運動疲勞對大鼠骨骼肌纖維GLUT4mRNA和蛋白表達的影響

龔云　王超

摘要：探討運動疲勞引起大鼠骨骼肌纖維GLUT4mRNA和蛋白表達的變化及其可能機制。方法：Wistar大鼠40只，隨機選取10只為正常對照組（D組），其余采用多級遞增負荷跑臺運動建立運動疲勞模型，留其成功的20只為疲勞組（P組）；測試力竭運動后2組大鼠血糖、血尿素氮、血乳酸、血清胰島素含量，采用逆轉錄一聚合酶鏈反應（RT-PCR）法測定股四頭肌細胞GLUT4mRNA的表達，運用免疫組化法觀測該部GLUT4蛋白的表達。結果：力竭運動后即刻，實驗組大鼠血糖、血清胰島素含量均顯著低于（P<0.05）D組大鼠，而血乳酸水平卻顯著高于（P<0.05）D組大鼠，骨骼肌纖維GLUT4mRNA及蛋白的表達均較D組大鼠顯著上調（P<0.05）。結論：運動疲勞后大鼠能量基本耗竭、通過非胰島素途徑迫使機體以上調骨骼肌纖維GLUT4tuRNA和蛋白表達來應激，以此延擱由能量衰竭所引起的級聯反應，從而形成一種適應性保護反應來減緩運動性外周疲勞的發生。

關鍵詞：運動疲勞；骨骼肌纖維；GLUT4mRNA和蛋白表達；RT-PCR；免疫組化；大鼠

中圖分類號：G 804.2 文章編號：1009-783X（2017）02-0182-06 文獻標志碼：A

在運動性疲勞外周機制的研究中，骨骼肌糖代謝是重要的聚焦點，其主要限速步驟是葡萄糖運載體4（GLUT4）介導的葡萄糖跨膜轉運。有研究顯示，GLUT4的表達從根本上決定了其轉運葡萄糖的能力；而這種葡萄糖轉運能力的高低，又直接影響骨骼肌纖維糖氧化供能的底物水平。巫菲等研究表明，慢性心力衰竭可致大鼠骨骼肌GLIT4mRNA表達顯著降低。龔豪杰等的研究顯示：2周低氧及低氧訓練均能引起野生小鼠骨骼肌GLUT4表達的增多；1 h不同強度跑臺運動后，野生小鼠骨骼肌GLUT4基因表達量顯著增加。唐艷婕等研究結果顯示，游泳訓練使T2DM大鼠腓腸肌GLUT4蛋白表達增強。楊曉冰的研究認為，運動可以提高胞膜內GLUT4轉運速率，且能夠增加大鼠骨骼肌細胞內GLUT4的含量，并促進骨骼肌細胞對葡萄糖的攝取和利用。運動性疲勞能量衰竭學說認為，運動疲勞時骨骼肌纖維葡萄糖幾近耗竭、ATP生成減少，運動能力下降而不能維持預定的運動強度。造成這種結果的原因是否與骨骼肌纖維GLUT4的表達有關，相關報道尚不多見。本文通過遞增負荷跑臺運動建造大鼠運動性疲勞模型，測試力竭后即刻血糖、血尿素氮、血乳酸及血清胰島素的變化，并運用RT-PCR技術和免疫組化法檢測大鼠骨骼肌GLUT4基因和蛋白表達水平，旨在從分子水平上探討機體適應性變化規律及其可能機制，為運動性疲勞外周機制研究積累有益的資料。

1.材料與方法

1.1實驗動物及其飼養環境

選取8周齡健康雄性Wistar大鼠（SPF級）40只，購自甘肅中醫藥大學實驗動物中心（合格證號：SCXK-（甘）-2011-0001），體質量175-200 g。采用國家標準嚙齒類飼料喂養，自由飲食。室溫23-25℃，相對濕度40%～60%，自然光照，安靜無噪聲。飼養室、用具等每周紫外燈照射消毒。

