核轉錄因子紅細胞系相關因子-2干擾質粒構建及鑒定

湯武裝，李杰

核轉錄因子紅細胞系相關因子-2干擾質粒構建及鑒定

湯武裝，李杰

目的 設計及構建小鼠核轉錄因子紅細胞系相關因子-2(Nrf2)基因的干擾質粒，并篩選出效果最好的干擾質粒。方法 設計3組針對Nrf2基因的核糖核酸干擾(RNAi)序列，應用基因重組技術克隆入載體中構建短發夾RNA(shRNA)，分別為shRNA1、shRNA2及shRNA3，通過基因測序鑒定，經Lipofectamine 2000轉染至BV2細胞， 實時PCR檢測Nrf2 mRNA的表達，Western Blot法檢測Nrf2蛋白的表達。結果 測序表明，克隆入載體中的Nrf2干擾序列及讀碼框完全正確，實時PCR及Western Blot顯示shRNA3干擾效果最強。結論 成功構建小鼠Nrf2的有效干擾質粒，為Nrf2信號通路在腦卒中領域的功能研究奠定了基礎。

核轉錄因子紅細胞系相關因子-2；RNA干擾；BV2細胞

腦卒中目前已成為世界上導致死亡的主要病因，其具有高死亡率、高致殘率及高復發率等特點，同時嚴重危害了人類的健康，并給社會帶來了巨大的損失。目前，普遍認為缺血性卒中的損傷機制是由多種因素共同參與的。這是一個復雜的過程，其發病機制主要包括腦組織能量代謝紊亂、興奮性氨基酸中毒、氧化應激損傷、炎癥反應等多個環節，其中氧化應激是眾多發病機制中的重要環節。越來越多的證據證明刺激內源性抗氧化系統的表達將會是治療腦卒中的主要措施[1]。核轉錄因子紅細胞系相關因子-2(Nrf2) 是細胞內重要的抗氧化應激調控因子，其能夠調控細胞內一系列保護基因的表達[2-4]。因此，以Nrf2作為腦卒中的治療靶點已成為當前一大熱門話題。破壞基因的結構或者抑制基因的表達是研究靶基因功能的主要手段，常用的一種技術就是RNA干擾(RNAi)技術[5-7]。本研究擬采用基因克隆技術，通過設計針對小鼠Nrf2基因的干擾序列，構建相應短發夾RNA(shRNA)的干擾質粒，并將相應的干擾質粒轉染小鼠BV2細胞，從而篩選出干擾效果最佳的shRNA，為進一步觀察Nrf2信號通路對于腦卒中的作用奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 Top10化學感受態細胞購自上海吉凱基因化學技術有限公司；BV2細胞購自中科院上海生命科學院細胞庫；胎牛血清(FBS)購自美國Hyclone公司；DMEM高糖培養液購自美國GiBco公司；胰蛋白酶購自Invitrogen 公司；Lipofectamine 2000購自Invitrogen 公司；引物序列由上海吉凱基因化學技術有限公司合成；實時PCR(RT-PCR)試劑盒購自Takara公司；質粒小量提取試劑盒購自OMEGA公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物技術研究所；兔源β-actin抗體購自美國Bioworld公司；兔源Nrf2抗體購自美國Bioworld公司；抗兔二抗購自美國Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 質粒的構建 從基因庫中查找出針對小鼠Nrf2的核苷酸序列(NM_010902)，并按照相應的設計原則構建針對目的基因(Nrf2)的干擾片段(由上海吉凱基因化學技術有限公司設計合成)。分別設計3條靶序列，各條靶序列如下：靶序列1：CTT ACT CTC CCA GTG AAT A；靶序列2：TGA AGT CTT CAG CAT GTT A；靶序列3：TCG CAT TGA TCC GAG ATA T。此外還設計了1條陰性對照組，其靶序列為：TTC TCC GAA CGT GTC ACG T。最后將設計成功的各組質粒各自命名為shRNA1質粒、shRNA2質粒、shRNA3質粒及NC質粒,并據此分組。

1.2.2 干擾質粒的轉化與測序分析 將三組shRNA質粒轉化Top10化學感受態細胞，然后接種于篩選平板(含氨芐青霉素)，次日隨機挑選陽性單克隆菌落，將陽性菌落培養擴增，最后每0.8 ml菌液加入0.2 ml無菌甘油，混勻后放入-70℃冰箱凍存。取1管菌液送至生物公司進行測序分析。

1.2.3 細胞培養與轉染 用含10%FBS的DMEM高糖培養液培養BV2細胞，細胞按一定密度鋪12孔板，待BV2細胞生長至90%融合度時，按照Lipofec-tamine 2000脂質體轉染試劑盒使用說明書，分別轉染四組質粒：NC組(NC質粒)、shRNA1組(shNRA1質粒)、shRNA2組(shNRA2質粒)及shRNA3組(shNRA3質粒)，轉染后在37℃、5%CO2條件下培養4 h，然后移去無血清無抗生素培養液，加入完全DMEM無抗生素培養基繼續培養至轉染后48 h。

