自發(fā)性糖尿病長(zhǎng)爪沙鼠環(huán)氧化酶(COX)-2在三種組織中的表達(dá)

王菲菲, 龔菁菁, 霍學(xué)云, 路 靜, 郭 萌, 劉 欣, 李長(zhǎng)龍, 杜小燕, 陳振文, 呂建祎

(首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院, 北京, 100069)

自發(fā)性糖尿病長(zhǎng)爪沙鼠環(huán)氧化酶(COX)-2在三種組織中的表達(dá)

王菲菲, 龔菁菁, 霍學(xué)云, 路 靜, 郭 萌, 劉 欣, 李長(zhǎng)龍, 杜小燕, 陳振文, 呂建祎

(首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院, 北京, 100069)

目的 研究環(huán)氧化酶(COX)-2基因在糖尿病長(zhǎng)爪沙鼠3種組織中的表達(dá)水平，進(jìn)一步探索其與長(zhǎng)爪沙鼠糖尿病發(fā)生和發(fā)展的關(guān)系。方法 選取糖尿病長(zhǎng)爪沙鼠和正常沙鼠各6只，分別采集動(dòng)物的骨骼肌、肝臟和腎臟組織，用實(shí)時(shí)PCR和Western blotting檢測(cè)COX-2基因在各組織中mRNA和蛋白表達(dá)水平。 結(jié)果 實(shí)時(shí)PCR的結(jié)果表明，COX-2基因的mRNA水平在糖尿病組動(dòng)物的骨骼肌組織中表達(dá)與對(duì)照組無(wú)明顯差異，而肝臟和腎臟組織中有表達(dá)升高趨勢(shì)。Western blotting結(jié)果顯示，糖尿病組COX-2的蛋白水平在肝臟和腎臟組織中存在表達(dá)升高趨勢(shì)，且腎臟具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 COX-2在糖尿病長(zhǎng)爪沙鼠肝臟和腎臟組織中表達(dá)升高，在腎臟組織尤其明顯，說(shuō)明COX-2對(duì)長(zhǎng)爪沙鼠糖尿病的影響可能發(fā)生在肝臟和腎臟組織中。

長(zhǎng)爪沙鼠; II型糖尿病; COX-2; 實(shí)時(shí)PCR; Western blotting

糖尿病(Diabetes mellitus，DM)是因胰島素分泌和/或作用缺陷引起的以高血糖為主要特征的全身代謝性疾病，同時(shí)也是一種慢性、低度的炎癥性疾病，容易引發(fā)和參與一系列的代謝紊亂，導(dǎo)致各種并發(fā)癥的發(fā)生，成為繼心血管疾病和腫瘤之后的第三大嚴(yán)重危害人類健康的慢性終身疾病[1]。隨著人們飲食結(jié)構(gòu)和生活方式的改變，糖尿病的發(fā)病率呈逐漸上升的趨勢(shì)。我國(guó)成人糖尿病患病率平均為11.6 %, 患病人數(shù)已達(dá)到1.14億[2]。糖尿病主要分為1型和2型糖尿病，其中2型糖尿病(T2DM)患者占90 %以上[3]。2型糖尿病是多種因素共同作用的復(fù)雜遺傳病，以胰島素抵抗和/或胰島素分泌不足為主要特征[4]。

環(huán)氧化酶(Cyclooxygenase ，COX)又稱前列腺素G/H 合成酶, 是花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素(GP)的催化酶。哺乳動(dòng)物的COX有兩種形式: COX-1和COX-2。COX-1結(jié)構(gòu)性表達(dá)于大多數(shù)細(xì)胞內(nèi), 參與維持正常的生理功能[5]。COX-2是一個(gè)重要的誘導(dǎo)酶,在細(xì)胞受到各種刺激時(shí)迅速合成,參與多種病理生理過(guò)程。COX-2的主要產(chǎn)物前列腺素具有誘導(dǎo)炎性反應(yīng)、促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制免疫反應(yīng)、促進(jìn)血管生成等多種生物學(xué)活性。在人體內(nèi)COX-2局部表達(dá)增加與很多疾病狀態(tài)有關(guān)。COX-2過(guò)度表達(dá)能增加血管通透性，促進(jìn)單核細(xì)胞黏附，產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞趨化，激活基質(zhì)金屬蛋白酶，活化白細(xì)胞和血小板[6]。在胰島β細(xì)胞中，COX-2的表達(dá)高于COX-1，能降低人體對(duì)胰島素的敏感性[7]。近年來(lái)，許多研究表明[8]COX-2基因的高水平表達(dá)不僅與炎癥密切相關(guān)，而且還與惡性腫瘤和糖尿病的發(fā)生關(guān)系密切。COX-2的主要代謝產(chǎn)物前列腺素E2具有抑制胰島β細(xì)胞分泌胰島素的功能，因此認(rèn)為COX-2是影響1、2型糖尿病胰島β細(xì)胞功能紊亂的關(guān)鍵性因子[9,10]。

