紅海欖內生細菌多樣性及其抑制魚類致病菌活性研究

摘要： 紅海欖為紅樹科紅海屬植物，廣泛分布于熱帶海岸的紅樹林中，為真紅樹植物的典型代表。該研究以廣西山口紅樹林國家級自然保護區紅海欖為對象，應用稀釋涂布法和三線法從紅海欖各組織中分離出17株內生細菌，通過各菌株形態特征觀察及利用16S rRNA序列基因和韋恩圖分析其內生細菌多樣性。結果表明：17株內生細菌分屬3個門5科7屬8種，Micromonospora和Mangrovibacter屬為其優勢類群。進一步分析發現紅海欖根莖葉等組織的內生細菌類群差別較大，僅有1個相同菌屬，17株菌中有3株菌與已有細菌物種典型菌株的全長16S rRNA基因相似性低于97%，代表著潛在的新屬或新種。運用紙片法研究8株內生細菌發酵液的乙酸乙酯提取物對魚類致病菌副溶血弧菌活性抑制效果，發現3株內生細菌（H003、H013、H009，濃度5 mg·mL1）的代謝產物對副溶血弧菌具有較強的抑菌活性，其抑菌圈直徑分別達到（8.4±0.07）、（8.2±0.07）、（8.3±0.14）mm。該研究結果表明紅海欖中具有較好的內生細菌多樣性和抑菌活性，為今后研究其內生細菌的化學多樣性及其應用提供了重要的物質基礎。

關鍵詞： 紅海欖， 內生細菌， 物種多樣性， 副溶血弧菌， 抑菌活性

中圖分類號： Q946，Q939.1

文獻標識碼： A

文章編號： 10003142（2017）03030807

Abstract： Rhizophora stylosa is an evergreen tree with prop roots， and a common tree found in tropical coastal mangrove forests， widely distributed in tropical coastal mudflats. As a typical representative of the mangrove， R. stylosa has rich endophytic diversity with little research. The study objects of R. stylosa were collected from Shankou National Nature Reserve， Guangxi， China. From stem， root， leaf and other tissues， seventeen endophytes were isolated with the dilution coating method and the threewire method. We Observed their morphological characteristics， 16S rRNA and Venny Chart were utilized to analyze the diversity of their endogenous bacterial. Depending on the results of diversity analysis， we could find that these strains have different morphological characteristics and they could classified into three doors， seven genera， five families and eight species. Further analysis showed that endophytic bacteria groups of R.stylosa root， stem， leaf and other organizations vary different， only one same genus was Mangrovibacter plantisponsor. Micromonospora and Mangrovibacter genus were its dominant bacteria， the proportion was 29.4% and 17.6%， respectively. Among them， the most endophytic bacteria within the root， the proportion was 47.1%. Seventeen strains belong to three doors， wherein the most number of bacteria were Proteobacteria， accounting for 52.9%， then Actinomycetes door accounted for 41.2%. In those isolated strains， three strains of bacterial species with the fulllength 16S rRNA gene similarity less than 97%， may be possible new genera or new genus and had potential research value. Vibrio parahaemolyticus was a zoonotic bacteria caused some damage to uman health， severe cases even death. To test anti Vibrio parahaemolyticus activity of the crude extract of strains isolated， we used filter paper method， and the results indicated that three strains（H003， H009， H013， 5 mg·mL1） had a strong antibacterial activity against Vibrio parahaemolyticus， their inhibition zone could reach （8.4±0.07）， （8.2±0.07）， and （8.3±0.14） mm， respectively. Endophytic bacteria of Rhizophora stylosa were genetically diverse and most of them showed strong inhibition effect against Vibrio parahaemolyticus. The results provides the essential material basis for the further study of its chemical diversity and utilization of resources.

