白及果實形態與種子結實率相關性研究

摘要： 該研究以果實大小有明顯差異的26個白及果序共87枚果實為材料，分析了果實形態（包括果實重量、長度及直徑）與種子結實率的相關性。結果表明：果實重量與結實率的相關性最為密切，相關系數為0.786，達到中等正相關；其次是果實直徑，相關系數為0.634；最后是果實長度，相關系數為0.553。對10枚果實及種胚大小測量結果顯示，果實形態與種胚大小相關性為弱相關，不同果實種胚大小相差較大，種胚直徑和種胚長度平均分別為177.9 μm和359.0 μm，最大分別為241.9 μm和528.6 μm，最小分別為64.5 μm和114.3 μm；單粒白及種子平均重3.90 μg，87枚果實中，單枚果實平均種子數量為10 436粒，最大為39 488粒。該研究結果表明果實重量及飽滿程度（直徑），可以作為評價白及果實質量（種子結實率）的參考指標。

關鍵詞： 白及， 果實形態， 結實率， 種子， 種胚

中圖分類號： Q945

文獻標識碼： A

文章編號： 10003142（2017）03039406

Abstract： Bletilla striata is a perennial herb belonging to the family Orchidaceae， has been used as Chinese folk medicine. Seed quality is key to get large number of B. striata seedlings， and the seed setting rate is a very important standard to evaluate the fruit quality. It is a quick method to rough evaluate seed setting rate through the fruit form. In this study， the correlation between fruit form （fruit weight， length and diameter） and seed setting rates among 26 infructescences （87 fruits） of B. striatawere analysed， the seed embryo sizes of ten different sizes of B. striata fruits were measured， and the weights of 400 seeds were calculated and the weights of single seed were obtained. The results showed that correlation between fruit weight and seed setting rate were the most close， the coefficient of correlation was 0.786， reaching to moderate degree； the second close was fruit diameter ， the coefficient of correlation was 0.634； and the last was fruit length， the coefficient of correlation was 0.553； the average setting rate of 87 fruits was 50.43%. The correlation between fruit form and seed embryo size was at a low degree， developmental state of seed embryo could not be known through the fruit form； the average diameter of embryo was 177.9 μm， the biggest was 241.9 μm， the smallest was just 64.5 μm； and the average length of embryo was 359.0 μm， the biggest was 528.6 μm， the smallest was just 114.3 μm， the results showed that the mature seed embryo size of B. striata mainly focus on 150-200 μm in diameter， the ratio was 62.34% in this range， and 300-400 μm in length， the ratio was 68% in this range. The average weight of single seed was 3.90 μg， the seeds in the biggest fruit of the 87 was 39 488， and the average number was 10 436， according to calculation， the average number of have embryo seeds in a single fruit was 5 263， it could gain a large number of B. striata seedlings through the sterile culture. In conclusion， fruit weight and full degrees （diameter） can be used to evaluate fruit quality （seed setting rate） of B. striata.

Key words： Bletilla striata， fruit form， seed setting rate， seed， seed embryo

白及（Bletilla striata） 系蘭科白及屬多年生陸生型草本，本屬約6種，中國有4種，陜南地區分布3種（中國植物志，1999），白及不僅觀賞價值較高，亦是常用中藥之一，其作用為收斂止血，消腫生肌，用于咯血吐血，外傷出血等（中華人民共和國藥典，2015）。白及也是我國現代醫藥工業（任華忠等，2009）和化妝品工業（劉光斌等，2005）的重要原材料。近年來，白及的臨床應用擴大，需求急劇增加，但自然繁殖較難和野生生境破壞及過度采挖，導致野生白及資源急劇減少（張亦誠，2007）。目前，白及的大規模生產主要通過分割假鱗莖進行無性繁殖，這種方式繁殖系數較低且容易積累病害，不能滿足當前的生產需求，而基于白及種子的實生苗繁殖體系可以提供大量健康白及種苗（牛俊峰和王喆之，2016）。白及種子是大量獲得白及種苗的前提，因此對于白及種子質量狀態需要給予一定關注（張智慧等，2016）。

