兩相法分離純化橡膠樹樹皮質膜

摘要： 橡膠樹樹皮質膜H+ATPase在橡膠樹產排膠過程中扮演著重要角色，制備高純度及高活性的質膜是研究質膜H+ATPase特性和功能的必要條件。該研究以一年生巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis）樹皮為材料，利用差速離心法獲得粗膜微粒體，通過兩相分配法分離純化質膜，并研究兩相體系中不同濃度聚合物（5.9%、6.1%、6.3%、6.5%、6.7%，W/W）和KCl（2、5、8、11、14 mmol·L1 ）對質膜蛋白得率和純化效率的影響。通過Bradford法對質膜蛋白得率進行檢測，同時采用酶活性檢測法對質膜純度進行檢測，分析結果表明選用6.4%（W/W）聚合物濃度和5 mmol·L1 KCl組成的兩相體系可獲得較高純度和得率的橡膠樹樹皮質膜。通過電鏡觀察法在形態學上對質膜純度進一步評價，利用鉛鈾能侵染全部膜組分使其染色，而磷鎢酸只能專一性地侵染質膜并使其染色這一特性，分別使用鉛鈾和磷鎢酸對切片進行染色，并通過透射電鏡對切片染色程度進行直接觀察，結果表明提取的粗膜微粒體中質膜組分較少，存在大量的細胞器膜污染，而純化后的質膜膜組分較單一，其他膜組分污染較少，而且質膜大小較均一，可以用于進行后續橡膠樹樹皮質膜H+-ATPase特性和功能的研究。

關鍵詞： 兩相分配法， 質膜， 橡膠樹， 酶活性檢測法

中圖分類號： Q946

文獻標識碼： A

文章編號： 10003142（2017）03038806

Abstract： The plasma membrane H+ATPase of rubber tree bark involved in various important physiological processes， such as ion transportation， stress responses， production and release of natural rubber latex， the preparation of a high purity and activity plasma membrane is the first and essential step to understand the functions of H+ATPase in some in situ situations. In the present study， the separation of crude microsomes was isolated by differential and gradient centrifugations， the aqueous twophase partition system was employed to separate the organelles membrane constitutions and receive highly pure plasma membrane， and the effect on the extraction efficiency of polymer and KCl concentration in partition was studied as considered the characteristic of bark of rubber tree. The total concentration of plasma membrane proteins was measured by Bradford method. The purity of different membrane was determined by the sensitivity of representative enzyme activity measured by Molybdenum blue method. H+ATPase of plasma membrane was specifically inhibited by NaVO3 under pH 6.5， due to different types of H+ATPase in different organelle membranes， while H+ATPase of tonoplast or plastid membrane was suppressed by KNO3 or NaN3 under pH 8.5， respectively. Our results indicated that the combination of 6.4%（W/W） polymer and 5 mmol·L1 KCl applied in twophase partition system achieved the relatively high purity and yield ratio of plasma membrane whereas high polymer concentration of or KCl could increase the purity but with poor productivity. In order to further verify that morphological diversity between purified plasma membrane and crude microsomes， transmission electron microscopy （TEM） was performed. Paraffin embedded thin sections was made and stained separately with lead uranium and phosphotungstic acid. The morphological analysis showed that in crude microsomes there was little plasma membrane and full of crosscontaminant membrane substitutions， while after purified， the constitution of plasma membrane was relatively pure with less contaminant. In summary， highly purified plasma membrane was yielded by the aqueous twophase partition system with 6.4% （W/W） polymer and 5 mmol·L1 KCl and perform a comparatively singular morphology， which could be further used to reveal the function of H+ATPase of bark of rubber tree in production and release of rubber and other physiological processes.