Key words： Rhizophora stylosa， endophytic bacterial， diversity， Vibrio parahaemolyticus， antibacterial activity

副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是一種人畜共患病原菌。副溶血弧菌為革蘭氏陰性嗜鹽菌，主要分布在沿海地區的魚蝦、貝類海產品中，人們食用被該菌污染的海產品，輕者引起腹瀉、嘔吐和惡心等腸胃炎反應，重者可引起敗血癥（高磊等，2014；葉靈瓊等，2011；林強等，2011）。近年來，由副溶血弧菌引起的食物中毒事件已得到廣泛關注，是世界范圍嚴重食源性公共衛生問題之一（林強等，2012）。抗生素是治療該菌所引起疾病的藥物，但隨著抗生素使用量的增加，耐藥株也不斷增加，因此研究其他有效的抑制藥物顯得尤其重要（葉靈瓊等，2011）。海洋低等生物海洋微生物的提取物對副溶血弧菌在內的弧菌具有顯著的抑制活性（張全忠等，2011；韋露等2015）。從海洋生物中找出有效抑制藥物是研究開發新的生物防治藥物的研究熱點。

紅海欖（Rhizophora stylosa）屬于紅樹科（Rhizophoraceae）紅海屬（Rhizophora），是生長在熱帶、亞熱帶海岸潮間的一種特殊植物群體（郭先霞等，2006）。紅海欖內生菌的研究僅有內生真菌多樣性和抑菌的研究（許婷婷等，2009；吳尚英等，2010），內生細菌尚未見有報道。本研究以紅海欖為對象，對其各部位的內生細菌進行分離純化，結合16S rRNA基因序列信息和韋恩圖分析研究其物種多樣性。同時，對內生細菌的代謝產物進行抑菌活性研究，以期獲得具有抑菌活性較強的菌株，為后期篩選相關活性化合物提供良好的研究基礎。

1材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 實驗儀器與設備TGradient多功能梯度PCR儀，GelDOC 2000 凝膠成像系統，JYSPB水平凝膠電泳裝置，SWCJ2F 潔凈工作臺，HVE5高壓蒸汽滅菌鍋，ISRDS3恒溫震蕩器，SHZCB 循環水式多用真空泵，HH. B11BSⅡ電熱恒溫培養箱，VCX500超聲細胞破碎儀。

1.2.2 供試細菌副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）由廣東海洋大學龐歡瑛副教授饋贈。

1.2 方法

1.2.1 樣本來源及采集方法菌株載體采集于廣西山口國家級自然保護區，經廣西北部灣海洋研究中心許銘本工程師鑒定為紅海欖。采集的菌株載體在24 h內完成菌株分離。

1.2.2 菌株的分離純化菌株的分離純化參照李菲等（2015）的方法進行。用無菌海水分別清洗紅海欖的根、莖、葉等各組織器官，切取一部分組織器官進行后續處理。用5%次氯酸鈉將各部分組織浸泡1 min，無菌海水沖洗干凈，75%的酒精溶液浸泡1 min，無菌海水沖洗3遍去除酒精。取3×3 cm的樣品進行研磨，加入1 mL無菌水，混勻后，得到101植物懸液，依次用無菌水稀釋制成102、103的樣液，分別取各梯度稀釋樣液0.2 mL，接種于ISP2、M4、M5、M7、M9、M10、AGG等7種海水培養基中進行涂布培養，每個做3個平行，28 ℃培養2～5 d后觀察菌落，按照菌株的菌落特征（顏色、大小、形態）進行區分。利用三線法對典型的菌落進行劃線純化，純化后的菌株保藏在20%（W/V）甘油管保藏管中，保藏溫度為-80 ℃，同時制成凍干牛奶管保藏于4 ℃。

1.2.3 菌株的16S rRNA基因序列分析DNA提取和16S rRNA基因序列的PCR擴增參照周發林等（2004）的方法進行。利用GenBank BLAST對紅海欖的內生菌線粒體DNA 16S rRNA與庫中細菌進行同源性比對。擴增和測序引物為27F（5′AGAGTTTGATCCTGGCTCA3′）和1492R（5′GGTTACCTTGTTACGACTT3′），PCR反應條件：94 ℃預變性5 min，后進行30個循環（94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s），循環結束后，72 ℃延伸10 min。擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，將所得產物進行測序，并將純化目的片段進行切割回收。測序結果在GenBank中進行BLAST同源性搜索，獲得同源性相近的菌種序列，取同源性高16S rRNA基因序列為參考對象，采用Clustal X進行多重比對，在此基礎上運用MEGA 5.0軟件的“NeighborJoining”法構建分子系統樹，自展數（Boostrap）為1 000檢測各分支的置信值，對各菌株的系統發育地位進行分析（何建瑜等，2013；周煜等，2000）。通過venny在線分析網站，在屬級水平上對紅海欖根、莖、葉來源細菌類群分布進行韋恩圖分析（Tap et al，2009）。

