化瘀通絡灸法對VD大鼠血管內皮細胞增殖遷移變化的影響

張曼,楊駿,王萍,王頻

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化瘀通絡灸法對VD大鼠血管內皮細胞增殖遷移變化的影響

張曼1,楊駿1,王萍2,王頻1

(1.安徽中醫藥大學,合肥 230038;2.安徽中醫藥大學第一附屬醫院,合肥 230038)

目的 體外研究觀察化瘀通絡灸法治療后,大鼠血清的效應物質干預血管內皮細胞增值、遷移變化的過程,探討化瘀通絡灸法治療血管性癡呆可能的促血管生成機制。方法 選取Wistar 雄性成年大鼠,采用四血管阻斷法(4-VO)制備血管性癡呆的大鼠模型,隨機分為艾灸組、西藥組、模型組,并設假模型組對照,共4組。艾灸組取百會隔附子餅灸,大椎、神庭穴懸灸治療,西藥組以茴拉西坦灌胃,15 d為1個療程,均為2個療程。每個療程結束后,艾灸組、假模型組、模型組大鼠眼眶取血。制備化瘀通絡灸法治療后的動物血清,干預人臍靜脈內皮細胞(HUVEC-12)培養過程,另設平行液組,配制含10%胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培養液。四甲基唑鹽比色法(MTT法)檢測內皮細胞的增殖,細胞劃痕標記法檢測內皮細胞的遷移。結果 2個療程治療結束后,通過MTT法檢測血管內皮細胞增殖,與模型血清組、假模型血清組、平行液組比較,艾灸血清組大鼠血清干預人臍靜脈內皮細胞(HUVEC-12)增殖明顯(＜0.01)。2個療程治療結束后,通過細胞劃痕法檢測血管內皮細胞遷移,24 h后與模型血清組、假模型血清組、平行液組比較,艾灸血清組大鼠血清干預HUVEC-12的遷移率升高明顯(＜0.01)。結論 化瘀通絡灸法在改善血管性癡呆大鼠血管內皮細胞增殖、遷移方面的效果明顯,從而獲取了化瘀通絡灸法體外促“血管生成”的有力證據。

癡呆,血管性;內皮細胞;細胞增殖;細胞遷移;血管生成;大鼠;藥餅灸療法;艾條灸;針灸血清

血管性癡呆(vascular dementia,VD)首先由Marie與Binswanger提出,其統一命名是在1992年WHO頒布的《ICD-10精神及行動障礙分類》中。VD是由腦血管疾病導致的認知功能障礙臨床綜合征,主要表現為高級神經活動的智能障礙,特別是認知功能障礙,包括學習、記憶、思維等障礙,也有失語、失用、失認等神經心理學癥狀及體征。VD多有卒中史,常表現波動性病程或階梯式惡化。Craft等研究發現,VD年發生率約3.8%,65歲以上人群中,癡呆的總患病率為8%,其中VD占13%～19%。有研究認為該病的發生與丘腦、海馬[1]的缺血性改變有關[2]。同時有國外學者[3]認為,治療缺血性疾病,應當盡快恢復缺血區血供,挽救瀕臨死亡的神經膠質細胞、血管內皮細胞、神經元,促血管生成,因此刺激干預促腦內毛細血管生成將成為新的臨床治療方法。本研究通過動物實驗的方法,觀察化瘀通絡灸法對VD大鼠海馬血管內皮細胞增殖、遷移變化的影響,探討化瘀通絡灸法治療血管性癡呆的可能的 “促血管生成”機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與藥物

特制的清艾條,規格為10 mm×100 mm,由安徽省天長市壽民灸具廠生產;附子粉由安徽省中醫院中草藥房提供;茴拉西坦膠囊[Aniracetam Capsule,化學名為1-(4-甲氧基苯酰基)-2-吡咯烷酮]0.1 g×30片/瓶,無錫市凱西藥業有限公司生產(批號20090112);水合氯醛由上海國際集團生產(批號20080807); PRMI-1640培養液由GIBCO公司生產(批號981972/ 11875-093);3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽-二苯基四氮唑溴鹽溶液(MTT)由Sigma公司生產(批號為M2128,TGL-20M);二甲基亞砜(DMSO)由Sigma公司生產(批號20110303661/D5879);高速臺式冷凍離心機由長沙湘儀離心機儀器有限公司生產;DTT-2大鼠跳臺儀由北京中國中醫科學院提供。

