FXR mRNA表達(dá)量與肝惡性腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移關(guān)系探討

王崢嶸+龐靜歡+周艷+金劍英+徐永富+郭群依

[摘要] 目的 探討核受體法尼醇（FXR）mRNA表達(dá)量與肝惡性腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。 方法 選取2013年3月～2016年3月于我院接受手術(shù)切除肝癌組織、癌周組織和正常肝組織的46例患者進(jìn)行研究，依據(jù)病理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)分為高侵襲組（n=21）和低侵襲組（n=25），分析FXR表達(dá)與肝惡性腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。 結(jié)果 FXR mRNA在高侵襲組中表達(dá)量顯著高于低侵襲組，在腫瘤組織中表達(dá)量顯著低于癌周組織和正常組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；兩組術(shù)后TB、CB和總膽汁酸含量較術(shù)前顯著下降，且高侵襲組手術(shù)前后TB、CB和總膽汁酸含量均顯著高于低侵襲組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；FXR mRNA表達(dá)量與術(shù)前TB、CB和總膽汁酸呈顯著正相關(guān)（rs=0.455，P=0.038；rs=0.357，P=0.041；rs=0.348，P=0.042）。結(jié)論 肝惡性腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移侵襲性高時，會促進(jìn)膽汁酸分泌，加劇肝內(nèi)膽汁淤滯，從而上調(diào)FXR mRNA表達(dá)量，F(xiàn)XR可能參與抗肝惡性腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移過程，具體還有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

[關(guān)鍵詞] 法尼醇X受體；原發(fā)性肝癌；腫瘤復(fù)發(fā)；腫瘤轉(zhuǎn)移

[中圖分類號] R735.7 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701（2017）07-0001-04

[Abstract] Objective To investigate the relationship between the expression of farnesol X receptor （FXR） mRNA expression and the recurrence and metastasis of hepatic malignant tumors. Methods From March 2013 to March 2016， 46 patients who received surgical resection of liver cancer tissues， peritumoral tissues and normal liver tissues were studied. According to the pathological criteria， they were divided into high invasive group（n=21） and low invasive group（n=25）， and the relationship between expression of FXR and recurrence and metastasis of malignant tumors was analyzed. Results The expression level of FXR mRNA in high invasive group was significantly higher than that in low invasive group， and the expression level in tumor tissues was significantly lower than that in peritumoral tissues and normal tissues （P<0.05）； after surgery， the levels of TB， CB and total bile acid were significantly lower than those before surgery， and the levels in high invasive group before and after surgery were significantly higher than those in low invasive group （P<0.05）； the expression level of FXR mRNA was significantly positively correlated with TB， CB and total bile acid before surgery （rs=0.455， P=0.038； rs=0.357， P=0.041； rs=0.348， P=0.042）. Conclusion Recurrence and metastasis of high invasive hepatic malignant tumors can promote the secretion of bile acid， increase intrahepatic cholestasis， and up regulate expression level of FXR mRNA. FXR may participate in the recurrence and metastasis of hepatic malignant tumors， which remains to be further studied.

[Key words] Farnesol X receptor； Primary hepatocellular carcinoma； Tumor recurrence； Tumor metastasis