植物通過有性生殖形成種子過程中受到多種因素影響，主要包括花粉限制、胚珠限制及母株營養源的限制（Harder Barrett， 2007）。其中，蘭科植物的傳粉方式及土壤施肥情況與結實率的研究較多，Gale（2007）、 Lehnebach Riveros （2003）、Peter Johnson （2009）、Neiland Wilcock （1999）分別對日本芋蘭（Nervilia nipponica）、智利蘭花（Chloraea lamellate）、蘭科植物Acrolophia cochlearis、非蘭科異種植物的傳粉方式與結實率間的關系進行了研究；Ilves et al（2015）對Orchis militaris新建和原有種群間的結實率差異進行了探究；Gijbels et al（2015）研究了土壤施肥對蘭科植物Gymnadenia conopsea座果率及種子的影響。目前，張燕等（2009），Kiyohara et al（2012），Jitsopakul et al（2008）對白及種子形態及結實情況有一些觀察研究，但尚未見到對白及果實形態與結實率相關性的研究報道。

蘭科植物種子非常小，同種蘭科植物種子種胚大小存在差異。Ren et al（2014）、Jersáková et al（2006）分別研究了稀有蘭科植物Calanthe yaoshanensis及Disa pulchra的種胚發育影響因素。張燕等（2009）、 Kiyohara et al（2012）、Arditti Ghani（2000）分別對白及種子種胚大小進行了報道，但結果差異較大。本研究以不同果序白及果實為研究材料，分析了果實形態與種子結實率（即具胚種子與種子總數的比率）之間的相關性；另外，對不同大小果實與種胚大小關系及單粒種子重量進行了測量分析。通過對不同果實形態與種子結實率的關系研究，旨在解決白及實生種苗生產中關鍵之一——果實結實率及種子質量評判的參考指標問題。

1材料與方法

1.1 材料

本研究所用白及果實采自陜西省漢中市留壩縣地理坐標為33°37.516′ N，106°54.958′ E，海拔為（972.2 ± 6.2）m。以果序為單位進行采摘，置于陰涼通風處自然干燥，待用。

1.2 方法

1.2.1 白及果實形態測量與結實率計算選取果實大小有明顯差異的果序26個，果實共87枚，對果序上果實從頂部到基部依次編號；測量每個果實的長度與直徑，分別稱量果實、果皮及種子總重量。單個果實縱切后抖出種子，混合均勻，在顯微鏡視野中隨機選取30粒種子觀察統計具胚種子數量，重復3次。計算結實率： 具胚種子數/30 × 100%。

1.2.2 白及種胚大小測量挑選外形差異較大的白及果實10枚，測量每個果實長度與直徑。果實縱切后剝出種子，混勻后取適量置0.1%的TTC溶液中，30 ℃下染色24 h后，每個果實隨機選取至少30粒種子，在顯微鏡下測量種胚大小（圖1）。

1.2.3 白及種子重量測量將種子浸泡2 d后，在顯微鏡下進行白及種子計數，有無種胚均計入總數，每400粒種子為一組，置于鋁箔紙上，陰干后用FA2004N型電子天平稱重，重復10次。

單粒白及種子重量=（W鋁箔 + 種子-W鋁箔）/400。

1.2.4 數據處理使用Spss 21.0進行數據分析。

2結果與分析

2.1 白及果實形態與結實率關系

對26個果序的87枚果實形態及種子結實率測量、計算結果如表1，對白及果實形態與結實率相關性分析結果見表2。

表1說明不同果序單個果實的果實重量、種子重量、果實形態及結實率之間存在較大差異。表2顯示，果實重量與結實率的相關系數最高，達到0.786，二者的相關性最為密切，達到中等正相關，說明果實越重，結實率越高；其次是果實直徑與結實率的相關性，相關系數為0.634，即果實越粗壯，果實相對飽滿，結實率越高；最后是果實長度與結實率的相關性，相關系數為0.553。單粒果實種子總重量與果實重量之間相關系數為0.970，達到強相關性，對單個果實來說，果實越重，其種子也越重，種子數量也越多；單粒果實種子總重量與結實率的相關系數也最高，達到0.786，即單粒果實種子越重，果實所含有胚種子越多，結實率越高。

另外，白及果實中果皮重占果實重量的68.91%；而在一個果序中，大小果實出現的順序沒有規律。

2.2 白及果實形態與種胚大小關系

10枚果實形態與種胚大小測量結果如表3所示。

分析表3可知，白及果實形態與種胚大小間的相關性為弱相關，不能根據果實外在形態準確判斷具胚種子種胚發育情況，但根據表1，可以對具胚種子比例做出預判；不同果實中具胚種子種胚大小不一，種胚之間發育差異較大，300粒種子種胚直徑平均為177.9 μm，最大達241.9 μm，最小僅為64.5 μm，差值達3.75倍；種胚長度平均為359.0 μm，最大528.6 μm，最小僅為114.3 μm，差值高達4.62倍。不同果實的種子種胚大小變化幅度差異較大，種胚直徑RSD極差為11.19%，種胚長度RSD極差高達14.5%，種胚直徑相對長度而言，數據波動較小。對單粒白及種子，其外形如梭狀，呈中間大，兩端小，種胚長度和直徑顯示為強相關，相關系數為0.888，即種胚越長，其直徑也越大。

