羅漢果色氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因SgTAR2的克隆及表達(dá)分析

摘要： 色氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因家族，是直接參與植物生長(zhǎng)素生物合成途徑的關(guān)鍵酶基因。該研究在羅漢果轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的基礎(chǔ)上，結(jié)合 RACE 技術(shù)克隆羅漢果色氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因SgTAR2的全長(zhǎng)cDNA 序列和DNA序列；并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析和時(shí)空表達(dá)分析。結(jié)果表明：克隆所得SgTAR2的cDNA全長(zhǎng)序列2 078 bp，最長(zhǎng)ORF為1 332 bp，編碼 443 個(gè)氨基酸，GenBank登錄號(hào)為KU949381，其編碼蛋白具有2個(gè)蒜氨酸酶保守結(jié)構(gòu)域和多個(gè)5′PLP結(jié)合位點(diǎn)，推測(cè)其可能參與催化色氨酸轉(zhuǎn)氨基作用、化學(xué)防御作用、生長(zhǎng)素生物合成等生物學(xué)過(guò)程；SgTAR2基因DNA長(zhǎng)為4 103 bp，含有4個(gè)內(nèi)含子和5個(gè)外顯子，其內(nèi)含子具有多個(gè)高水平轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子和多個(gè)與激素、環(huán)境等脅迫響應(yīng)相關(guān)的作用元件，暗示SgTAR2基因內(nèi)含子協(xié)同調(diào)控羅漢果生長(zhǎng)素合成、抗脅迫反應(yīng)、形態(tài)發(fā)育等生物學(xué)過(guò)程。實(shí)時(shí)熒光定量結(jié)果顯示，SgTAR2基因在羅漢果各組織器官均有表達(dá)，在雌蕊和15 d幼果期表達(dá)量較高，暗示該基因參與羅漢果果實(shí)早期發(fā)育。該研究結(jié)果表明SgTAR2參與了生長(zhǎng)素介導(dǎo)的羅漢果不同生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，特別對(duì)幼果及花的起始發(fā)育和器官形態(tài)建成等具有重要意義。

關(guān)鍵詞： 羅漢果， 色氨酸轉(zhuǎn)氨酶， 克隆， 基因表達(dá)

中圖分類(lèi)號(hào)： Q943.2， Q786

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

文章編號(hào)： 10003142（2017）03036508

Abstract： Tryptophan aminotransferase gene family is a key gene that directly involved in auxin biosynthesis pathway in plants. The fulllength cDNA sequence and DNA sequence of Siraitia grosvenorii tryptophan aminotransferase of Arabidopsis 1Related 2 （SgTAR2） gene was amplified by using transcriptome sequencing data and the technology of rapid amplification of cDNA ends（RACE） method. Subsquently， analysis of the gene structure of SgTAR2 by bioinformatics， and the expression levels of SgTAR2 in different tissues of S. grosvenorii were analysed by realtime quantitative method. The results showed that cloned full length of SgTAR2 cDNA sequence was 2 078 bp， containing a 1 332 bp open reading frame （ORF） which encoded 443 amino acids， and GenBank accession number was KU949381. The coding protein had two alliinase domains and multiple 5′PLP binding sites， which might take part in catalytic amino acid transfer， chemical defense， auxin biosynthesis and other biological processes. The fulllength DNA sequence was 4 103 bp with four introns and five extrons， and these introns contained multiple 5UTR Pyrich stretch， hormonal and environmental stress responses related cisacting elements， which might play a role in auxin biosynthesis， stress response， morphological development and other biological processes. The result of Real Time PCR exhibited that SgTAR2 was the highest abundance in pistils and 15 d fruit， and suggested that auxin synthesis was exuberant in initial development of S. grosvenorii fruit. Therefore， SgTAR2 plays a significant role in the growth and development of S. grosvenorii by auxin mediated， especially in young fruit and flower initial development and organ morphogenesis.