膽汁淤積為肝癌常見病理癥狀，是肝惡性腫瘤形成的重要環(huán)節(jié)，患者出現(xiàn)膽汁淤積時，形成的膽汁流以及膽汁代謝障礙會增加膽汁酸等有毒物質(zhì)潴留，惡化肝細(xì)胞和組織損傷，形成膽汁淤積型肝病[1-3]。核受體法尼醇X受體（FXR）參與膽汁代謝過程，可調(diào)節(jié)機(jī)體膽汁酸平衡，此外，Huang等[4]在小鼠模型中研究發(fā)現(xiàn)，敲除FXR基因的小鼠全部出現(xiàn)腫瘤，而野生型小鼠則沒有，認(rèn)為FXR具有促進(jìn)損傷肝細(xì)胞恢復(fù)和生長，抵抗肝癌細(xì)胞擴(kuò)散的作用。目前有關(guān)FXR在人肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移方面的研究鮮有報道，本研究針對我院45例接受肝癌手術(shù)切除的患者，取其切除肝癌組織、癌周組織和正常肝組織進(jìn)行研究，旨在探究FXR的表達(dá)與肝惡性腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的關(guān)系，為臨床治療提供新的靶點(diǎn)。現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2013年3月～2016年3月于我院接受手術(shù)切除肝癌組織、癌周組織和正常肝組織的46例患者進(jìn)行研究。納入標(biāo)準(zhǔn)：標(biāo)本均經(jīng)病理證實(shí)為原發(fā)性肝癌組織；入選患者均無其他惡性腫瘤；患者均為首次接受根治性肝切除術(shù)者，手術(shù)治療前后均進(jìn)行常規(guī)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)檢查。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并嚴(yán)重心、腦、腎、肺等重要臟器病變者；手術(shù)失敗者；因其他非肝炎型病變所致膽汁淤積者；資料不全者；妊娠及哺乳期婦女。本研究患者男37例，女9例，年齡35～75歲，平均（49.51±5.62）歲，其中病理類型為肝細(xì)胞癌者36例，膽管細(xì)胞癌者8例，混合型肝癌者2例；其中伴有肝硬化者24例，不伴有肝硬化者22例；癌細(xì)胞侵襲肝癌門靜脈栓者9例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和神經(jīng)浸潤者3例，肝內(nèi)轉(zhuǎn)移者2例，膈肌浸潤者2例。本研究經(jīng)我院倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本處理和分組 所有患者均行肝癌根治術(shù)治療，切除患者肝癌組織、癌周組織和少部分正常肝組織作為標(biāo)本，所有標(biāo)本離體后10 min內(nèi)取材并放置液氮內(nèi)速凍后于-80℃冰箱保存，用于后期FXR基因檢測。46例患者的肝組織切除標(biāo)本，根據(jù)Silva癌細(xì)胞侵襲性標(biāo)準(zhǔn)[5]，把肝組織表現(xiàn)為腫瘤伴多發(fā)肝內(nèi)擴(kuò)散，和（或）門脈主干癌栓的標(biāo)本分為高侵襲組（n=21），把肝組織表現(xiàn)為腫瘤病灶局限、肉眼和鏡下檢測均無肝內(nèi)擴(kuò)散和門脈浸潤者的標(biāo)本分為低侵襲組（n=25）。

1.2.2 FXR基因檢測 將預(yù)先處理好的存于-80℃冰箱的樣本參照總RNA提取試劑盒（MRC，美國）說明書，用Trizol法提取肝組織樣本RNA；后使用M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Promega）將所提RNA反轉(zhuǎn)成cDNA，放于-20℃冰箱保存；設(shè)計擴(kuò)增FXR基因和內(nèi)參基因（GADPH）引物和探針（表1），參照熒光定量PCR試劑盒（ThermoFisher）說明書擴(kuò)FXR和內(nèi)參基因，總反應(yīng)體系20 μL，所用cDNA模板1 μL，上下游引物各0.4 μL，探針0.3 μL，每個樣本做三個實(shí)驗(yàn)學(xué)重復(fù)，使用Liavak的2-△△Ct法[6]分析FXR基因相對表達(dá)量。

1.2.3 分析患者一般資料 記錄兩組患者手術(shù)前后血清總膽紅素（TB）、結(jié)合膽紅素（CB）和總膽汁酸含量，TB、CB和總膽汁酸均取患者手術(shù)前后清晨空腹靜脈外周血，離心獲得血清后于全自動生化分析儀上檢測（日立7180型），所有檢測試劑為儀器配套試劑。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SAS 19.0軟件進(jìn)行分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)；計數(shù)資料以率（%）表示，比較采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Pearson法，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組不同切除肝組織中FXR mRNA表達(dá)量比較