1.2 實驗動物與分組

SPF級成年雄性Wistar大鼠60只,10月齡,體重(250±50)g,由南京醫科大學實驗動物中心提供,其許可證號為SCXK(蘇)2008-0004。用跳臺實驗對動物進行篩選,保留48只,然后電腦隨機數字表法產生8只作為假模型組,其余大鼠復制血管性癡呆動物模型,模型復制后4 d用跳臺實驗和神經行為學評分再次篩選出合格癡呆大鼠24只,隨機分為艾灸組、西藥組、模型組,每組8只。

1.3 造模方法及模型檢測

采用改良的Pulsinelli’s四血管阻斷動物模型(4-VO)[4],將大鼠用10%水合氯醛(350 mg/kg),腹腔注射麻醉后俯臥位固定,然后常規消毒,首先進行背側頸正中部位切口,暴露出雙側第一頸椎橫突的翼小孔,用直徑0.5 mm的電凝針插入燒灼雙側椎動脈,使其永久性閉塞。次日將大鼠仰臥位固定,保持其呼吸通暢,然后腹側頸正中切口,分離雙側頸總動脈,用無創性動脈夾,可逆性夾閉雙側頸總動脈(CCA)10 min,共夾閉3次,每次間隔10 min。術后手術部位施以適量青霉素抗感染,然后縫合常規飼養觀察。假模型組的處理方法與模型組相同,但不阻斷頸總動脈(本實驗對大鼠有損傷性的操作,得到了相關部門的許可,符合動物研究倫理)。采用跳臺實驗檢測大鼠的學習記憶成績,訓練及測試時將2只大鼠同時分別置于2個隔間內,適應3 min后通以40 V的交流電,持續 5 min,開始測試時將大鼠放在測試箱的平臺上,并開始計時,潛伏期為大 鼠第一次跳到銅柵上所需時間,錯誤次數計算是5 min內從跳下銅柵再跳回平臺上的次數,潛伏期和錯誤次數評價學習成績,并進行神經行為學的評分。

1.4 治療方法

艾灸組大鼠固定于自制鼠板上,特制的大鼠頭部固定器固定大鼠頭部,選取百會、大椎、神庭穴剃毛點記,百會穴隔物灸,穴位上放置制備的直徑約15 mm、厚約5 mm附子餅,點燃特制的清艾條,灸火直接灸在附子餅上,穴位皮膚局部出現灼熱潮紅時立即提起,過后再壓灸,反復灸20 min,不出現燙傷;大椎穴、神庭穴于施灸法當天脫毛后用清艾條懸灸20 min。每天1次,15次為1個療程,共治療2個療程,療程之間休息1 d,常規飼養。西藥組采用茴拉西坦灌胃治療,灌胃劑量為0.0625 mg/g,和蒸餾水混合成0.01 g/mL濃度的溶液,每天1次,療程與艾灸組同。假模型組和模型組與灸法治療組平行,只作鼠板上固定而不作其他任何處理。

1.5 神經行為學評分

初次神經行為學評分在模型復制后4 d進行,評分標準按Longa EZ等[5]制定的6級評分法改進,0分為無功能障礙;1分為不能伸展前肢;2分為向一側旋轉;3分為向一側傾倒;4分為無自主活動伴意識抑制; 5分即死亡。

1.6 血清制備

艾灸血清組把艾灸組大鼠于每個療程結束后1 h,進行目內眥處取血,每只2mL,離心15 min (3000 r/min),取上層的血清,同組血清混合,56℃、30 min滅活,經0.22mm微孔濾膜過濾除菌,﹣20℃保存備用;假模型血清組和模型血清組血清制備方法與艾灸血清組相同;時間上與之平行。