Key words： Siraitia grosvenorii， tryptophan aminotransferase of Arabidopsis 1Related， cloning， gene expression

生長(zhǎng)素是一類(lèi)重要植物激素，從胚胎發(fā)育到器官形態(tài)建成和衰老，植物生長(zhǎng)發(fā)育的每個(gè)階段幾乎都受到它的調(diào)控。在花期應(yīng)用生長(zhǎng)素類(lèi)物質(zhì)（2，4D溶液）涂抹羅漢果果柄或子房能誘導(dǎo)單性結(jié)實(shí)（李珍貞和鄔輝平，1988）。由TAA1/TAR基因家族編碼的色氨酸轉(zhuǎn)氨酶催化Trp（色氨酸）通過(guò)轉(zhuǎn)氨基作用生成IPA（吲哚丙酮酸），再由YUC基因家族編碼的類(lèi)黃素單加氧酶催化IPA合成IAA，是植物中迄今發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)完整的生長(zhǎng)素生物合成途徑（圖1）（Mashiguchi et al， 2011； Wang et al， 2015）。

TAA1/TAR作為生長(zhǎng)素合成途徑中的關(guān)鍵酶基因之一，其突變或異常表達(dá)對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育具有廣泛、深刻的影響。擬南芥中，TAA1/TAR基因在胚胎形成初期及以后均能檢測(cè)到，但突變體tar1/tar2受到抑制（Tao et al， 2008）。由于TAA1和 TAR2的突變，細(xì)胞核擴(kuò)散功能缺失，導(dǎo)致雌配子體形成空泡或胚囊各向異性生長(zhǎng)（Panoli et al， 2014）；TAA1/TAR突變體的功能缺失導(dǎo)致根、莖、葉、下胚軸等器官發(fā)育受到影響（Stepanova et al，2008）。施加外源生長(zhǎng)素能抑制 TAA1/TAR 表達(dá)，揭示生長(zhǎng)素能反饋調(diào)控局部生長(zhǎng)素合成（Masashi et al， 2009）；在短柄草幼苗中，導(dǎo)入TAR2like基因能引起下游基因表達(dá)下調(diào)以及轉(zhuǎn)氨酶活性降低，但使用TAA1/TAR特異抑制劑卻可促進(jìn)下游生長(zhǎng)素合成（Davidal et al， 2013）。前期轉(zhuǎn)錄組研究表明，羅漢果TAA1/TAR基因（SgTAR2）與果實(shí)早期發(fā)育密切相關(guān)，但迄今為止未見(jiàn)關(guān)于該基因的研究報(bào)道。本研究在羅漢果SgTAR2的 unigene 序列基礎(chǔ)上，結(jié)合RACE技術(shù)克隆SgTAR2基因cDNA和DNA全長(zhǎng)，考察該基因在羅漢果不同組織器官中的時(shí)空表達(dá)，初步明確其分子和生物學(xué)功能，為深入利用SgTAR2進(jìn)行羅漢果生長(zhǎng)發(fā)育等遺傳改良奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1 材料

所用羅漢果“青皮1號(hào)”雌株采自廣西藥用植物園實(shí)驗(yàn)基地。分別取羅漢果盛花期雌株的莖、葉、芽、雌蕊、雄蕊及15 d果、30 d果，提取DNA和RNA。

pMD19T載體、Pfu DNA聚合酶、PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser、PrimeScript Reverse Transcriptase、SYBR Premix Ex Taq Ⅱ、DNA連接試劑盒購(gòu)自Takara公司，Easy Taq DNA聚合酶、DNA Marker、感受態(tài)細(xì)胞 DH5α 購(gòu)自全式金公司，DNA凝膠回收試劑盒、TRNzol總 RNA 提取試劑購(gòu)自天根公司，其余試劑均為分析純；引物合成和測(cè)序工作均交由深圳華大基因公司完成。實(shí)時(shí)熒光定量PCR BioRad CFX96型熒光定量PCR儀。

1.2 方法

1.2.1 DNA和RNA提取羅漢果各組織器官總DNA采用改良CTAB法提取（魏勝華和孟娜，2011）。各組織器官總RNA提取參照TRNzol總RNA提取試劑（天根）說(shuō)明書(shū)操作。RNA反轉(zhuǎn)錄參照RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TAKARA）說(shuō)明書(shū)操作。用超微量分光光度計(jì)（Thermo Scientific）和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取的DNA和RNA純度和質(zhì)量。