FXR mRNA在高侵襲組中表達(dá)量顯著高于低侵襲組，在腫瘤組織中表達(dá)量顯著低于癌周組織和正常組織，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

注：與組內(nèi)癌周組織和正常組織比較，*P<0.05；高侵襲組：t腫瘤組織/癌周組織=5.56，P腫瘤組織/癌周組織<0.01；t腫瘤組織/正常組織=5.72，P腫瘤組織/癌正常組織<0.01；t癌周組織/正常組織=0.78，P癌周組織/癌正常組織>0.05；低侵襲組：t腫瘤組織/癌周組織=5.38，P腫瘤組織/癌周組織<0.01；t腫瘤組織/正常組織=5.58，P腫瘤組織/癌正常組織<0.01；t癌周組織/正常組織=0.77，P癌周組織/癌正常組織>0.05

2.2 兩組患者手術(shù)前后TB、CB和總膽汁酸變化

兩組術(shù)后TB、CB和總膽汁酸含量較術(shù)前顯著下降，且高侵襲組手術(shù)前后TB、CB和總膽汁酸含量均顯著高于低侵襲組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表3。

2.3 FXR mRNA表達(dá)量與術(shù)前TB、CB和總膽汁酸的相關(guān)性分析

FXR mRNA表達(dá)量與術(shù)前TB、CB和總膽汁酸呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.455，0357和0.348。見表4。

3 討論

肝臟作為人體重要解毒器官，參與機(jī)體各種解毒過程，而各種代謝的毒性物質(zhì)往往對肝細(xì)胞具有細(xì)胞毒性，但肝臟仍能保持較好機(jī)能，提示肝臟具有再生潛能[7，8]，Kim I等[9]研究發(fā)現(xiàn)，肝臟在病理狀態(tài)下，會激活靜息態(tài)肝細(xì)胞恢復(fù)再生能力，修復(fù)受損肝組織，促進(jìn)肝功能恢復(fù)。膽汁淤積所致的膽汁酸代謝異常是引起肝損傷，導(dǎo)致肝癌的重要原因之一，而FXR在膽汁酸代謝過程中發(fā)揮重要作用[10]，Calkin等[11]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)XR在修復(fù)肝細(xì)胞損傷和對抗肝細(xì)胞凋亡上具有重要作用。本研究針對我院46例接受肝癌根治性切除術(shù)患者，取其切除組織進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)FXR基因在高侵襲性肝組織中表達(dá)量顯著高于低侵襲性組織，推測FXR調(diào)控的促進(jìn)肝再生作用可能參與抵抗肝惡性腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)過程。