對300粒種子種胚大小分布情況進行統計，種胚直徑以25 μm為間隔，從50 μm到250 μm劃分8組區間，依次編組號為①～⑧；種胚長度以50 μm為間隔，從100 μm到550 μm劃分為9組區間，依次編組號為①～⑨。結果見表4和表5。

數據顯示：已成熟的不同形態白及果實中種子大小分布基本服從正態分布，即較大和較小的種子數量均較少，而中間大小的種子較多。種胚直徑主要分布在平均值附近的150～200 μm區間內，占比達62.34%；而種胚長度主要集中在平均值附近的300～400 μm區間，此區間集中了68%的種子。即成熟的白及種子種胚主要集中在長300～400 μm，直徑150～200 μm大小范圍內。

2.3 白及種子重量

測量得到400粒白及種子重（1.56±0.12） mg，通過計算得到單粒白及種子平均重3.90 μg。根據表1數據，以單枚果實種子總重平均0.040 7 g，最大0.154 0 g計算，87枚果實平均種子數量為10 436粒，最大果實種子數量為39 488粒，說明在單粒白及果實中蘊含白及種子數量極大，以結實率50.43%計，具胚種子平均達5 263粒，可做為無菌培養過程中對原球莖或無菌苗得率的參考指標。

3討論與結論

對蘭科植物種子結實情況，Ilves et al（2015）Gijbels et al（2015）、Neiland Wilcock（1999）、Proctor Harder （1994）、Proctor （1998）、Vallius（2001）等研究中都給予了關注， 包括傳粉方式、新老種群、施肥、異種花粉及花粉壽命的影響等。

白及的種子結實率也有少量報道。胡開治等（2010）在研究不同貯藏方法和時間對白及種子萌發影響時注意到，10個白及果實中成熟種子的有胚率最高為92%、最低為76%，平均（84.9±4.7）%；張燕等 （2009）報道實驗所用白及種子的有胚率為59.21%。本研究使用的白及果序是隨機挑選的，果實大小不一，對87枚果實進行測量，平均值為50.43%，最大值及最小值分別為94.44%和11.11%，均值與報道的數據相比有所偏低。

關于蘭科植物種子結實率，Proctor （1998）、Vallius（2001）和Wallace（2003）的研究表明， 在一些蘭科植物中果實重量、種子重量與其結實率存在相關性。本研究中白及果實重量和種子總重與結實率的相關系數均為0.786，達中等正相關；果實直徑與結實率之間的相關性稍弱，相關系數為0.634。說明白及果實重量及果實的飽滿程度（直徑）可以作為評價結實率的指標，果實越重、越飽滿，結實率越高。

蘭科植物種子非常小，干種子很容易受到氣流和靜電干擾，懸在液體中的種子由于種皮中存在氣泡難以觀察種胚狀態（Proctor Harder， 1994），因此在種子形態研究中，大多是對種子及種胚的長度、寬度測量，對單粒種子重量測定相對較少。Verma et al（2014）觀察了32種蘭科植物的種子形態，測量了種子長、寬，種皮細胞數量及長度，胚的長、寬等，何明高（2010）對15種海南蘭科植物（包括4種地生蘭，11種附生蘭）種子形態進行了分析，包括種子長、寬，種胚長、寬，但都沒有測定種子重量。張燕等（2009）對白及的種子的測量結果發現，長1.20 mm， 寬0.23 mm，種胚長0.38 mm， 寬0.22 mm；Kiyohara（2012）的測量結果發現，種子長1.80 mm， 寬0.23 mm， 種胚長0.49 mm， 寬0.21 mm。Arditti Ghani （2000）匯集了許多蘭科植物種子資料，包括種子的長和寬、種胚的長和寬以及種子重量，但僅報道了白及種子的長度[（0.19±0.07） mm]，而沒有種子重量。該數據比本研究及張燕等（2009）和Kiyohara（2012） 種胚的測量值還小，存在一定差異。本研究中白及種胚大小的測量結果：種胚長359.0 μm，直徑177.9 μm，與張燕等（2009）的結果接近，且種胚大小主要集中在長300～400 μm，寬150～200 μm的區間。