1.2.2 SgTAR2 基因全長(zhǎng)cDNA和DNA擴(kuò)增根據(jù)羅漢果轉(zhuǎn)錄組分析中注釋為T(mén)AR2蛋白的相應(yīng)unigene序列，用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)特異引物tar2S/tar2A，擴(kuò)增cDNA中間序列。采用改良RACE法（羅聰?shù)龋?011）進(jìn)行SgTAR2 基因3′和5′端序列擴(kuò)增：根據(jù)cDNA中間序列分別設(shè)計(jì)5′RACE和3′RACE特異引物tar5′1/tar5′2/tar5′3和tar3′1/tar3′2，深圳華大公司合成5′RACE和3′RACE錨定引物Anchor/AUAP和RTP3/S3，以羅漢果混合樣反轉(zhuǎn)錄cDNA第一鏈為模板，按RACE方案，進(jìn)行槽式PCR擴(kuò)增。回收目的條帶后，連T克隆，經(jīng)藍(lán)白斑鑒定、篩選，送華大基因公司測(cè)序。將測(cè)序驗(yàn)證后的5′RACE片段、cDNA中間序列、3′RACE片段進(jìn)行拼接，獲得全長(zhǎng)cDNA 序列。再根據(jù)拼接序列，在兩端設(shè)計(jì)特異引物Tar2cF/Tar2cR分別以羅漢果DNA和混合樣反轉(zhuǎn)錄cDNA第一鏈為模板擴(kuò)增全長(zhǎng)DNA序列和cDNA序列。

PCR反應(yīng)體系：羅漢果DNA 或cDNA 模 板0.5 μL，10 ×PCR Buffer1.0 μL，上下游引物（10 μmol·L1）各0.3 μL，Taq 酶（5 U·μL1）0.1 μL，dNTP mix（2.5 mmol·L1）0.8 μL，加水補(bǔ)至 10 μL。反應(yīng)程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 8 min。將PCR反應(yīng)產(chǎn)物純化回收，經(jīng)T克隆藍(lán)白斑篩選后送公司測(cè)序。

1.2.3 SgTAR2 基因生物信息學(xué)分析對(duì)不同測(cè)序片段，利用DNAstarSeqMan構(gòu)建重疊群，用DNAstarEditSeq對(duì)SgTAR2的cDNA全長(zhǎng)查找最長(zhǎng)開(kāi)放閱讀框（ORF），并翻譯成相應(yīng)蛋白序列。在NCBI上利用BLASTP工具初步分析SgTAR2相應(yīng)結(jié)構(gòu)域及功能；利用InterProScan （http：//www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan/） 進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)；利用在線工具ExPASy （http：//web.expasy.org/） 對(duì)基因編碼蛋白進(jìn)行基本理化性質(zhì)分析；利用SOPMA（https：//prabi.ibcp.fr/）工具和SWISSMODLE（http：//www.swissmodel.expasy.org/）工具進(jìn)行蛋白進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)分析預(yù)測(cè)；利用在線工具PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare）和PLACE （http：//sogo.dna.affrc.go.jp）預(yù)測(cè)基因內(nèi)含子順式作用元件。

1.2.4 SgTAR2 基因熒光定量PCR分析以基因表達(dá)穩(wěn)定性較好的肌動(dòng)蛋白actin為內(nèi)參基因（涂冬萍等，2015）。根據(jù)羅漢果actin基因（登錄號(hào)為KU949382）和SgTAR2 基因分別設(shè)計(jì)熒光定量引物qActinF/qActinR和qTAR2F/qTAR2R。分別提取大約1 μg的羅漢果各組織器官的RNA，利用 TaKaRa 公司PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒反轉(zhuǎn)錄得到cDNA第一鏈模板，以羅漢果葉cDNA以5倍濃度梯度稀釋6個(gè)濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)品，在BioRad CFX96儀器上進(jìn)行熒光定量實(shí)驗(yàn)，分別制作內(nèi)參基因和目的基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算擴(kuò)增效率，采用 2-△△CT 法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

熒光定量PCR反應(yīng)體系：cDNA模板0.5 μL，上下游引物 （10 μmol·L1） 各0.4 μL， 2×SYBR Premix Ex Taq Ⅱ5 μL，加水補(bǔ)至 10 μL。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃ 10 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，40 個(gè)循環(huán)。以 SgTAR2 在羅漢果葉中的表達(dá)量為對(duì)照，用SPSS 16.0 軟件，用duncan對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析（顯著水平α=0.05），并用 Excel統(tǒng)計(jì)軟件繪圖。

2結(jié)果與分析

2.1 羅漢果總DNA和總RNA的提取

采用CTAB法提取的總DNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)質(zhì)量較好（圖2：a），可用于下一步實(shí)驗(yàn)。采用Trizol法提取的RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)顯示，RNA條帶清晰，28S、18S、5S三條帶清晰可見(jiàn)，且28S和18S其亮度比例接近2∶1（圖2：b）；經(jīng)分光光度計(jì)檢測(cè)，OD260/OD280在1.8～2.0之間，表明RNA完整性較好，無(wú)明顯降解，可用于下一步實(shí)驗(yàn)。

