菌在PDA中易生長，菌落較茂密，而純化時在PDA中卻很難生長，原因是在涂布時培養皿上有1 mL茶湯為其提供必需營養，鑒于這一現象，本試驗改良了20%的蔗糖查氏培養基，加入2%六堡毛茶茶湯，對LB3菌株進行培養，發現其在有茶湯的培養基上生長迅速，白色絨狀菌絲茂盛，可以確定該菌株為六堡茶中的真菌。至于其序列在數據庫中的比對值較低，原因可能是目前還沒有該菌的相關報道，在數據庫中沒有相應的序列記錄，所以目前只能確定LB3菌株為青霉屬。

散囊菌屬真菌是存在于黑茶中的優勢菌種，不同品種茯磚茶有冠突散囊菌、謝瓦散囊菌、肋狀散囊菌、阿姆斯特丹散囊菌等優勢菌［6］；六堡茶的優勢菌種也包括散囊菌屬。陳慶金等［7］研究發現，在六堡茶陳化初期不同階段真菌群落曲霉屬和散囊菌屬為主。本試驗從六堡茶中分離純化得到的金花菌株，具有耐高溫性，經過傳統形態學分析結合ITS 序列同源性搜索比對確定為阿姆斯特丹散囊菌，這與毛彥等［8］的試驗結果不同，其鑒定六堡茶的金花菌為雪黃散囊菌，與陳然等［9］試驗結果也不同，其選取多家梧州六堡茶龍頭企業生產的六堡茶產品進行真菌分析，結果得出不同廠家六堡茶產品的優勢菌種包括冠突散囊菌、謝瓦氏散囊菌等散囊菌屬真菌。以上差異可能是由于實驗茶樣來自不同的茶廠，堆的時間和溫度不同，導致成品茶中的“金花”菌種不同。由此可見，六堡茶中的“金花”菌也具有多樣性。

存在于黑茶中的優勢菌黑曲霉能產生酸性蛋白酶、糖苷酶、葡萄糖淀粉酶和乳酸酶等多種酶。可以將毛茶中的多糖、脂肪、蛋白質、纖維素等大分子化合物分解為單糖、可溶性碳水化合物、多肽及各種氨基酸等小分子物質，可以增強茶湯的滋味及甘滑、醇厚的品質特點［5］。酵母菌含有極豐富的蛋白質、氨基酸、維生素、脂肪、粗纖維素、碳水化合物、礦物質及微量元素等，有利于普洱茶形成甜醇、爽滑的品質風格［10］。散囊菌屬真菌可以產生蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶和果膠酶等多種酶系，能將茶葉中的大分子物質分解，使茶葉風味提高［10］，其還具有降脂、減肥、促進消化、改善人體腸道的功效，其發酵產物胞外多糖還具有抑制腫瘤的功效［11］，彭曉赟等［12］研究發現，從冠突散囊菌中提取的化合物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和普通變形桿菌具有顯著的抑制作用。 Yoshiaki等［13-14］研究發現，從蠟葉散囊菌NE-1和NE-4兩個菌株發酵液中，鑒定出具有較高的抗氧化能力，對清除DPPH自由基和過氧化物具有顯著效果的5種化合物。本試驗將用單株菌種發酵六堡毛茶，進一步探索這7種優勢菌對六堡茶品質以及功能的影響，以期為六堡茶的加工、利用和發展奠定一定的理論基礎。

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（責任編輯 白雪娜）

Isolation and identification of dominant microorganisms of Liupao tea before and after steaming

OU Hui-suan1，DENG Xu-ming1，ZHANG Ling-zhi1，ZHANG Jun-wei2，MA Shi-cheng3，4，QIU Rui-jin3，4
（1.College of Horticuture，South China Agricultutal University，Guangzhou 510642，China；2.China Tea （Wuzhou） Co.，Ltd，Wuzhou 543001，China；3.Agricultural Science Research Institute of Wuzhou，Wuzhou 543000，China；4.Wuzhou Liupao Tea Research Institute，Wuzhou 543000，China）

Steaming is the key technology in the process of Liupao tea. seven dominant microorganism strains were separated from Liupao tea samples before and after steaming technology .With the traditional methods to observe the colony strain morphological characteristics，and the optical microscope observation，combined with the molecular biology level of strain for DNA sequence analysis，and through ITS sequence homology search comparisons and analysis of phylogenetic tree，the seven dominant strains from Liupao tea before steaming were identified as Aspergillus tubingensis，A. niger，Rhodotorula mucilaginosa，Penicillium sp，P. griseofulvum，Sphingomonas sp，Eurotium amstelodami. And from the Liupao tea after steaming，A. tubingensis，A. niger，were not detected，they were killed during high temperature steaming，while the rest five microorganisms had high temperature resistance，were important in the aging of Liupao tea.

Liupao tea；dominant microorganisms；isolation；identification

S571.1

A

1004-874X（2017）02-0129-07

2016-11-30

廣東省自然科學基金（5300-E12237）；梧州市科學研究與技術開發計劃項目（201501024）

歐惠算（1991-），女，碩士，E-mail：781088344@qq.com

張靈枝（1972-），女，博士，副教授，E-mail：lingzhi@scau.edu.cn

歐惠算，鄧旭銘，張靈枝，等.汽蒸前后六堡茶中優勢微生物的分離鑒定［J］.廣東農業科學，2017，44（2）：129-135.