1.2建模及分組

所有大鼠適應環境1周后，在動物跑臺（BCPT-96型，中國杭州錢江科技工貿公司）上行3 d適應性訓練，淘汰體重過輕或過重及不適應跑臺訓練的大鼠，后隨機選取10只為對照組（D）；剩余大鼠以Bedford的方法為基準，對常用的多級遞增負荷跑臺運動方案加以改良，以此建立大鼠運動疲勞模型：坡度為0、三級負荷：I級負荷（15 m/min，30 min），Ⅱ級負荷（20 m/min，30 min），Ⅲ級負荷（25 m/min，60 min），前6 d每天按不同等級跑一遍，第7天由Ⅲ級負荷跑至力竭（跑姿由蹬地式轉為伏地式，滯留在跑道上不動，聲、光、電刺激及棍棒驅趕均無效），留取建模成功大鼠20只為疲勞組（P）。

1.3取材及指標測試

力竭后即刻將每只大鼠準確稱重并尾靜脈取血測試尿素氮（全自動生化分析儀，蘭州軍區總醫院安寧分院檢驗科）和血乳酸（便攜式血乳酸儀）。后在深麻醉下（0.4%戊巴比妥鈉腹腔注射）腹主動脈取血測定血糖（葡萄糖檢測試劑盒，己糖激酶法）及血清（4℃下3 000 r/min離心10 min，取血清于-20℃冰箱保存）胰島素（放射免疫分析試劑盒，購自濰坊三維生物工程集團有限公司）含量。同時迅速分離兩側股四頭肌，并切取相同位置5mm3組織2塊，將右側股四頭肌塊置于10%甲醛溶液固定后，行常規免疫組織化學法觀測細胞膜上GLUT4蛋白含量。將左側股四頭肌塊置預冷生理鹽水中沖洗積血多次，濾紙吸干水分。用標記好的錫紙包裹，置于液氮中冷凍過夜，然后置于-20℃低溫冰箱保存，用RT-PCR法測定GLUT4mRNA表達情況。

1.4GLUT4mRNA表達的RT-PCR測定

1.4.1總RNA提取及檢測

將左側股四頭肌塊從液氮中取出并復溫，采用UNIQlO柱式Trizol總RNA提取試劑盒（上海生工生物工程股份有限公司）并嚴格按要求進行操作。提取后采用紫外分光光度法、1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行純度、濃度及完整性檢測。

1.4.2引物

GLUT4引物序列如下：

Primer 1：5'-GCTTCCTTGGGTTGTGGCAG-3'；Primer 2：5'-CTGGAAACCCGAOGGCATCTTG-3'。

以B-aetin為內參照，其引物序列如下：

Primer 1：5'-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3'；Primer 2：5'-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3'。

1.4.3RT方法

采用Promega公司試劑盒（具體方法詳見產品說明書）。

1.4.4PCR法

采用上海鼎國生物工程公司試劑盒（西班牙進口分裝）并嚴格按要求操作。循環條件：94℃變性1 min，58℃退火1 min，72℃延伸1 min，循環35次，最后一次可延長至7 min。

1.4.5結果分析

擴增產物經1.5%的瓊脂糖凝膠電泳后，經JS-380C全自動凝膠成像分析系統觀察并拍照，使用ImageJ圖像分析軟件分析灰度值（統一設定面積294，乘以灰度值面密度即得），將同組GLUT4基因擴增產物與B-actin內參進行比較得基因相對表達量，因反色而求其倒數得最終值，以此比較P組與D組大鼠基因表達量的差異。

1.5GLUT4蛋白袁迭的免疫組化觀測

隨機選取2組大鼠右側股四頭肌各5塊，切片隔5選1，每塊制成石蠟切片5張、2組共計50張，常規脫蠟至水；微波抗原修復后，按照常規免疫組化方法制片。在Motic數碼顯微鏡（BA400/450，麥克奧迪實業集團有限公司）下觀察上述免疫組化切片，發現股四頭肌肌纖維呈現棕色，示陽性染色，提示有GLUT4蛋白表達。在1 000倍視野下，每張切片隨機選擇1張圖像拍照，每張照片選擇2個細胞輪廓清晰且陽性反應較明顯的部位，用Mofie Images Advanced 3.1圖像處理軟件測量該部位周長和面積。共計測量陽性反應部位100個。