2.2 羅漢果SgTAR2 基因cDNA全長(zhǎng)和DNA全長(zhǎng)擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶清晰且單一，回收測(cè)序結(jié)果為235 bp。在得到中間序列的基礎(chǔ)上，采用改良RACE技術(shù)擴(kuò)增5′和3′序列，分別得到511 bp和945 bp的片段。將前述3段序列（圖3）分別經(jīng)BLASTN驗(yàn)證后，拼接重疊群，再次利用BLASTN對(duì)比，發(fā)現(xiàn)5′UTR仍有部分序列未擴(kuò)增出來(lái)，繼續(xù)設(shè)計(jì)引物tar5′3進(jìn)行第二次5′RACE擴(kuò)增。將所有擴(kuò)增得到的序列拼接，并根據(jù)該拼接序列的CDS兩端設(shè)計(jì)基因全長(zhǎng)特異引物，以驗(yàn)證拼接全長(zhǎng)正確性。同時(shí)，以羅漢果cDNA和DNA為模版擴(kuò)增該基因cDNA及DNA序列。PCR擴(kuò)增后經(jīng)克隆測(cè)序表明，該全長(zhǎng)cDNA序列與拼接序列結(jié)果一致，DNA序列相比cDNA序列多出2 143 bp。序列分析表明，該基因cDNA全長(zhǎng)2 078 bp，CDS包含一個(gè)1 332 bp的最長(zhǎng)ORF，編碼443個(gè)氨基酸，包含566 bp 5′UTR和180 bp 3′UTR，GenBank登錄號(hào)為KU949381。

2.3 羅漢果SgTAR2 基因生物信息學(xué)分析

2.3.1 SgTAR2 基因編碼蛋白特性分析利用 NCBI上Blastx工具對(duì)比發(fā)現(xiàn)SgTAR2 基因?qū)儆凇癆ATI superfamily”超基因家族（圖5：a）。利用ExPASy對(duì)該基因進(jìn)行蛋白基本理化性質(zhì)分析，SgTAR2 編碼蛋白理論分子量為49.15 kD，等電點(diǎn)7.24，平均總親水性 -0.146，脂肪系數(shù)83.39，預(yù)測(cè)分子式為C2215H3419N595O639S17，編碼蛋白不穩(wěn)定系數(shù)43.72。利用SOPMA軟件進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)分析顯示，該蛋白β轉(zhuǎn)角占8.82%、α螺旋占36.20%、延伸鏈占22.17%、隨機(jī)線圈占32.81%。通過(guò)SWISSMODLE對(duì)該蛋白進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)如圖4。

利用在線工具 Blastp 和InterProScan對(duì)SgTAR2 的蛋白進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白含有12個(gè)保守結(jié)構(gòu)域（圖5：b）；其中，50～422位之間有5個(gè)保守域，分別是EGF類(lèi)蒜氨酸酶（EGFlike alliinase，IPR006947）、磷酸吡哆醛依賴(lài)轉(zhuǎn)移酶（Pyridoxal phosphatedependent transferase，IPR015424）、蒜氨酸酶C末端（Alliinase Cterminal，IPR006948）、磷酸吡哆醛依賴(lài)轉(zhuǎn)移酶主要結(jié)構(gòu)域Ⅰ（Pyridoxal phosphatedependent transferase， major region， subdomain 1 IPR015421）、磷酸吡哆醛依賴(lài)轉(zhuǎn)移酶主要結(jié)構(gòu)域Ⅱ（Pyridoxal phosphatedependent transferase， major region， subdomain 2 IPR015422）。其中，EGF類(lèi)蒜氨酸酶和蒜氨酸酶C端基因本體預(yù)測(cè)表明，該蛋白具有碳硫解酶活性（GO：0016846）的分子功能；磷酸吡哆醛依賴(lài)轉(zhuǎn)移酶主要結(jié)構(gòu)域本體預(yù)測(cè)表明，該蛋白具有催化活性（GO：0003824）。