膽汁酸被認(rèn)為是胃腸道致癌因子，許多專家在小鼠模型中研究發(fā)現(xiàn)，攜帶乙肝病毒的小鼠，膽汁酸可誘發(fā)其發(fā)生肝惡性腫瘤[12]。膽汁酸主要由肝臟分泌至膽汁，其代謝與肝臟顯著相關(guān)，肝臟對血液中的膽汁酸親和力強(qiáng)，幾乎可將其完全吸收，當(dāng)肝功能處于損傷狀態(tài)時，患者循環(huán)血腫可檢測到膽汁酸含量，故膽汁酸是反映肝臟損傷的重要指標(biāo)[13，14]。本研究中，患者術(shù)前總膽汁酸含量上升，提示肝功能發(fā)生損傷，術(shù)后膽汁酸含量下降，說明肝功能損傷狀況得到改善。此外，所有患者術(shù)前總膽紅素（TB）、結(jié)合膽紅素（CB）顯著高出正常水平，而經(jīng)過手術(shù)切除治療后，患者TB、CB含量顯著下降，說明經(jīng)過手術(shù)治療，患者體內(nèi)膽汁淤積癥狀得到顯著改善[12]。肝細(xì)胞不斷參與膽紅素代謝過程，保證膽紅素不斷清除，避免膽汁酸淤積，而當(dāng)肝臟發(fā)生惡性腫瘤時，膽紅素代謝平衡遭到破壞，患者TB、CB和總膽汁酸含量顯著上升，而通過手術(shù)切除后，腫瘤負(fù)荷降低，患者體內(nèi)膽汁淤積情況得到顯著改善，故TB、CB與總膽汁酸含量下降[15]。本研究中，腫瘤高侵襲組總膽汁酸含量顯著高于低侵襲組，說明腫瘤侵襲可能和膽汁酸含量具有一定相關(guān)性。核受體法尼醇X受體（FXR）具有調(diào)節(jié)膽汁酸代謝作用，本研究通過對不同侵襲組FXR的mRNA表達(dá)量檢測發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)XR mRNA在高侵襲組高表達(dá)，而在低侵襲組表達(dá)量則相對較低，提示FXR可能通過參與調(diào)節(jié)膽汁酸代謝參與腫瘤侵襲過程。FXR在肝臟、腎臟、倡導(dǎo)、腎上腺組織中具有高表達(dá)特性[16]，Makishima等[17]研究顯示，膽酸是FXR的體內(nèi)配體，結(jié)合型或者非結(jié)合型的膽汁酸均可激活FXR。FXR在高侵襲組織中高表達(dá)，究其原因，可能是腫瘤侵襲性強(qiáng)的組織快速增長，擾亂膽汁酸代謝平衡，膽汁酸淤積激活了FXR基因，F(xiàn)XR通過調(diào)節(jié)下游信號通路加強(qiáng)膽汁酸代謝，使肝臟免受侵襲，而此過程同時激活FXR調(diào)節(jié)肝細(xì)胞修復(fù)過程，抵抗癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲[18]。此外，通過對FXR mRNA表達(dá)與TB、CB、膽汁酸相關(guān)性檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)XR mRNA表達(dá)與術(shù)前TB、CB、膽汁酸存在顯著正相關(guān)，再次證明FXR可能參與抵抗肝惡性腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的推測。Fan等[19]研究顯示，基因敲除FXR基因的小鼠注射致癌物后13～15個月便誘發(fā)肝惡性腫瘤，并且體內(nèi)膽汁酸代謝相關(guān)蛋白表達(dá)出現(xiàn)異常，而對照野生型小鼠則沒有發(fā)生此種情況。對敲除FXR基因的小鼠研究發(fā)現(xiàn)，小鼠肝內(nèi)不僅誘發(fā)惡性腫瘤，肝細(xì)胞和組織也發(fā)現(xiàn)明顯凋亡和壞死現(xiàn)象[20]。許多國內(nèi)外專家均證實(shí)，F(xiàn)XF在抑制肝癌細(xì)胞增殖和腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)過程發(fā)揮重要作用，揭示FXF可通過反饋調(diào)節(jié)Ras/Erk和抑制p16/INK4a信號通路參與抗腫瘤過程[15]。此外，F(xiàn)XF具有促進(jìn)肝細(xì)胞再生的功能，Huang等[4]在動物模型中研究顯示，給予0.2%膽酸食物的動物組肝再生程度顯著高于抑制膽汁酸分泌的動物組，而對FXF基因敲除的動物無論添加或抑制膽酸與否，均不會刺激感組織再生，說明FXF可能參與組織再生，F(xiàn)XR修復(fù)肝功能損傷功能一旦缺失，則會引發(fā)肝細(xì)胞功能異常，導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷甚至凋亡。目前有關(guān)FXF在肝癌方面的臨床研究鮮有報道，本研究雖對FXF與肝惡性腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的關(guān)系做出說明，但研究結(jié)果屬于間接推測，還需更進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，肝惡性腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移侵襲性高時，會促進(jìn)膽汁酸分泌，加劇肝內(nèi)膽汁淤滯，從而上調(diào)FXR mRNA表達(dá)量，F(xiàn)XR可能參與抗肝惡性腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移過程，具體還有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 陳永輝.陷胸三金湯加味治療膽汁淤積性肝硬化療效觀察[J].四川中醫(yī)，2014，32（2）：116-117.