1.2.4 菌株代謝粗產物的獲取從ISP2固體培養基上挑取菌絲接種到裝有50 mL ISP2液體培養基的250 mL錐形瓶中，放入恒溫振蕩培養箱中于28 ℃、180 r·min1條件下發酵培養7 d；使用超聲波細胞破碎儀進行細胞破碎，破碎時間15 min，等體積乙酸乙酯萃取3次，真空濃縮干燥后得代謝粗產物。將粗產物溶于200 μL DMSO中，用PBS緩沖溶液將其稀釋到濃度為5 mg·mL1、0.22 μm的過濾頭進行過濾，裝于已滅菌樣品瓶中，即得所需藥劑。

1.2.5 抑菌活性測定使用紙片法測試所得細菌代謝粗產物對魚類致病菌—副溶血弧菌的抑制活性。將副溶血弧菌接種到TSB液體培養基中恒溫震蕩（28 ℃、180 r·min1）培養12 h制備菌懸液，吸取200 μL菌懸液滴在TSB固體培養基上進行涂布，制成含弧菌的平板。將滅菌后的濾紙片（φ6.0 mm）用鑷子將其平貼在培養基上，吸取5 μL藥劑于濾紙片上，28 ℃溫度下培養1 d，觀察抑菌圈的大小判斷其抑菌活性。其中，陽性對照為5 mg·mL1卡那霉素，陰性對照為5 μL DMSO。每組3個平行。

2結果與分析

2.1 菌株的分離純化及其多樣性

根據內生細菌菌落的不同表觀特征（顏色、大小、形態）和出現時間的不同，從紅海欖各組織器官中共分離出17株內生細菌，依次編號為H001、H002……H017，各菌株形態詳見圖1。從圖1 可以看出，17株內生菌顏色多為白色和黃色，表面光滑不透明。經送美吉公司進行測序后得到各菌株的種和屬，詳見表1。表1顯示，17株內生菌中，從紅海欖葉子中分離出5株內生細菌，莖中分離出4株，根中分離出6株，其中根莖葉中含有相同菌，如H001、H004、H005同為Pantoea Dispersa（泛菌屬）；H008、H002、H017同為Mangrovibacter plantisponsor（紅樹桿菌屬）等。由表1可知，此次分離出的17株內生菌隸屬5科7屬8種，對17株內生細菌去重合并后得到8株內生細菌。

2.2 紅海欖可培養的內生細菌群類比較

在屬級水平上對紅海欖的根、莖、葉來源細菌進行venny分析，韋恩圖（圖2）顯示，不同部位中的可培養細菌雖有差異，但也含有相同的菌屬和菌株。其中，從根部樣品中分離獲得的屬有5個，莖中分離的屬有4個，葉中分離到的屬有3個。根、莖、葉樣品中有一個共有菌屬為Micromonospora ，占12.5%。根和莖有2個相同菌株分別為Mangrovibacter plantisponsor 和 Paracoccus limosus ，根與葉也有2個相同菌，莖葉有1個相同菌。

2.3 菌株系統發育分析

通過比對16S rRNA基因測序結果，將17株內生菌進行基于16S rRNA基因序列的系統發育多樣性分析（圖3）。圖3結果顯示，從紅海欖中共分離的17株內生菌分別屬于3個類群，即變形菌門、厚壁菌門和放線菌門。其中，變形菌門菌株數量最多，占52.9%；而變形菌門內生細菌又分屬兩個綱，即γ變形菌綱和α變形菌綱；其次是放線菌門，占41.2%。

從屬的分類水平上看，分離得到的17株菌中，小單孢菌屬有5株，占29.4%；其次是泛菌屬和紅樹桿菌屬，占17.6%；副球菌屬和芽孢桿菌屬在紅海欖中分布較少，分別分離出2株和1株。