1.6數據處理

采用SPSS 13.0統計軟件對所測數據進行統計學處理，所有數據均以平均數加減標準差（X±SD）表示。組問差異比較采用t檢驗，其中差異顯著水平為P<0.05，差異非常顯著水平為P<0.01。

2.結果

2.1力竭運動后即刻大鼠部分指標測試

實驗結束后即刻，2組大鼠體重、血尿素氮及血乳酸測試結果見表1。

力竭后即刻，疲勞組大鼠跑姿由蹬地式變為伏地式，滯留在跑道末端不能繼續運動，且聲、光、電刺激以及驅趕無效。由表1可以看出：體質量在2組之間無明顯變化（P>0.05）；與對照組相比，疲勞組大鼠BLa、BUN顯著升高（P<0.05）。據此可以判斷，實驗組大鼠已發生運動性疲勞，本實驗建立的運動性疲勞大鼠模型是成功的。

2.2力竭運動后即刻大鼠血糖及血清胰島素測試

力竭運動后即刻，2組大鼠血糖及血清胰島素測試結果見表2。與D組比較，力竭運動后即刻，疲勞組大鼠血糖及血清胰島素水平顯著降低（P<0.05）。

2.32組大鼠股四頭肌肌纖維GLUT4 mRNA表達的RT-PCR測試

2.3.1GLUT4mRNA純度、完整性檢驗

本實驗通過紫外可見光分光光度計，在波長260 nm及280nm下測得大鼠A260/A280的比值，具體結果見表3。A260/A280的比值均在2.0～2.1，提示所提取的RNA無降解，且無殘余的蛋白質或者酚類物質存在，沒有被碳水化合物、鹽、有機溶劑污染，無需純化。同時，還檢測了各組大鼠總RNA濃度，發現無顯著性差異，提示提取RNA的過程中加樣誤差較小。

另外，通過瓊脂糖凝膠電泳，還檢測了2組大鼠骨骼肌纖維GLUT4mRNA的完整性，如圖1所示。RNA樣品電泳后條帶無雜質，且可以顯示28 s、18 s和5 s的小分子條帶。通過紫外線成像系統觀察，電泳條帶28 s和18 s的比值約為2：1，表明所提取的RNA無降解，完整性較好。

2.3.2內參引物B-actin電泳檢測結果

經瓊脂糖凝膠電泳可見內參引物B-actin條帶清晰，無雜質，在100～250 bp，如圖2所示，與經過PCR擴增的GLUT4mRNA相比較，可以清晰地看到擴增出來內參引物B-actin與GLUT4mRNA片段長度都控制在200 bp左右，如圖2和3所示，說明擴增效率較為一致，可供后續進行實驗。

2.3.32組大鼠股四頭肌肌纖維GLUT4 mRNA的表達

單鏈的GLUT4mRNA經逆轉錄形成了等量且相對較穩定的雙鏈cDNA，以cDNA為模板進行PCR擴增，將擴增產物行瓊脂糖凝膠電泳，利用凝膠成像系統觀察并拍照，如圖4所示。

從圖4可以看出，B-actin在4組中的表達基本一致，而P1、P2組GLUT4基因表達亮度均強于D1、D2組；用Image J軟件做灰度值掃描，結果見表4。

由表4可知，大鼠P1和P2組的GLUT4基因表達最終值分別比D1、D2組顯著（P<0.05）增高，提示運動疲勞致使紋狀體神經元GLUT4mRNA的表達明顯增強。

2.4 2組大鼠股四頭肌肌纖維GLUT4蛋白表達的免疫組化測定

力竭運動后即刻，隨機選取2組大鼠右側股四頭肌各5塊行常規免疫組化實驗，后用數碼顯微鏡觀察大鼠股四頭肌GLUT4蛋白的表達，可見其免疫反應產物呈棕黃色，陽性細胞輪廓清晰。在1 000倍視野下拍照，用Motic Image advanced3.1圖像分析系統隨機對陽性部位進行面積和周長測定，結果見表5和圖5。