[2] 鄭曉君，譚玲，時高峰.肝臟增強(qiáng)CT掃描在肝癌診斷中的研究價值[J].中國CT和MRI雜志，2016，14（10）：80-82.

[3] 張玉平，黃飛舟，羅宏武，等.DDR1基因在不同復(fù)發(fā)傾向肝癌患者中的表達(dá)水平差異及在肝癌臨床預(yù)后中的價值[J].醫(yī)學(xué)臨床研究，2016，33（2）：286-289.

[4] Huang W，Ma K，Zhang J，et al. Nuclear receptor-dependent bile acid signaling is required for normal liver regeneration[J].Science，2006，312（5771）：233-226.

[5] Silva J，Dasgupta S，Wang G，et al. Lipids isolated from bone induce the migration of human breast cancer cells [J]. Journal of Lipid Research，2006，47（4）：724-733.

[6] Livak KJ，Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-△△CT method [J].Methods，2001，25（4）：402-408.

[7] 李文剛，王齊.肝硬化合并非酒精性脂肪肝與肝纖維化程度關(guān)聯(lián)性研究[J].湖南師范大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2015，12（4）：41-43.

[8] 王玉澤，張海叢，張冬，等.乙型肝炎病毒對非酒精性脂肪肝患者肝功能及血清中成纖維細(xì)胞生長因子21的影響[J].解放軍醫(yī)藥雜志，2016，28（1）：62-65.

[9] Kim I，Morimura K，Shah Y，et al. Spontaneous hepatocarcinogenesis in farnesoid X receptor-null mice [J]. Carcinogenesis，2007，28（5）：940-946.

[10] 張冠軍，史小蓮，郭曼曼，等.新型FXR激動劑MT2005改善大鼠膽汁淤積作用[J].中國藥理學(xué)通報，2015，31（B11）：252-252.

[11] Calkin AC，Tontonoz P.Transcriptional integration of metabolism by the nuclear sterol-activated receptors LXR and FXR [J].Nature Reviews Molecular Cell Biology，2012，13（4）：213-224.

[12] 路亮，姚礬，李自生，等.血清總膽汁酸和血清及胃液肝纖維化四項指標(biāo)在胃癌、胃潰瘍中的意義[J].國際消化病雜志，2014，34（4）：286-287.

[13] 顧國妹，何峻峰，楊樂梅.血清總膽汁酸測定在肝臟疾病中的應(yīng)用[J].河北醫(yī)藥，2014，36（23）：3626-3627.

[14] 劉慶蓉，夏慶杰.原發(fā)性肝癌患者血清轉(zhuǎn)鐵蛋白、前白蛋白和總膽汁酸與肝臟儲備功能的關(guān)系[J].華西醫(yī)學(xué)，2014，29（10）：1883-1886.

[15] 李燕，王貴祥，王紅蕾，等.總膽紅素總膽汁酸前白蛋白與肝臟疾病相關(guān)性研究[J].河北醫(yī)學(xué)，2014，20（1）：151-154.

[16] 吳海濱，佘世鋒，蘭紹陽.基于FXR探討茵梔黃注射液利膽退黃的機(jī)制研究[J].遼寧中醫(yī)雜志，2016，43（4）：845-848.

[17] Makishima M，Okamoto AY，Repa JJ，et al. Identification of a nuclear receptor for bile acids[J].Science，1999，284（5418）：1362-1365.

[18] Wang YD，Chen WD，Huang WFXR.A target for different diseases[J].Histology & Histopathology，2008，23（5）：621-627.

[19] Fan Y，Huang X，Yi T，et al. Spontaneous development of liver tumors in the absence of the bile acid receptor farnesoid X receptor [J].Cancer Research，2007，67（3）：863-867.

[20] Fujino T，Takeuchi A，Marukoohtake A，et al. Critical role of farnesoid X receptor for hepatocellular carcinoma cell proliferation [J].Journal of Biochemistry，2012，152（6）：577-586.

（收稿日期：2016-11-07）