2. 4 紅海欖內生細菌的抑制海洋魚類致病菌活性

以副溶血弧菌為指示菌，采用紙片法對其進行抑菌實驗，選取8株菌株進行發酵后，采用乙酸乙酯溶液萃取其發酵液，最終獲得其代謝粗產物，抑菌實驗結果如表2所示。由表2和圖4看出，H003、H013、H009對副溶血弧菌表現出了較明顯的抑菌作用，其抑菌圈直徑都在8.0 mm以上，其中H003的抑制最強，達到了8.4 mm。

3討論與結論

本研究以廣西山口國家級紅樹林自然保護區的紅海欖為研究對象，對其根、莖、葉進行采樣，利用7種培養基對其內生細菌進行分離純化。研究表明，從紅海欖的根莖葉中共分離出17株內生細菌，隸屬5科7屬，多樣性較為豐富。在分離出的內生細菌中發現，不同的部位分離出菌株數量不同，其中從根部中分離出菌株最多，為8株，其次是莖，葉子最少。根據內生細菌數量和屬類上的差異可以推斷，細菌的多樣性從根部向上是逐步減少的， 土壤是內生細菌的主要來源，植物組織維管束的蒸騰作用使得土壤內微生物進入宿主后由地下部分隨著水分、營養物質逐漸向地上部位擴增，因而各組織內部分內生菌有相同菌屬，且地下部位內生菌的數量多于地上部位（Hollis，1951）。

本研究通過研究紅海欖內生菌次生代謝產物對副溶血弧菌進行抑菌試驗，結果發現有3株內生菌對其有明顯的抑菌效果，抑菌圈直徑均在8.0 mm以上，這對開發新的預防藥物有一定的指導意義。有效菌中有兩株菌（H003、H013）同屬于小單孢菌屬，已有研究表明，小單孢菌屬產生的廣譜抗生素，在抗腫瘤方面具有著廣泛的應用，抗菌方面已研究表明其對金黃色葡萄球菌、彎曲假單孢菌、谷草芽孢桿菌、尖刀鐮孢菌均具有抑制效果（張曉敏等，2013）；其次生代謝產物是新的生物活性物質的重要來源（程元榮和鄭衛，2006；張學武和張建麗，2006）。小單孢菌屬在抑制魚類致病菌方面還未見有詳細報道，作用物質及其作用機理還需進一步的深入研究。

參考文獻：

CHENG YR，ZHENG W， 2006. Micromonospara spp. and their secondary bioactive metabolites [J]. Chin J Antibiot，31（6） ：321-327. [程元榮，鄭衛，2006.小單孢菌及其產生的次級生物活性代謝產物 [J]. 中國抗生素雜志，31（6） ：321-327.]

GAO L，DENG YQ，LIU ZH，et al， 2014. Virulence of Vibrio parahaemolyticus in seafood [J]. Oceanol Limnol Sin，45 （6）：1280-1287. [高磊，鄧益琴，劉助紅，等，2014.石斑魚及暫養環境中副溶血弧菌分離鑒定與毒力評價 [J]. 海洋與湖沼，45 （6）：1280-1287.]

GUO XX，ZHAO ZJ，SONG WD，et al， 2006. Determination of amino acids and trace elements in the endogenous bacterium secondary metabolite of the rhizophora stylosa griff [J]. Food Sci Technol，（5）：103-105. [郭先霞，趙子杰，宋文東，等，2006.紅海欖內生細菌次生代謝物中氨基酸與微量元素的測定 [J]. 食品科技，（5）：103-105.]

HE JY，LIU XZ，ZHAO RT，et al， 2013. Diversity of cultured and uncultured bacteria in surface layer sediment from the East China Sea [J]. Biodivers Sci，21 （1）：28-37. [何建瑜，劉雪珠，趙榮濤，等， 2013. 東海表層沉積物純培養與非培養細菌多樣性 [J].生物多樣性，21 （1）：28-37.]