蘭科植物種子被稱為“粉塵”種子（dust seeds），是蘭科植物的一個重要特征；種子長0.05～6.0 mm，直徑0.01～0.9 mm，單粒種子重約0.31～24 μg，種胚也非常小，如壇花蘭（Acanthephippium sylhetense） 0.058 × 0.042 mm （Arditti Ghani （2000）。蘭科陸生植物的種子大小長0.11～1.97 mm，直徑0.07～0.4 mm；熱帶的種類種子重量通常小于1 μg ，全北區的（holarctic）相對重些，Goodyera repens和 Cephalanthera damasonium 的重約 2 μg，Limodorum abortivum 的5.7 μg，Gymnadenia conopsea的為8 μg （Rasmussen， 1995）；白及種胚被認為是在蘭科植物中發育最好的，種胚具有734枚細胞，而Epipogium aphyllum的種胚僅8枚，Calypso bulbosa的為29枚，Dactylorhiza majalis的約200枚，由此推測白及種子重量應相對較大；而本研究的測量結果為平均3.90 μg，與文獻比較，居中間位置；張智慧等（2016）對白及種子重量測量結果為6.4～13.5 μg，較本研究的結果偏大。導致原因可能是文獻報道的有些是對剛剛收獲的新鮮種子的測量，有些種子則是處于不同脫水程度的儲藏狀態（Rasmussen， 1995）。

參考文獻：

ARDITTI J， GHANI AKA，2000. Numerical and physical properties of orchid seeds and their biological implications [J]. New Phytol， 145：367-421.

CHINESE PHARMACOPOEIA COMMISSION， 2010. Pharmacopeia of the people’s Republic of China：1st Part [S]. Beijing： China Medical Science Press： 95. [國家藥典委員會， 2015. 中華人民共和國藥典：一部 [S]. 北京：中國醫藥科技出版社： 95.]

FLORA OF CHINA EDITORIAL BOARD OF CHINESE ACADEMY OF SCIENCES， 1999. Flora of China（Vol. 18） [M]. Beijing： Science Press： 46-51. [中國科學院中國植物志編輯委員會， 1999. 中國植物志 （第十八卷） [M]. 北京：科學出版社： 46-51.]

GALE S， 2007. Autogamous seed set in a critically endangered orchid in Japan： pollination studies for the conservation of Nervilia nipponica [J]. Plant Syst Evol， 268（1）：59-73.

GIJBELS P， CEULEMANS T， ENDE WVD， et al， 2015. Experimental fertilization increases amino acid content in floral nectar， fruit set and degree of selfing in the orchid Gymnadenia conopsea [J]. Oecologia，179（3）： 785-795.

HARDER LD，BARRETT SCH， 2007. Ecology and evolution of flowers [M]. Oxford： Oxford University Press.

HE MG， 2010. Preliminary study on seed biology of orchid in Hainan [D]. Haikou： Hainan University： 16-23. [何明高， 2010. 海南蘭科植物種子生物學初步研究 [D]. 海口：海南大學： 16-23.]

HU KZ， LIU J， XIAO B，et al， 2010. Effect of different storage methods and time on seed germination of Bletilla striata [J]. J Chin Med Mat， 33（1）： 7-10. [胡開治，劉杰，肖波，等， 2010.不同貯藏方法及貯藏時間對白及種子萌發的影響 [J]. 中藥材，33（1）： 7-10.]

ILVES A， METSARE M， TALI K， et al， 2015. The impact of recent colonization on the genetic diversity and finescale genetic structure in Orchis militaris （L.） [J]. Plant Syst Evol，301（7）： 1875-1886.

JERSKOV J， JOHNSON SD， 2006. Lack of floral nectar reduces selfpollination in a flypollinated orchid [J]. Oecologia， 147（1）： 60-68.

JITSOPAKUL N， THAMMASIRI K， ISHIKAWA K， 2008. Cryopreservation of Bletilla striata mature seeds， 3day germinating seeds and protocorms by dropletvitrification [J]. Cryoletters，29（6）： 517-526.

KIYOHARA S， FUKUNAGA H， SAWA S， 2012. Characteristics of the falling speed of Japanese orchid seeds [J]. Int J Biol Biotechnol， 4（3）： 10-12.