Key words： aqueous twophase partition， plasma membrane， Hevea brasiliensis， mark enzyme activity detection

植物質膜H+ATPase，是一種典型的P型離子泵，可通過調節細胞內的pH值，驅動物質的次級跨膜運輸，在植物對逆境脅迫的響應、種子萌發、氣孔的開閉、細胞的伸長生長、細胞極性生長等多種生理過程中發揮著重要作用（Serrano，1989）。同時，質膜H+ATPase還能通過多種調節系統，調控基因表達水平以及自身活性，從而適應外部環境以及自身生長發育周期的變化（Serrano et al，1985）。橡膠樹作為一種僅在熱帶地區（如海南、廣東、云南等）能夠種植，且與國民生產生活及軍用物資儲備密切相關的經濟林木，其天然橡膠的產量一直備受關注。在橡膠樹產排膠過程中，往往需要樹皮質膜H+ATPase的參與，質膜H+ATPase通過運輸質子，使細胞膜內外產生電化學梯度，改變胞內pH，進而驅動離子、ATP及糖類等物質向細胞內運輸，滿足橡膠樹乳管細胞在膠乳合成過程中對各類營養物質的需求（Sondergaard et al，2004）。

制備高純度橡膠樹樹皮質膜，是進行橡膠樹樹皮質膜H+ATPase深入研究的必要條件。現階段，已知的質膜提取方法有自由電流法、蔗糖密度梯度離心法和兩相分配法。由于前兩種方法都存在顯著的缺陷，而不能被廣泛應用。兩相分配法由于獲得的質膜純度較高，操作步驟簡單，易受科研工作者的青睞，且已從煙草（Jin et al，2013； Mongrand et al，2004）、擬南芥（Santoni et al，1999）、水稻（Chen et al，2007； Komatsu，2008； Tanaka et al，2004）等數十種植物組織中，分離得到較高純度的質膜，但不同植物材料之間存在很大差異性，造成質膜提取方法也有很大不同，兩相體系的聚合物濃度、KCl濃度、pH值等因素均會影響質膜的純化效率，其中聚合物和KCl濃度的對質膜純化效率的影響最為顯著。（HattiKaul，2001）。本研究基于國內外提取植物質膜的方法，根據橡膠樹樹皮材料的特點，以質膜蛋白產率和標志酶純度為標準，篩選得到兩相體系中橡膠樹樹皮質膜提取的最適聚合物濃度和離子濃度，并通過透射電鏡觀察，進一步對質膜純化前后在形態學的差異進行比較，證明橡膠樹樹皮質膜提取方法確實得到了優化，為接下來對橡膠樹樹皮質膜H+ATPase深入研究打下基礎。

1材料與方法

1.1 主要試劑

葡聚糖T500（Dextran T500）；聚乙二醇3350（polyethylene glycol 3350，PEG 3350）；二硫蘇糖醇（DLDithiothreitol，DTT）；苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）；二硫蘇糖醇（DLDithiothreitol，DTT）；ATPNa2等。

1.2 材料

于中國熱帶農業科學院苗圃中心，選取生長情況基本相同的一年生芽接無性系‘熱研73397’橡膠樹，快速剝取其芽接處至以上30 cm距離的褐化樹皮，放入液氮中速凍留用。

1.3 方法

1.3.1 粗膜微粒體制備稱取一定質量的材料，以1∶5（W/V）比例加入提取液：50 mmol·L1 MOPsBTP（pH 7.5）；0.3 mol·L1 蔗糖；2 mmol·L1 EGTA；2 mmol·L1 EDTA；0.2%（W/V）BSA；0.5%（W/V）PVPP；5 mmol·L1 DTT；5 mmol·L1 L抗壞血酸；0.5 mmol·L1 PMSF。低溫快速研磨，取勻漿液，過濾，分裝，10 000×g，10 min，4 ℃離心。收集上清液，補加1 mL PMSF，分裝至離心管離心，100 000×g，30 min，4 ℃。收集沉淀，重懸于少量重懸液：0.3 mol·L1 蔗糖；5 mmol·L1 磷酸鉀緩沖液；2 mmol·L1 DTT；0.5 mmol·L1 PMSF。液氮速凍，保存于-80 ℃備用。