2.3.2 SgTAR2 基因結(jié)構(gòu)及其內(nèi)含子信息分析

將SgTAR2 基因的cDNA序列和DNA序列進(jìn)行對(duì)比分析，結(jié)果顯示該基因編碼區(qū)含有長(zhǎng)度分別為1 458、498、77和110 bp的4內(nèi)含子，5個(gè)外顯子長(zhǎng)度分別為791、304、283、303和269 bp（圖6），外顯子和內(nèi)含子的剪切符合GTAG原則，4個(gè)內(nèi)含子AT含量比較高。

利用在線工具PlantCARE （http： //bioinformatics. psb.ugent.be/ webtools/plantcare）和PLACE（https：//sogo.dna.affrc.go.jp/page=newplace）預(yù)測(cè)SgTAR2 基因內(nèi)含子順式作用元件，結(jié)果顯示，內(nèi)含子1具有生長(zhǎng)素響應(yīng)元件（AuxRRcore）、光響應(yīng)元件（SP1）、ABA 響應(yīng)元件（ABRE）、厭氧響應(yīng)元件（ARE）、乙烯響應(yīng)元件（ERE）、熱激響應(yīng)元件（HSE）、 赤霉素響應(yīng)元件（Pbox）、低溫誘導(dǎo)響應(yīng)元件（LTR）、干旱脅迫響應(yīng)元件（MBS）、水楊酸響應(yīng)元件（TCAelement）胚乳特異性響應(yīng)元件（Skn1_motif）、分生組織特異性響應(yīng)元件（CCGTCCbox）、脅迫防御響應(yīng)元件（TCrich repeats），此外，還具有4個(gè)高水平轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子（5UTR Pyrich stretch）、 24個(gè) CAATbox和23個(gè)TATAbox；內(nèi)含子2具有光響應(yīng)元件、高水平轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子、分生組織特異性響應(yīng)元件、7個(gè) CAATbox、23 個(gè) TATAbox、光響應(yīng)的 MYB 結(jié)合位點(diǎn)、赤霉素響應(yīng)元件；內(nèi)含子3具有1個(gè) TATAbox、干旱脅迫響應(yīng)元件、脅迫防御響應(yīng)元件；內(nèi)含子4具有4個(gè)TATAbox、2個(gè) CAATbox和光響應(yīng)元件。

2.4 羅漢果SgTAR2 基因熒光定量PCR分析

為明確 SgTAR2 基因在羅漢果雌株系各組織器官的時(shí)空表達(dá)，采用熒光定量PCR方法分析該基因的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，羅漢果內(nèi)參基因 actin 斜率為 -2.4315，R2為0.979 8，擴(kuò)增效率為93%，目的基因 SgTAR2 斜率為-2.364 6，R2為0.999，擴(kuò)增效率為97.5%，樣品熔解曲線均為單一峰，均在線性范圍內(nèi)，陰性對(duì)照沒(méi)有檢測(cè)到熒光信號(hào)，表明反應(yīng)體系無(wú)污染，引物特異性好，線性關(guān)系好， 實(shí)時(shí)定量試驗(yàn)真實(shí)可靠。利用SPSS 軟件，對(duì)不同類(lèi)型組織部位的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行差異顯著性分析，結(jié)果（圖7）表明，SgTAR2 基因在羅漢果雌株的葉、芽、莖、雌蕊、雄株雄蕊以及授粉后15 d、30 d果實(shí)中均有表達(dá)，表達(dá)量相對(duì)大小依次為15 d果>雌蕊>葉>芽>30 d果>莖>雄蕊；可見(jiàn)，SgTAR2在雌蕊、雄蕊和15 d果中表達(dá)量依次遞增，彼此間均達(dá)到顯著差異；在15 d果中的表達(dá)量比30 d果的顯著增高；在葉、芽、莖和30 d果中表達(dá)量略有差異，但沒(méi)有達(dá)到顯著差異。