從免疫組化切片可以看出，2組大鼠骨骼肌細胞膜上GLUT4均呈陽性表達。用Motic數碼顯微鏡可觀察到骨骼肌細胞中均有大量棕黃色反應團塊。在1 000倍下可見免疫陽性反應產物呈棕黃色或棕褐色。與對照組相比，疲勞組大鼠骨骼肌細胞膜上GLUT4蛋白陽性反應產物面積顯著（P<0.05）增大，且染色深、分布密集，周長也顯著增長（P<0.05），見表5和圖5。

3.討論

當機體的生理過程不能持續其機能在一特定水平或不能維持預定的運動強度時，將發生運動性疲勞。根據其發生部位，可分為中樞疲勞和外周疲勞2類。外周疲勞主要體現為骨骼肌非有效收縮；然而，有效收縮須依賴充足的能量供應，葡萄糖是機體能量的重要來源，葡萄糖穩態是維持機體諸多生理功能的重要保障。現已知，葡萄糖的跨膜轉運是骨骼肌細胞利用葡萄糖的主要限速步驟。這一過程需依靠細胞膜上的特殊轉運蛋白_葡萄糖運載體（glucose transporters，GLUTs）介導完成。骨骼肌細胞中存在2種GLUT，分別為GLUTl和GLUT4，前者主要位于骨骼肌細胞外膜上，只在基礎狀態下參與細胞對葡萄糖的攝取和轉運；而后者在基礎狀態下主要位于細胞內的微粒體和某些特定的囊泡等各種內膜結構上，對胰島素和收縮刺激敏感，是骨骼肌細胞主要的GLUT。對GLUT4基因敲除小鼠的研究顯示，無論在基礎狀態下、還是胰島素刺激或運動刺激下，GLUT4對維持正常葡萄糖轉運速率是必不可少的。在小鼠、大鼠和人類骨骼肌中，GLUT4是主要的亞型。可見，研究運動疲勞對骨骼肌細胞GLUT4mRNA及蛋白表達的影響及調控機制是十分有意義的。

本實驗以Bedford早年的方案為基準略加改造，坡度固定、強度遞增，在行為學觀察的同時佐以體重、BUN及Bla指標綜合判定疲勞狀態。結果發現：疲勞組大鼠BUN、Bla濃度顯著高于對照組（P<0.05），而體重2組間并無顯著差異。在長時間運動過程中，因能源物質耗竭而使氨基酸分解代謝加強，引起BUN生成過多致使血清BUN含量升高；Bla是糖酵解的產物，其產量與運動強度成正比。據此可以推斷，我們建立的運動性疲勞大鼠模型是成功的。

有關運動與血糖關系的研究結果不盡相同。鄭陸等研究發現，大鼠負重游泳至力竭時血糖水平升高。朱亞林等在其力竭運動試驗中發現，血糖濃度幾乎沒有發生改變。楊東升等的實驗揭示，力竭運動過程中大鼠外周血糖濃度隨時間延長而顯著降低。本實驗結果顯示：大鼠末次跑臺運動至力竭，血糖濃度顯著降低（P<0.05）。造成這些不同結果的原因，除與運動強度、運動方案、運動時間及頻次有關外，可能也與其自身調節因素有關。胰島素（insulin，ISN）是體內的唯一降糖激素，其作用的主要靶組織是骨骼肌組織和脂肪組織，胰島素首先與骨骼肌細胞表面受體的a亞基特異性結合，接著使受體B亞基的多個酪氨酸殘基磷酸化，這種磷酸酪氨酸與含有磷酸酪氨酸結合域的蛋白（主要指IRS-1、IRS-2）相互作用，進而激活P13K（磷脂酰肌醇-3-激酶），通過Akt（PKB）途徑促使GLUT4囊泡膜轉位，促進葡萄糖轉運入骨骼肌細胞被氧化利用，從而造成血糖下訶。從本實驗結果可知，力竭運動后實驗組大鼠血清胰島素濃度顯著下降（P<0.05）。這可以解釋為：一方面力竭運動本身需要耗費大量葡萄糖，外加胰島素作用，使血糖濃度顯著降低；另一方面，此時低葡萄糖負荷反饋調節胰島B細胞減少胰島素分泌，又造成血清胰島素濃度顯著下降，對胰島細胞起到有效的保護作用。另外，本實驗結果還提示我們，運動疲勞還引起實驗組大鼠GLUT4mRNA及蛋白表達顯著上調，這又作何解釋？