1.7 人臍靜脈內皮細胞株(HUVEC-12)培養和血清干預

將凍于液氮中的HUVEC-12細胞株迅速取出,置于40℃溫水中不停搖晃,使其迅速溶解;待溶解后移至凈化臺內,用移液槍移至離心管內,加入含10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)及5%100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素(雙抗液)的RPMI-1640的培養基將其稀釋5倍,混勻離心1000 r/min,離心5 min,棄上清液,加入完全培養液(PRMI-1640＋10%胎牛血清＋5%雙抗)反復吹打,使其混勻,移至培養瓶中,加入2 mL培養液,置于5%CO2、37℃飽和濕度培養箱培養,待其長至80%融合狀態時以0.25%胰酶溶液消化傳代。每2～3 d更換培養液或傳代1次,取對數期(細胞貼壁,胞漿延展)生長的細胞用于實驗。根據干預血清不同,將實驗的HUVEC-12細胞株分為4組,分組及培養液中血清添加如下,艾灸血清組,配制含10%化瘀通絡灸法大鼠血清的RPMI-1640;模型血清組,配制含10%模型組大鼠血清的RPMI-1640;假模型血清組,配制含10%假造模大鼠血清的RPMI-1640;平行液組,配制含10%胎牛血清(FBS)的RPMI-1640。

1.8 四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT法)檢測HUVEC-12的增殖

取對數生長期的HUVEC-12,按2×104接種于96孔板,正常培養24 h后棄去培養液,換上只含有0.5% FBS的細胞培養液預處理24 h以達到細胞同步化;24 h后棄去該細胞培養液,實驗按分組更換各組培養液,每組設6個復孔,繼續培養20 h后,每孔加入20mL MTT溶液(5 mg/mL),于5%CO2、37℃飽和濕度培養箱繼續培養4 h后,吸棄孔內上清液,后加入二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,)溶液150mL,震蕩10 min,在490 nm波長下用全自動酶標儀測定各孔的光密度值(OD)并記錄結果。

1.9 細胞劃痕法檢測HUVEC-12的遷移

取對數生長期的HUVEC-12,以6×104接種于24孔板,每孔400mL。孔板底部預先畫好標記線,置于37℃、5% CO2培養箱中培養48 h,待細胞間形成較緊密連接的單層后,用無菌200mL,槍頭在培養孔底部中央垂直劃一道痕跡(顯微鏡下可同時看到創面兩側),然后吸出原培養液后用磷酸鹽緩沖液(PBS)輕輕吹打劃痕附近,倒除培養液,反復3次,將劃掉的細胞沖洗干凈。然后按分組各孔加入對應培養液400mL,每組設6個復孔。此時在倒置顯微鏡下攝像(×200),記為0時,然后利用顯微尺度選擇5個不同視野,分別觀察0 h、6 h、24 h后的劃痕創面愈合情況。細胞遷移能力以遷移率表示,細胞遷移率(%)=[(原劃痕寬度－現劃痕寬度)/原劃痕寬度]×100%。

1.10 統計學方法

采用SPSS13.0統計軟件處理數據,所有結果采用均數±標準差表示,方差齊性檢驗后進行單因素方差分析,組間均數的兩兩比較采用-檢驗。以＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 造模后4 d跳臺實驗檢測及神經行為學檢測結果

造模后4 d跳臺儀檢測大鼠的潛伏期、錯誤次數并進行神經行為學評分結果見表1。造模組與假造模組的潛伏期、錯誤次數及神經行為學評分比較均有顯著性差異(＜0.01),表明VD大鼠模型制作成功。

表1 造模后4 d潛伏期、錯誤次數及神經行為學評分檢測結果 (±s)

表1 造模后4 d潛伏期、錯誤次數及神經行為學評分檢測結果 (±s)

組別n潛伏期(s)錯誤次數(次)神經行為學評分(分) 造模組2442.62±9.581)5.4±1.231)2.45±0.761) 假模型組8226.00±43.561.02±0.43-

注:與假模型組比較1)＜0.01

2.2 艾灸效應血清對HUVEC-12細胞增殖影響

經過2個療程治療后,艾灸血清組與模型血清組、假模型血清組、平行液組的細胞增殖比較差異有統計學意義(＜0.01),詳見表2。表明經過2個療程治療后,在增加細胞增殖水平方面,艾灸組有非常顯著的效果。由圖1可見,艾灸血清組培養的HUVEC增殖能力最強。

表2 細胞增殖的檢測結果比較 (±s)

表2 細胞增殖的檢測結果比較 (±s)

組別n光密度值(OD) 艾灸血清組60.191±0.0241)3)4) 假模型血清組60.159±0.0062) 模型血清組60.170±0.0065) 平行液組60.161±0.0172)