LEHNEBACH C， RIVEROS M， 2003. Pollination biology of the Chilean endemic orchid Chloraea lamellate [J]. Biodivers Conserv， 12（8）： 1741-1751.

LIU GB， HUANG Z， HUANG CG，et al， 2005. Functions and application in cosmetics of Bletilla striata （thunb） reichb. f [J]. Det Cosm， 28（8）：22-24. [劉光斌，黃忠，黃長干，等， 2005.天然植物白芨膠的功能及在化妝品中的應用 [J].日用化學品科學， 28（8）： 22-24.]

NEILAND MRM， WILCOCK CC， 1999. The presence of heterospecific pollen on stigmas of nectariferous and nectarless orchids and its consequences for their reproductive success [J]. Protoplasma， 208（1）： 65-75 .

NIU JF， WANG ZZ， 2016. The new direct seeding and breeding method of Bletilla striata [J]. J Shaanxi Norm Univ （Nat Sci Ed）， 44（4）： 83-86. [牛俊峰，王喆之， 2016.白及種子直播繁育新方法 [J]. 陜西師范大學學報（自然科學版）， 44（4）： 83-86.]

PETER CI， JOHNSON S，2009. Reproductive biology of Acrolophia cochlearis （Orchidaceae）： estimating rates of crosspollination in epidendroid orchids [J]. Ann Bot， 104（3）： 573-581.

PROCTOR HC， HARDER LD，1994. Pollen load， capsule weight， and seed production in three orchid species [J]. Can J Bot， 72： 249-255.

PROCTOR HC， 1998. Effect of pollen age on fruit set， fruit weight， and seed set in three orchid species [J]. Can J Bot，76： 420-427.

RASMUSSEN HN， 1995. Terrestrial orchids： from seed to mycotrophic plant [M]. Cambridge： Cambridge University Press.

REN HZ， HE YM， YANG L，2009. Chemical composition and pharmacological activity research progress of Bletilla striata [J]. AsiaPacific Trad Med， 5（2）： 134-140. [任華忠，何毓敏，楊麗.白及化學成分其藥理活性研究進展 [J].亞太傳統醫藥， 2009， 5（2）： 134-140.]

REN ZX， WANG H， BERNHARDT P， et al， 2014. Which foodmimic floral traits and environmental factors influence fecundity in a rare orchid， Calanthe yaoshanensis？ [J]. Bot J Linn Soc， 176（3）： 421-433.

VALLIUS E， 2001. Factors affecting fruit and seed production in Dactylorhiza maculata （Orchidaceae） [J]. Bot J Linn Soc， 135（2）： 89-95.

VERMA J， SHARMA K， THAKUR K， et al， 2014. Study on seed morphometry of some threatened Western Himalayan orchids [J]. Turk J Bot， 38（2）： 234-251.

WALLACE LE， 2003. The cost of inbreeding in Platanthera leucophaea （Orchidaceae） [J]. Amer J Bot， 90（2）： 235-242.

ZHANG Y， LI B， LI SF， 2009. Seed germination and seeding morphogenesis of Bletilla striata under the different culture medium [J]. Acta Bot BorealOccident Sin， 29（8）： 1584-1589. [張燕，黎斌，李思鋒， 2009. 不同培養基上白芨的種子萌發與幼苗形態發生 [J]. 西北植物學報，29（8）：1584-1589.]

ZHANG YC， 2007. Biological characteristics and cultivation techniques of Bletilla striata [J]. Agric SciTechnol Inf（10）： 45. [張亦誠， 2007. 白芨的生物特性及栽培技術 [J]. 農業科技與信息（10）： 45.]

ZHANG ZH， LIU DH， ZHU XY，et al， 2016. Testing methods for seed quality of Bletilla striata [J]. Chin J Chin Mat Med， 41（11）： 2044-2048. [張智慧，劉大會，朱新焰，等， 2016. 白及種子質量檢驗方法研究 [J]. 中國中藥雜志， 41（11）： 2044-2048.]

ZHOU T， JIANG WK， LI L，et al， 2010. Resources and evaluation of market use to wild hyacinth bletilla in Guizhou Province [J]. J Guiyang Coll Trad Chin Med， 32（6）： 28-30. [周濤， 江維克， 李玲等， 2010. 貴州野生白及資源調查和市場利用評價 [J]. 貴陽中醫學院學報，32（6）： 28-30.]