1.3.2 質膜的純化質膜純化過程皆在4 ℃中進行。如圖1所示，取3 g微粒體加入到9 g兩相系統：不同濃度梯度（5.9%、6.1%、6.3%、6.5%、6.7%，W/W）且等濃度的Dextran T500和PEG 3350；0.3 mol·L1 蔗糖；5 mmol·L1 磷酸鉀緩沖液；不同濃度梯度（2、5、8、11、14 mmol·L1 ）的KCl；無菌超純水。上下顛倒，使其充分混勻，1 500×g，5 min，4 ℃離心。取上相U11，加入未使用下相L21中，在剩余下相L11中加入未使用上相U21，顛倒混勻，1 500×g，5 min，4 ℃離心。取上相U12，加入未使用下相L31中，顛倒混勻，1 500×g，5 min，4 ℃離心。取上相U22，加入下相L32中，顛倒混勻，1 500×g，5 min，4 ℃離心。收集上相U13和U23，添加重懸液，100 000×g，1 h，4 ℃超高速離心。收集沉淀，懸浮于少量懸浮液：50 mmol·L1 MOPs–BTP（pH7.5）；03 mol·L1 蔗糖；2 mmol·L1 DTT；1 mmol·L1 PMSF；0.1 mmol·L1 EDTA。將富含質膜的懸浮液放入液氮中速凍后，放入-80 ℃冰箱凍存。

1.3.3 蛋白含量測定參照Bradford（1976）的方法。

1.3.4 標志酶活性檢測取質膜蛋白15～45 μg，加入到酶反應液（pH值分別為6.5、8.5、8.5）：50 mmol·L1 BTPMES，5 mmol·L1 MgSO4，50 mmol·L1 KCl，0.02% Brij 58（W/V），1 mmol·L1 （NH4）2MoO4分別加入0. 1 mmol·L1 Na3VO4，1 mmol·L1 NaN3，50 mmol·L1 KNO3，加入4 mmol·L1 ATPNa2啟動反應， 37 ℃下水浴30 min； 然后加入0.2 mL 終止液：10% SDS 混勻，2 min后再加入1 mL 顯色液：2%濃H2SO4（V /V），0.7% （NH4）2MoO4（W/V），1 mL雙蒸水，50 μL 10% L抗壞血酸（W/V）。30 ℃，水浴30 min 后在波長700 nm處比色。同等條件下，將失活膜蛋白作為空白對照，制作無機磷標準曲線，對膜蛋白酶活性進行測定。

1.3.5 磷鎢酸染色參考Roland et al（1972）的方法，稍作修改。粗膜微粒體和質膜提取液100 000×g，1 h，4 ℃離心，除去上清，4%的戊二醛溶液中0 ℃固定12 h，磷酸鉀緩沖液（pH7.8）沖洗，1%（W/V）鋨酸固定2 h，磷酸鉀緩沖液（pH7.8）再次沖洗。使用不同濃度梯度的酒精對樣品進行脫水處理，丙酮浸泡12 h。環氧樹脂包埋，45 ℃聚合24 h、60 ℃聚合24 h、70 ℃聚合8 h。Leica UC6型超薄切片機切片，使用鉛鈾與磷鎢酸對切片進行染色，并使用HT7700型透射電鏡觀察并拍照，鑒定質膜純度。

2結果與分析

2.1 篩選聚合物濃度與KCl濃度的最佳配比

2.1.1 聚合物濃度的篩選兩相體系在5 mmol.L1 KCl 濃度下，以不同濃度聚合物（5.9%、6.1%、6.3%、6.5%、6.7%，W/W）純化橡膠樹樹皮粗膜微粒體，通過獲得質膜的蛋白產率及P型H+ATPase對特異性抑制劑Na3VO4的敏感性，篩選出兩相體系的最適聚合物濃度。如圖2所示，當聚合物濃度由5.9%上升至6.7%時，質膜蛋白產率降低，而對抑制劑的敏感性升高，綜合分析表明，兩相體系純化橡膠樹樹皮質膜的最適聚合物濃度為6.4%。

2.1.2 KCl濃度的篩選選擇6.4%聚合物濃度，以不同濃度KCl （2、5、8、11、14 mmol·L1 ）對橡膠樹樹皮微粒體進行分離純化，通過獲得質膜的蛋白產率及P型H+ATPase對特異性抑制劑Na3VO4的敏感性，篩選出兩相體系的最適KCl濃度。如圖3所示，當KCl濃度由2 mmol·L1 上升到14 mmol·L1 時，質膜蛋白產率逐漸下降，對抑制劑的敏感度逐漸升高。綜合分析表明，兩相體系純化橡膠樹樹皮質膜的最適KCl濃度為5 mmol·L1 。選用6.4%（W/W）聚合物和5 mmol·L1 KCl的兩相體系純化質膜后，可以得到較高產率的橡膠樹樹皮質膜。