注:與模型血清組比較1)＜0.01,2)＜0.05;與平行液組比較3)＜0.01;與假模型血清組比較4)＜0.01,5)＜0.05

注:1為艾灸血清組,2為假模型血清組,3為模型血清組,4為平行液組

2.3 艾灸效應血清對HUVEC-12細胞遷移影響

經過2個療程治療后,4組間的細胞遷移的檢測結果有差異(＜0.05,＜0.01),見表3。0 h各組遷移率沒有明顯差異(＞0.05);6 h后艾灸血清組與模型血清組、假模型血清組、平行液組的細胞遷移比較差異有統計學意義(＜0.05);24 h后艾灸血清組與模型血清組、假模型血清組、平行液組的細胞遷移比較差異有顯著統計學意義(＜0.01)。表明經過2個療程治療后,在加快細胞遷移水平方面,艾灸血清組有非常顯著的效果。

倒置顯微鏡(×200)下攝像圖片(5～16)顯示艾灸動物血清培養的HUVEC遷移能力最強。詳見圖2。

表3 各組細胞遷移的檢測結果 (±s)

表3 各組細胞遷移的檢測結果 (±s)

組別n0 h遷移率(%)6 h后遷移率(%)24 h后遷移率(%) 艾灸血清組6049.723±2.3182)4)6)88.689±3.2191)3)5) 假模型血清組6037.950±1.72)52.655±1.6132) 模型血清組6048.443±1.566)61.929±2.2346) 平行液組6038.29±1.4092)55.355±1.6742)

注:與模型血清組比較1)＜0.01,2)＜0.05;與平行液組比較3)＜0.01,4)＜0.05;與假模型血清組比較5)＜0.01,6)＜0.05

注:5～7為艾灸血清組0 h、6 h后、24 h后干預培養的HUVEC遷移表現;8～10為假模型血清組0 h、6 h后、24 h后干預培養的HUVEC遷移表現;11～13為模型血清組0 h、6 h后、24 h后干預培養的HUVEC遷移表現;14～16為平行液組0 h、6 h后、24 h后干預培養的HUVEC遷移表現

3 討論

《靈樞·海論》提出“腦為髓之海……髓海不足,則腦轉耳鳴,脛酸眩冒……”清代王清任亦指出年老而記性較差者,其腦髓逐漸空虛。《金匱要略·中風歷節病脈證并治》:“……邪入于腑,即不識人。”趙冰等[6]總結“謝海州治療老年性癡呆癥經驗”時指出,血管性癡呆癥的病因、病機比較復雜,由于年老體弱,飲食失節,情志失調,歷經艱辛,勞逸不當,導致臟腑功能衰退,氣血不足,尤其是腎經虧損,髓海失養,腦髓失充,神明失司,代謝失調,而致風、火、痰、瘀蒙蔽心竅,上犯與腦,清竅失靈,神明失用,故其病在腦,其本在腎。《任繼學經驗集》中關于血管性癡呆這樣說:臨證當抓住虛實綱領,以“大實有羸狀,至虛有盛候”為辨證要點。認為實者,以痰、瘀、毒、涎為主,而虛者則以精、髓、神、氣為要。

我們課題組前期在取得了艾灸治療VD豐富的臨床經驗和實驗研究成果的基礎上[7-12],發現以頭部穴位組合為主的艾條壓灸治療VD具有“化瘀通絡”之功效,我們臨床運用化瘀通絡灸法治療VD取得了很好的療效,并在前期研究中發現針刺涌泉、中沖穴可顯著改善VD大鼠的學習記憶成績,縮短P300的潛伏期,升高波幅[13],為該實驗的研究做了準備。

本實驗采用四血管閉塞法建立VD模型,大鼠腦組織可產生明顯的病理改變,皮層、丘腦、尾核、海馬等記憶區嚴重受損使Papez環路中段,但死亡率低,無明顯肢體運動障礙[14]。此外,本研究培養的血管內皮細胞呈單層貼壁生長,細胞形態單一,呈棱形或多角形,核橢圓居中,互不重疊。在低倍鏡下呈鵝卵石樣排列,易于與平滑肌細胞、纖維細胞區別;本研究中劃痕標記法,成本低、實驗周期短、不需要特殊儀器設備,并且可以適用于各種培養細胞。體外培養人臍靜脈內皮細胞株(HUVEC-12)是研究血管生成的一種直觀有效方法。艾灸治療VD在研究中[15]療效已被驗證[16-18],通過艾灸治療后的動物血清干預HUVEC-12的體外培養研究,可以直觀地分析艾灸后血清的效應物質對血管內皮細胞活化、增殖、遷移變化的影響[19]。

