量子點復合微球的活體熒光和化學發光雙模式成像

葉一，王國武，王莉萍，和田智之，王瑾曄

1.上海交通大學 生物醫學工程學院，上海 200240；2.日本理化學研究所 先進光子學中心，和光 埼玉 351-0198

量子點復合微球的活體熒光和化學發光雙模式成像

葉一1，王國武1，王莉萍1，和田智之2，王瑾曄1

1.上海交通大學 生物醫學工程學院，上海 200240；2.日本理化學研究所 先進光子學中心，和光 埼玉 351-0198

為了探索熒光/化學發光雙模式成像方法用于可降解生物材料研究的可行性，將載有量子點的可降解高分子微球（量子點復合微球）植入小鼠背部皮下，利用美國Caliper定量熒光和生物發光成像系統IVIS Lumina II觀察不同時間點植入部位的熒光強度和L-012介導的化學發光強度的變化。結果顯示：30 mg量子點復合微球植入28 d時，仍能檢測到熒光信號。L-012介導的化學發光強度隨時間逐漸減弱，第28 d時，量子點復合微球處仍存在微弱的化學發光。

量子點；復合微球；活體熒光成像；活性氧；化學發光

引言

量子點是一種具有納米尺寸的無機半導體熒光染料[1]，與傳統的有機熒光染料相比，量子點具有良好的光穩定性，發射波譜窄而對稱，吸收波譜較寬的特點[2]。1998年Alivisatos[3]研究小組和Nie[4]研究小組在Science上同時報道了量子點應用于細胞及組織標記成像的研究成果，因此量子點及其交聯物已被成功運用于各種成像應用，包括標記固定細胞、動態觀察活體細胞、熒光探測及活體動物成像。Jie等[5]研究CdTe/CdS/ZnS在動物皮下、尾靜脈、肌肉注射活體成像效果，其熒光量子轉化率高，動物自體熒光對量子點熒光的干擾小。

但是，由于量子點本身含有重金屬，具有一定的毒性，在生命科學領域的研究仍局限于實驗室，臨床應用尚未推廣[6-7]。因此，利用其他天然或者合成材料包裹量子點，能夠有效的增強量子點的生物相容性[8-9]。Kim等[10-11]利用透明質酸與量子點交聯形成復合物注射到小鼠背部皮下，小鼠存活超過2個月，且透明質酸-量子點復合物產生的熒光在2個月時仍然能被檢測到。

為了實現熒光和化學發光的雙模式活體成像，本研究將量子點吸附在可降解高分子微球中，然后注射到小鼠背部皮下，利用化學發光探針L-012[12]檢測小鼠體內對生物材料表面響應產生的活性氧[13]，通過定量熒光和生物發光成像系統實時同步觀測皮下熒光位置和強度變化。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

健康Balb/c小鼠 3只，清潔級，年齡6周，體重18～22 g，雌性，購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司，由上海交通大學實驗動物中心提供。水溶性量子點CdSe/ZnS QDs被MPA（3-巰基丙酸）包覆，溶解于PBS，發射波長為650 nm，水合粒徑約10～12 nm，購自蘇州星爍納米科技有限公司。L-012化學發光探針購自Wako（日本和光純藥工業株式會社）。

1.2 實驗儀器

日本OLYMPUS熒光倒置顯微鏡，型號IX-71；美國Caliper定量熒光和生物發光成像系統，型號IVIS Lumina Ⅱ。

1.3 實驗方法

1.3.1 量子點復合微球制備

將可降解高分子微球避光浸泡于5 nmol/mL 量子點溶液中，24 h 37℃恒溫吸附達飽和后，吸去量子點溶液。用無菌PBS浸泡5 min洗去未吸附量子點，反復清洗直至PBS浸泡液熒光強度穩定，得到量子點復合微球（QD/ BPM），無菌保存于4℃冰箱。

1.3.2 體外熒光與化學發光成像實驗

使用Caliper定量熒光和生物發光成像系統，在黑底 96孔板中進行體外化學發光成像預實驗。0.05 mmol/L過氧化氫溶液中加入50 mmol/L L-012溶液，對比20 nmol/mL量子點溶液加入前后的化學發光，溶液體系見表1。

表1 體外成像實驗溶液體系 (單位:μL)

1.3.3 量子點復合微球動物體內雙模式成像實驗

動物腹腔注射1%戊巴比妥鈉50 mg/kg麻醉后，在小鼠背部皮下不同位置植入300 μL PBS，10、20、30 mg量子點復合微球（10-QD/BPM，20-QD/BPM，30-QD/BPM）。

利用Caliper定量熒光和生物發光成像系統進行熒光成像，激發波波長為410 nm，發射波濾光片可接受光波長范圍為575～650 nm，成像過程中使用異氟烷進行氣體麻醉。化學發光成像前腹腔注射100 μL L-012溶液（15 mg/mL），不同時間點進行化學發光成像。

2 結果

利用熒光倒置顯微鏡可以觀察到可降解微球在吸附量子點前后的熒光變化，激發光波長為330～385 nm。在吸附量子點前，微球載體有自發熒光；吸附量子點后得到的量子點復合微球顯現出明亮的紅色熒光，見圖1。