1.2.4 RT-PCR檢測BV2細胞中Nrf2 mRNA的表達

按照Trizol說明書提取各組BV2細胞中的總RNA。Nrf2引物[8]：上游：5′-TCT CCT CGC TGG AAA AAG AA-3′，下游：5′-AAT GTG CTG GCT GTG CTT TA-3′；內參β-actin引物：上游：5′-TTC GTT GCC GGT CCA CAC CC-3′，下游：5′-GCT TTG CAC ATG CCG GAG CC-3′。用逆轉錄試劑盒按照說明書將RNA逆轉錄為cDNA。按照RT-PCR試劑盒說明書操作，反應體系為： SYBR Premix Ex TaqTM(2×) 10 μl；上游引物0.4 μl ；下游引物0.4 μl ；Rox Reference Dye Ⅱ(50×)0.4 μl；cDNA 2.0 μl，加水至總體積20 μl。反應體系于ABI7500 PCR儀上進行反應。反應采用PCR兩步法反應程序：第一步：預變性：95℃ 30 s；第二步：95℃ 5 s，60℃ 34 s，40個PCR循環。

1.2.5 Western Blot檢測BV2細胞中Nrf2蛋白的表達 將轉染的各組BV2細胞加入適量的蛋白裂解液，4℃ 15000 r/min離心5 min，收集上清液，采用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白含量。蛋白樣品加入相應的SDS凝膠上樣緩沖液置于沸水中加熱5 min使蛋白變性。變性的蛋白樣品經SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳后，轉膜(100 V，120 min)至PVDF膜上，再經脫脂奶粉室溫封閉3 h，依次加入稀釋好的一抗4℃孵育過夜，TBST洗膜3遍后加入稀釋好的二抗室溫孵育2 h，TBST洗膜3遍，加入發光液，暗室曝光。

2 結 果

2.1 靶向Nrf2干擾質粒構建成功 將干擾片段與載體連接后形成的各組干擾質粒轉化Top10化學感受態細胞，然后小提質粒，送上海吉凱基因化學技術有限公司基因測序，結果表明各組序列無誤，具體結果見圖1～圖3。

圖1 shRNA1靶向Nrf2干擾質粒基因測序圖

圖2 shRNA2靶向Nrf2干擾質粒基因測序圖

圖3 shRNA3靶向Nrf2干擾質粒基因測序圖

2.2 靶向Nrf2干擾質粒的篩選

2.2.1 各組Nrf2基因mRNA表達水平的比較 見圖4。與NC組比較，shRNA1組、shRNA2組及shRNA3組Nrf2基因mRNA表達水平明顯降低(均P<0.05)，且shRNA3組Nrf2基因mRNA水平最低，該質粒為最佳干擾片段。

圖4 各組Nrf2基因mRNA表達水平的比較。注：與NC組相比*P<0.05，**P<0.01

2.2.2 各組Nrf2基因蛋白表達水平的比較 見圖5。與NC組比較，shRNA1組、shRNA2組及shRNA3組Nrf2基因蛋白表達水平明顯降低(均P<0.05)，且shRNA3組Nrf2基因蛋白水平最低，該質粒為最佳干擾片段。

圖5 各組Nrf2基因蛋白表達水平的比較。注：與NC組相比**P<0.01

3 討 論

Nrf2屬于CNC-bZIP，即CNC亮氨酸拉鏈轉錄激活因子家族[9]。通過上調Nrf2的表達，激活Nrf2信號通路，可以進一步增加細胞活性，同時可以通過抑制氧化應激反應，進而起到神經保護作用，因此Nrf2可能成為卒中治療過程中的一個有效治療靶點[10-13]。

RNAi技術主要通過抑制宿主細胞mRNA轉錄后的基因表達從而發揮作用。隨著RNAi技術的不斷成熟和發展，可以通過沉默目的基因從而研究目的基因的各項功能[5-7]。本實驗設計并合成了針對Nrf2基因的干擾質粒，同時經基因測序證實各組干擾質粒與設計的靶向鏈完全一致，說明目的基因被準確地插入到相應的載體中。RT-PCR定量分析結果提示各組干擾質粒對Nrf2基因mRNA水平均有抑制作用，其中shRNA3的干擾作用最強。此外，Western Blot的結果也證實了各組干擾質粒能一定程度地抑制靶基因蛋白水平的表達，其中shRNA3對目的基因的干擾作用最強，因而其為最佳靶點。本實驗成功構建了針對Nrf2基因的干擾質粒，并篩選出了具有最強抑制作用的干擾質粒，為后期研究Nrf2基因在腦卒中發病機制中的作用及治療機制打下了堅實的實驗基礎。

[1]張宇，張兵．Nrf2-Keap1信號通路與腦卒中[J]．中風與神經疾病雜志，2014，31：372.