顯然，低葡萄糖、低胰島素不可能作為信號因子弓I發級聯反應而上調GLUT4mRNA及蛋白表達。有研究顯示：運動和胰島素刺激肌肉葡萄糖轉運存在不同的機制。與胰島素效應相比，運動并不增加胰島素受體、IRSl、IRS2酪氨酸磷酸化或P13K活性。對AMP活化蛋白激酶（AMPK）的研究發現，AMPK參與調解具有收縮活性的骨骼肌多種代謝和生長過程。AIVIPK是代謝產物傳感蛋白激酶家族成員之一，并作為燃料計量器監控細胞能量水平。當骨骼肌收縮、缺氧、氧化磷酸化解偶聯和滲透壓休克時，AMPK被迅速激活嘲。一方面它能切斷ATP消耗通路并打開ATP再生旁路途徑，以此延緩能量迅即衰竭；另一方面，激活的AMPK可能通過調節基因轉錄影響GLUT4mRNA表達上調，并間接影響其翻譯水平。有關后者的證據來自對酵母AMPK同系物SNF-1的研究，發現AMPK在基因轉錄中發揮重要作用。賈維娜等的研究顯示，長期高脂肪酸飲食可致大鼠骨骼肌GLUT4mRNA表達顯著下降。施曼莉等的研究結果表明，進行8周高強度間歇跑臺運動后，SD大鼠骨骼肌總GLUT4及肌膜GLUT4蛋白表達顯著增高。劉霞等的研究顯示，長期的有氧運動可顯著增強T2DM大鼠脂聯素-AMPK-GLUT4信號通路，單純的膳食控制對改善T2DM大鼠脂聯素-AMPK-GLUT4信號通路的作用不大，有氧運動聯合膳食控制對增加T2DM大鼠骨骼肌AIVIPK和GLUT4有顯著交互作用。張茁等的研究結果顯示，6周的山柰酚灌胃能顯著上調KKAy小鼠骨骼肌GLUT4基因及蛋白的表達，其作用機制可能和上調P13K-AKT-GLUT4信號通路有關。這樣就可以解釋本實驗中，運動疲勞引起骨骼肌GLUT4mRNA及蛋白表達上調的部分機制，但進一步闡明收縮刺激引發的葡萄糖轉運的具體路徑和環節將是今后骨骼肌生物學研究的主要目標。

4.結論

1）本實驗通過改良而建造的運動性疲勞大鼠模型是成功的。2）運動性疲勞引起大鼠血糖、血清胰島素濃度均顯著下降，卻使血乳酸、血尿素氮濃度顯著增高。3）運動性疲勞引起大鼠骨骼肌GLUT4mRNA和蛋白表達增強。對于第2、3條之間的內在生理機制和邏輯關聯，我們可以理解為：本實驗通過遞增負荷跑臺運動建造運動疲勞大鼠模型，力竭只是運動性疲勞的終極階段，疲勞的發生是動態的累積過程。大鼠跑臺運動至力竭，作為能量底物的葡萄糖已基本耗竭，這種低葡萄糖負荷反饋調節胰島素分泌減少；此時，機體通過非胰島素依賴途徑，即運動肌肉收縮刺激使AMPK激活，進而激發相關信號轉導通路而致骨骼肌細胞GLUT4mRNA表達上調、促使GLUT4蛋白合成增多并積極轉位，以此提高葡萄糖的轉運速率，延擱由能量衰竭引發的級聯反應，從而延緩運動性疲勞的發生。