3討論

本研究中，羅漢果SgTAR2基因相應(yīng)蛋白屬于天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶家族，該家族蛋白具有特征性的AAT_like保守結(jié)構(gòu)域，在該結(jié)構(gòu)域上發(fā)現(xiàn)2個(gè)蒜氨酸酶保守結(jié)構(gòu)域和多個(gè)5′PLP結(jié)合位點(diǎn)。PLP（磷酸吡哆醛）依賴(lài)酶主要參與催化氨基酸和氨基酸衍生物的合成和降解過(guò)程，按進(jìn)化起源分為五大類(lèi)：天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶超家族、色氨酸合成酶超家族、丙氨酸消旋酶超家族、D氨基酸超家族、肝糖磷酸化酶家族（Christen Mehta， 2001；Kirsch， 2004）。蒜氨酸酶表現(xiàn)CS裂解酶活性，被認(rèn)為是植物原始防御系統(tǒng)的組成部分，當(dāng)細(xì)胞受到外力破壞等作用，蒜氨酸酶與底物發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生含硫復(fù)合物、丙酮酸等物質(zhì)，前者具有抗微生物的化學(xué)防御作用（Scharfenberg et al， 1990；Shimon et al， 2007），后者參與生長(zhǎng)素生物合成等多個(gè)代謝途徑（Liu et al， 2011）。暗示羅漢果 SgTAR2具有復(fù)雜的分子功能，可能參與催化色氨酸轉(zhuǎn)氨基作用和生長(zhǎng)素生物合成等重要生物學(xué)過(guò)程。

許多植物基因中的內(nèi)含子因其具有特征性序列或調(diào)控元件在基因表達(dá)調(diào)控中起重要作用（Chung et al，2006）。水稻OsBP73基因的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)特異基因表達(dá)時(shí)，需要基因內(nèi)含子的參與（陳俊和王宗陽(yáng)，2004）；擬南芥AGAMOUS基因在花中的特異表達(dá)，也需要內(nèi)含子序列的參與（Sieburth Meyerowitz，2004）；擬南芥 PAT1基因的內(nèi)含子有增強(qiáng)基因表達(dá)的作用（Simpson Filipowica，1996）。第一個(gè)內(nèi)含子對(duì)基因表達(dá)調(diào)控貢獻(xiàn)往往最大。水稻 TPI 基因需要第 1 內(nèi)含子的參與才能驅(qū)動(dòng) GUS 基因在水稻組織中表達(dá)（Xu et al， 1994）；水稻OsTubA1基因在分生組織中的正確表達(dá)由第 1 內(nèi)含子介導(dǎo)（Jeon et al，2010）。本研究表明，羅漢果SgTAR2基因含有4個(gè)內(nèi)含子，均表現(xiàn)出順式作用元件的序列特征。其中，內(nèi)含子1具有多個(gè)高水平轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子和與環(huán)境脅迫以及與其它激素互作相關(guān)的作用元件。因此，SgTAR2基因的表達(dá)可能受這些特征序列以及環(huán)境因子的影響或調(diào)控。擬南芥中，TAA1/TAR參與調(diào)控植物避蔭反應(yīng)（Tao et al，2008）；TAA1/TAR功能缺失能抑制高溫誘導(dǎo)的擬南芥下胚軸伸長(zhǎng)（Masashi et al， 2009）；乙烯能通過(guò)調(diào)控TAA1/TARA活性而影響生長(zhǎng)素合成（Wen et al， 2011）。暗示SgTAR2基因內(nèi)含子協(xié)同參與調(diào)控羅漢果生長(zhǎng)素合成、抗脅迫反應(yīng)、形態(tài)發(fā)育等生物學(xué)過(guò)程。

TAA1的基因表達(dá)能影響到所有組織，在TAA1/TIR2啟動(dòng)子的調(diào)控下，擬南芥野生型tir21幼苗恢復(fù)表型，GUS基因在葉、芽、莖、下胚軸、根、胚胎等都有表達(dá)（Stepanova et al， 2008； Masashi et al， 2009）。本研究表明，羅漢果SgTAR2基因在所有組織中均具有組成型表達(dá)的特點(diǎn)，表明該基因參與羅漢果各器官的生長(zhǎng)發(fā)育、形態(tài)建成等生物學(xué)過(guò)程；在15日齡的羅漢果幼果中SgTAR2表達(dá)量較高，與植物幼果中IAA等激素含量較高，成熟期其含量下降（Bapat et al， 2010）的一般規(guī)律相似，可見(jiàn)SgTAR2參與生長(zhǎng)素介導(dǎo)的羅漢果果實(shí)起始發(fā)育及其形態(tài)建成。綜上所述，羅漢果SgTAR2基因克隆和功能的初步研究不僅對(duì)深入生長(zhǎng)素合成及其生長(zhǎng)發(fā)育機(jī)制研究具有理論意義，而且對(duì)實(shí)現(xiàn)果實(shí)發(fā)育及其它激素調(diào)控相關(guān)的遺傳改良也有重要應(yīng)用價(jià)值。

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