血管生成,即通過細胞增殖、出芽的方式形成新的血管網的過程[20],是建立側支循環的一種主要方式,其過程包括內皮細胞的活化、增殖、遷移、中空的管腔形成以及已有的血管上萌發新血管等。細胞活化、增殖最重要的因子是血管內皮生長因子(VEGF),促血管內皮細胞遷移和管型形成最重要的因子是成纖維細胞生長因子(FGF)[21],本課題組在前期研究中,已經證實了化瘀通絡灸法可以有效提高VD大鼠海馬以及皮層 VEGF及其受體Flt-1、Flk-1MRNA,bFGF、BFGF-r的表達,對改善VD大鼠的癥狀有顯著的效果。本實驗通過艾灸治療后動物血清干預HUVEC-12的體外培養研究,直觀地分析艾灸后血清的效應物質對HUVEC-12活化、增殖、遷移、中空的管腔形成的影響,進一步說明血管生成對于治療VD的積極作用。模型血清組大鼠自身誘導促新生血管的生長因子表達較模型血清組增多,但是結合其他指標,癥狀沒有明顯好轉。又進一步表明了化瘀通絡灸對促血管生成的優勢所在。

老年期是經驗豐富的階段,一生中極為寶貴的時期,VD作為老年期癡呆第二位重要的疾病,正確的診斷和有效的治療至關重要。研究化瘀通絡灸法治療VD的機理,從中得到預防和治療的方法,具有重大的實際意義。

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The Effect of Stasis-eliminating and Meridian-unblocking Moxibustion on Vascular Endothelial Cell Proliferation and Migration in VD Rats

1,1,2,1.

1.230038,; 2.230038,

Objective To investigate the in vitro intervening effect of rat serum effector substances on vascular endothelial cell proliferation and migration after stasis-eliminating and meridian-unblocking moxibustion and explore the possible proangiogenic mechanism of stasis-eliminating and meridian-unblocking moxibustion treatment for vascular dementia. Method Male adult Wistar rats were used. A rat model of vascular dementia was made by four-vessel occlusion (4-VO). The rats were randomized to moxibustion, Western medication and model groups. A sham operation group was established as a control. There was a total of four groups. The moxibustion group received aconite cake moxibustion on point Baihui(GV20) and suspended moxibustion on points Dazhui(GV14) and Shenting(GV24) and the Western medication, an oral gavage of aniracetam tablets. Treatment was given 15 days as one course for a total of two courses. Blood was taken from the Orbital cavity in the moxibustion, sham operation and model groups after each course of treatment. After stasis-eliminating and meridian-unblocking moxibustion, animal serum was prepared to intervene in human umbilical vein endothelial cell (HUVEC-12) culture. Another parallel liquid group was set up. RPMI-1640 culture medium containing 10% fetal bovine serum (FBS) was prepared. Endothelial cell proliferation was examined by methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) colorimetric assay. Endothelial cell migration was examined by cell scratch labeling. Result After two courses of treatment, the examination of endothelial cell proliferation by methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) colorimetric assay showed that rat serum intervened significantly in human umbilical vein endothelial cell (HUVEC-12) proliferation in the moxibustion serum group compared with the model serum, sham operation serum and parallel liquid groups (＜0.01). At 24 hrs after two courses of treatment, the examination of endothelial cell migration by cell scratch labeling showed that rat serum intervention significantly increased the HUVEC-12 migration rate in the moxibustion serum group compared with the model serum, sham operation serum and parallel liquid groups (＜0.01). Conclusion Stasis-eliminating and meridian-unblocking moxibustion has a marked improving effect on vascular endothelial cell proliferation and migration in vascular dementia rats, which provides strong evidence for its in vitro proangiogenic effect.

Dementia, vascular; Endothelial cell; Cell proliferation; Cell migration; Angiogenesis; Rats; Medicinal cake-partitioned moxibustion; Moxa stick moxibustion; Acupuncture-moxibustion serum

1005-0957(2017)04-0467-06

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2017.04.0467

2016-08-20

國家自然科學基金項目(81473785)

張曼(1988—),2014級碩士生,Email:84198813@qq.com

楊駿(1958—),男,教授,研究方向為針灸的臨床作用機理研究,Email:yangjunacup@126.com