[2]Wells PG, Bhatia S, Drake DM. Fetal oxidative stress mechanisms of neurodevelopmental deficits and exacerbation by ethanol and methamphetamine[J]. Birth Defects Res C Embryo Today, 2016, 108: 108.

[3]Shi CL, Zhou XE, Zhang JY, et al. Alpha-Lipoic acid protects against the cytotoxicity and oxidative stress induced by Cadmium in HepG2 cells through regeneration of glutathione by glutathione reductase via Nrf2/ARE signaling pathway[J]. Environ Toxicol Pharmacol, 2016, 45: 274.

[4]Kim J, Keum YS. NRF2, a key regulator of antioxidants with two faces towards cancer[J]. Oxid Med Cell Longev, 2016, 2016: 2746457.

[5]Man DK, Chow MY, Casettari LA, et al. Potential and development of inhaled RNAi therapeutics for the treatment of pulmonary tuberculosis[J]. Adv Drug Deliv Rev, 2016, 102: 21.

[6]Dyawanapelly S, Ghodke SB, Vishwanathan R, et al. RNA Interference-Based therapeutics: molecular platforms for infectious diseases[J]. J Biomed Nanotechnol, 2014, 10: 1998.

[7]Kim YH, Issa MS, Cooper AM, et al. RNA interference: Applications and advances in insect toxicology and insect pest management[J]. Pestic Biochem Physiol, 2015, 120: 109.

[8]Zhang JQ, Shi L, Xu XN, et al. Therapeutic detoxification of quercetin against Carbon tetrachloride-induced acute liver injury in mice and its mechanism[J]. J Zhejiang Univ Sci B, 2014, 15: 1039.

[9]Moi P, Chan K, Asunis I, et al. Isolation of NF-E2-related factor 2 (Nrf2), a NF-E2-like basic leucine zipper transcriptional activator that binds to the tandem NF-E2/AP1 repeat of the beta-globin locus control region[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1994, 91: 9926.

[10]Han J, Xiao Q, Lin YH, et al. Neuroprotective effects of salidroside on focal cerebral ischemia/reperfusion injury involve the nuclear erythroid 2-related factor 2 pathway[J]. Neural Regeneration Research, 2015, 10: 1989.

[11] Jiang S, Deng C, Lv J, et al. Nrf2 Weaves an Elaborate Network of Neuroprotection Against Stroke[J]. Mol Neurobiol, 2016.doi 10.1007/s12035-016-9707-7.

[12]Mao J, Li Z, Lin R, et al. Preconditioning with Gua Lou Gui Zhi decoction enhances H2O2-induced Nrf2/HO-1 activation in PC12 cells[J]. Exp Ther Med, 2015, 10: 877.

[13]Mann GE. Nrf2-mediated redox signalling in vascular health and disease[J]. Free Radical Bio Med, 2014, 75: S1.

Construction and identification of nuclear factor erythroid-2-related factor 2 gene RNA interference recombinant plasmid

TANGWu-zhuang,LIJie.

DepartmentofNeurology,YixingHospitalAffiliatedtoJiangsuUniversity,Yixing214200,China

Objective To construct and identify the shRNA plasmid vector targeting nuclear factor erythroid-2-related factor 2 (Nrf2), and to collect the strongest RNAi effect of Nrf2 shRNA sequence. Methods Nrf2 gene was targeted gene. Three shRNA sequences were designed by software and synthesized by chemical method: shRNA-1, shRNA-2 and shRNA-3. The double strand shRNA oligo was ligated to the vector. The construct was verified by sequencing analysis. BV2 cells were transfected with expressing shRNA plasmid vectors using Lipofectamine 2000. The expression of Nrf2 in the levels of mRNA was detected by real-time PCR, and Western Blot was adopted to abserve the expression of Nrf2 protein. Results Sequencing analysis suggested that the shRNA vectors targeting Nrf2 possessed correct nucleotide sequence and read frame. The result of Real-time PCR and Western Blot showed that the sequence of shRNAi-3 could more effectively knockdown the expression level of Nrf2 than the others. Conclusions The shRNA vectors targeting Nrf2 are successfully constructed and the shRNA can signidicantly inhibit the expression of Nrf2. These findings could provide an experimental basis for further study on Nrf2 signaling pathway in stroke field.

nuclear factor erythroid-2-related factor 2;RNA interference;BV2 cells

江蘇省科技廳自然科學基金面上項目(BK20141121)；無錫市衛生局青年基金 (Q201301；Q201625)

214200江蘇大學附屬宜興醫院(揚州大學醫學院宜興臨床學院)神經內科

李杰

R363

A

1004-1648(2017)02-0120-04

2016-08-15

2016-08-29)