圖1 微球熒光圖像

為了研究量子點熒光與化學發光之間可能的干擾影響，先進行了體外成像預實驗。利用定量熒光和生物發光成像系統檢測過氧化氫、L-012、量子點混合溶液的熒光和化學發光，其結果見圖2。該濃度過氧化氫對量子點的熒光強度基本無影響。過氧化氫為陽性對照，能夠誘發L-012產生化學發光。而“過氧化氫/QD/L-012”所產生的化學發光與“過氧化氫/L-012”化學發光相近。

圖2 過氧化氫/量子點/L-012的體外成像預實驗

Zhou等[12]的研究結果表明腹腔注射時間會影響L-012產生的化學發光強度。為了選擇最佳的化學發光成像時間，我們在L-012注射后的不同時間點對小鼠進行了化學發光成像，分別為10、20、30、40 min。在20～30 min時，化學發光最強（圖3），因此在腹腔注射L-012 20 min后進行小鼠化學發光成像。

圖3 L-012介導的小鼠化學發光強度與注射時間的關系

我們在不同時間點對小鼠同時進行熒光成像和化學發光成像，以此評估雙模式成像法研究微球體內降解的可行性，其結果見圖4～5。注射后第1 d，熒光強度最強，之后隨著天數增加熒光強度減弱，在第28 d時，30 mg量子點復合微球的熒光仍能被檢測到。化學發光則在材料植入當天最強，之后隨著天數增加，化學發光減弱。第28 d時，量子點復合微球處仍存在微弱的化學發光。

圖4 小鼠皮下量子點復合微球的熒光強度隨時間的變化

3 討論

本文將量子點吸附在可降解微球中得到量子點復合微球，通過熒光顯微鏡能清楚的觀察到量子點復合微球發出的紅色熒光。

圖5 L-012介導的體內化學發光強度隨時間的變化

化學發光體外實驗結果顯示，L-012能與過氧化氫溶液反應產生化學發光。加入量子點前后，其光強沒有明顯的變化。但當過氧化氫溶液濃度增高后，化學發光會顯著增強。由于 L-012產生的化學發光波長約為450 nm[14]，與量子點激發波波長范圍300～500 nm相重合，在空間距離合適的情況下（一般小于100 ?），L-012化學發光產生的能量轉移給了量子點，激發了量子點的熒光，產生了化學發光能量的共振轉移[15]，其原理與熒光能量共振轉移（Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET）相似。這一現象可能會對體內化學發光強度及熒光強度產生一定影響。

我們利用定量熒光和生物發光成像系統對植入到小鼠背部皮下的量子點復合微球進行活體熒光成像和化學發光成像。量子點發射波波長為650 nm，植入后1 d熒光達到峰值，之后熒光強度逐漸降低，可能是因為復合微球在小鼠體內隨著體液循環逐漸被降解，與此同時，量子點也從微球擴散到體液中。在第28 d時，量子點復合微球的熒光已經非常微弱，而量子點復合微球仍未完全降解。為了使熒光的檢測時間與材料降解周期匹配，可以考慮用化學交聯法將量子點共價連接在可降解微球上，以提高量子點的穩定性[16]。化學發光強度在注射當天最強，之后隨著時間的增加逐漸降低，28 d時，量子點復合微球處仍存在微弱的化學發光。分析其原因可能是由于注射時的創傷促進了活性氧產生，隨著皮膚創口愈合，活性氧減少。此外，伴隨微球的降解，活性氧的生成也會減少。

4 結論

本研究提供了一種集熒光和化學發光為一體的雙模式活體成像方法，用可降解微球負載量子點，通過熒光強度變化跟蹤復合微球的降解情況，同時結合L-012化學發光試劑檢測活性氧的產生。這個方法用較少的動物即能實現活體檢測，對雙模式活體成像應用于生物材料研究有參考意義。

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本文編輯 王博潔

Quantum Dots Composite Microspheres for In Vivo Fluorescence and Chemiluminescence Dual-Mode Imaging

YE Yi1, WANG Guo-wu1,WANG Li-ping1, WADA Satoshi2, WANG Jin-ye1
1.School of Biomedical Engineering, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China; 2.Center for Advanced Photonics, RIKEN, Saitama Wako 351-0198, Japan

To develop in vivo fluorescence and chemiluminescence dual mode imaging method for materials, quantum dots (QDs) loaded with biodegradable polymer microspheres (BPM) were subcutaneously injected into the back of mice. L-012 was employed to noninvasively monitor the product of reactive oxygen species. The fl uorescence intensity and chemiluminescence intensity were observed by Quantitative Fluorescent and Bioluminescent Imaging System IVIS Lumina II from Caliper at different time points. The results showed that the fl uorescence of 30 mg BPM/QD could be detected up to 28 d. Meanwhile, chemiluminescence intensity of the implanted microspheres induced by L-012 decreased with time. On day 28, there was still weak chemiluminescence where the microspheres were implanted.

quantum dots; composite microspheres; in vivo fluorescence imaging; reactive oxygen species; chemiluminescence

R318.08

A

10.3969/j.issn.1674-1633.2017.04.008

1674-1633(2017)04-0026-04

2017-02-10

國家自然科學基金（30470477，30870635）；科技部國家國際科技合作計劃項目（2015DFG32730）；上海市科學技術委員會國際合作重點項目（15540723900）。

王瑾曄，教授，研究方向為生物材料。

通訊作者郵箱：jinyewang@sjtu.edu.cn