HOLLIS JP，1951. Bacteria in the healthy potato tissue [J]. Phytopathology，41（3） ：350-366.

LIN Q，LI NQ，FU XZ，et al， 2012. The relationship of Vibrio parahaemolyticus densities and water quality factor during oyster culture [J]. Fish Chin，36（3）：415-421. [林強，李寧求，付小哲，等， 2012. 牡蠣養殖過程中副溶血弧菌與水質因子間的關系 [J].水產學報，36（3）：415-421.]

TAP J，MONDOT S，LEVENEZ F，et al， 2009. Towards the human intestinal microbiota phylogenetic core [J]. Environ Microbiol ，11（10）：2574-2584.

WEI L，CHEN C，LONG YY，et al， 2015. Iolation， identification and antimicrobial activity of Bacillus pumilus B1. [J]. Fish Sci，34（3）：161-168. [韋露，陳償，龍云映，等， 2015. 一株短小芽孢桿菌B1的篩選鑒定及其抗菌特性研究 [J]. 水產科學，34（3）：161-168.]

WU SY，ZHANG Y，LIU AR，et al， 2010. Diversity of endophytic fungi in Rhizophora stylosa and Kandelia candel [J]. J Zhejiang For Coll，27（4）：489-493. [吳尚英，張洋，劉愛榮，等， 2010. 紅樹林植物紅海欖和秋茄的內生真菌多樣性 [J]. 浙江林學院學報，27（4）：489-493.]

XU TT，WU Y，JIA YY，et al， 2009. A Penicillium sp. XGH2321 isolated from the rhizospheric soil of Rhizophora stylosa Griff and its antibacterial activity [J]. Microbiology，36（11）：1682-1687. [許婷婷，吳垠，賈陽陽，等，2009.紅海欖根際土壤來源的青霉屬真菌 XGH2321 及其抑菌活性 [J]. 微生物學通報，36（11）：1682-1687.]

ZHANG QZ，HUANG GZ，SHI YS， 2011. Study on antibacterial activity of marine organisms against bacteria like Vibrio vulnificus

[J]. Chin J Nosocomiol，21（22）：4680-4683. [張全忠，童國忠，石亞素，2011. 舟山海洋生物對創傷弧菌等抑菌活性研究 [J]. 中華醫院感染學雜志， 21（22）：4680-4683.]

ZHANG XM，LIU Q，LIU X，et al， 2013. Isolation and identification of marine Micromonospara sp. MN10 with broadspectrum antimicrobial activity [J]. J Gansu Agric Univ，48（2）：99-104. [張曉敏，劉秋，劉限，等，2013. 1株具有廣譜抗菌活性的海洋小單孢菌 MN10 的分離及鑒定 [J]. 甘肅農業大學學報，48（2）：99-104.]

ZHANG XM，LIU Q，LIU X，et al， 2013. Research progress on the Micromonosporaceae family [J]. J NW A F Univ （Nat Sci Ed），41（9）：175-185. [張曉敏，劉秋，劉限，等，2013.小單孢菌科研究進展 [J]. 西北農林科技大學學報（自然科學版），41（9）：175-185.]

ZHANG XW，ZHANG JL， 2006. Taxonomy and application of micromonospor [J]. Microbiology，33（5）：117-121. [張學武，張建麗，2006.小單孢菌屬的分類及應用研究 [J].微生物學通報，33（5）：117-121.]

ZHOU FL，JIANG SG，SU TF，et al， 2004. Comparative study of mtDNA 16S rRNA gene fragments among six Lutjanus fishes [J]. J Fish Sci Chin，11（2）：99-103. [周發林，江世貴，蘇天鳳，等， 2004. 6種笛鯛屬魚類線粒體16S rRNA 基因片段的序列比較 [J].中國水產科學，11（2）：99-103.]

ZHOU Y，CHEN M L，JIANG L，et al， 2000. Application of 16S rRNA sequence analysis for the study of atmospheric bacteria [J]. Letters Biotechnol，11（2）：111-114. [周煜，陳梅玲，姜黎，等， 2000. 16S rRNA 序列分析法在大氣微生物檢測中的應用 [J]. 生物技術通訊，11（2）：111-114.]