2.2 質膜純度的鑒定

6.4%（W/W）聚合物濃度和5 mmol·L1 KCl濃度的兩相體系3次純化粗膜微粒體提取物，對純化前后的質膜H+ATP酶活力檢測，如表1所示，通過差速離心獲得的粗膜微粒體提取液中質膜的純度僅為44.16%，而線粒體膜和葉綠體膜的污染達到了6.10%，液泡膜的污染更是達到了19.37%。通過兩相法3次純化后的質膜懸浮液質膜純度達到了78.05%，線粒體膜和葉綠體膜的污染減少到7.18%，液泡膜的污染也減至1.08%，得到了純度較高的質膜。

鉛鈾能侵染所有膜組分（質膜、細胞器膜等）使其染色， 而磷鎢酸只能特異性地侵染質膜囊泡并使其染色，通過透射電鏡直觀地觀察切片的染色程度，根據不同切片中染色膜組分的復雜程度，可以判斷出質膜純度。本研究為進一步評價提取質膜的純度，對橡膠樹樹皮粗膜微粒體和純化后的質膜分別進行染色及電鏡觀察，磷鎢酸染色檢測質膜純度結果如圖4所示，A1、B1為粗膜微粒體提取物，由鉛鈾染色可以看出其組分比較復雜，存在著大量的細胞器膜污染，磷鎢酸染色能夠觀察到，只有少量著色質膜囊泡，說明粗膜微粒體提取物中的質膜囊泡含量較少。A2、B2為質膜提取物，其膜組分比較單一，大部分囊泡能被磷鎢酸侵染并染色，且囊泡分布較均一，大小較一致，表明此方法提取的質膜純度較高。

3討論

目前對橡膠樹樹皮質膜的提取方法鮮有報道，本研究取一年生芽接無性系橡膠樹‘熱研73397’樹皮，通過聚合物濃度為6.4%（W/W），KCl濃度5 mmol·L1 的兩相體系的純化，能提取得到純度及產率均較高的質膜。同為落葉喬木的桑樹，選用聚合物濃度為5.6%（W/W），KCl濃度為30 mmol·L1 的兩相體系對樹皮質膜純化，可獲得純度和產率都較高的質膜（Yoshida，1984），即不同植物的相同部位，其質膜提取的條件可能存在較大差異。而同一植物的不同部位，由于質膜類型不同，其分離純化質膜的所適宜的兩相體系也有所不同（王建華等，1994），如玉米幼苗葉片生長部位（胡章立和荊家海，1998）、玉米精細胞（徐恒平和曹宗巽，1997； 張一洪等，1995）等的提取方法，因此針對不同植物，或者相同植物的不同部位，需要針對性地建立合適的分離純化體系，從而獲得較高純度和產率的質膜。

常用的質膜純度檢測方法有酶活性測定法，電鏡觀察法，免疫印跡法等，由于質膜提取過程容易被其他內膜系統（ 如液泡膜、內質網膜和高爾基體膜等）污染。通常采用2 種或2種以上的檢測方法評價質膜的純度。酶活性測定法結合電鏡觀察法是一種較為常用的質膜純度檢測方法，該方法已被用于南極紅酵母（劉均玲等，2008）、水稻葉片（何磊等，2012）、地被菊葉片（沈漫，2004）等質膜純度的檢測。酶活性檢測法利用不同抑制劑能夠專一性地抑制不同囊泡上的標志酶這一特性，對不同囊膜上的標志酶活性進行檢測，并計算出提取的質膜純度和其他細胞器囊膜的污染程度。電鏡觀察法是形態學上檢測質膜純度的強有力手段，可直接觀察膜結構，檢測膜組分的復雜程度。本研究結果表明兩相體系純化3次的質膜，其質膜標準酶H+ATPase對Na3VO4敏感性很高，而對KNO3、NaN3的敏感性很低，說明該提取物中的質膜純度較高，其他細胞器囊膜較少。同時電鏡觀察法表明質膜膜組分較均一，其他膜組分污染較少，質膜純度較高。

橡膠樹樹皮質膜H+ATPase在橡膠樹的生命過程中發揮著重要的調節作用，本研究通過對兩相體系中聚合物濃度和KCl濃度進行篩選，確立了橡膠樹樹皮質膜分離純化的方法，為橡膠樹樹皮質膜特性及質膜H+ATPase功能的后續研究奠定了基礎。

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