本文通過(guò)研究COX-2在糖尿病沙鼠和正常沙鼠的骨骼肌、肝臟和腎臟組織中mRNA和蛋白水平的表達(dá)情況，為長(zhǎng)爪沙鼠糖尿病模型的發(fā)生機(jī)制研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)近交系糖尿病模型長(zhǎng)爪沙鼠和正常長(zhǎng)爪沙鼠，選自首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部自行培育的近交系糖尿病模型長(zhǎng)爪沙鼠培育16代群體和普通長(zhǎng)爪沙鼠群體各6只, 12～15周齡, 體質(zhì)量69.56～96.42 g,雌雄各半，飼養(yǎng)于控制溫濕度的普通環(huán)境中[SYXK (京)2013-0005]。

1.2 樣品采集

采用戊巴比妥(100 mg/kg)腹腔注射麻醉動(dòng)物,脫頸椎方法施行安死術(shù)后, 解剖采集新鮮組織骨骼肌、肝臟和腎臟組織后立即置于液氮中。

1.3 儀器和試劑

研磨珠均質(zhì)器(BioSpec,美國(guó)); 低溫高速離心機(jī)(Eppendorf Centrifuge 5430R, Eppendorf, 德國(guó)); Nanodrop 2000c(Thermo scientific, 美國(guó)); Bio-Rad CFX96 manager System (Bio-Rad, 美國(guó)); PCR儀(Applied Biosystems, 美國(guó)); 電泳儀(Bio-Rad, 美國(guó));電轉(zhuǎn)儀(Bio-Rad, 美國(guó)); TRIzol?試劑Invitrogen，美國(guó)); 氯仿、無(wú)水乙醇、異丙醇(北京暢力通科技有限公司, 北京); 快速反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fast Quant RT Kit，天根生化科技有限公司, 北京); 實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒(SuperReal PreMix Plus，SYBR Green，天根生化科技有限公司, 北京); 組織蛋白提取試劑盒(康為世紀(jì)生物科技有限公司，北京); 二喹啉甲酸(Bicinchoninic Acid，BCA)蛋白定量試劑盒(康為世紀(jì)生物科技有限公司，北京); 凝膠圖像分析系統(tǒng)(Bio-Rad，美國(guó)); COX-2抗體(Abcam，英國(guó))。

1.4 RNA提取及cDNA的制備

從液氮中取出凍存的長(zhǎng)爪沙鼠3種組織約30 mg,剪碎后用均質(zhì)器將組織徹底打碎，分別加入1 mL TRIzol?試劑，混勻于室溫放置1 min，然后加入200 μL氯仿，震蕩混勻后，在冰上放置15 min，4 ℃ 20 817 × g 離心15 min, 取上層清液于1.5 mL離心管中, 加入500 μL異丙醇, 振搖混勻后在冰上靜置10 min, 4 ℃ 20 817×g 離心15 min, 棄上清。加入體積分?jǐn)?shù)75%乙醇, 將離心管底部沉淀吹起, 4 ℃ 15 294 ×g離心10 min, 棄上清。重復(fù)以上步驟1次。室溫晾干, 根據(jù)組織大小加入適量不含RNA酶的水溶解得到總RNA。采用Nanodrop 2000 c檢測(cè)RNA濃度。cDNA的制備按照快速反轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)上述總RNA樣品進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄, 得到相應(yīng)的cDNA。

1.5 實(shí)時(shí)PCR

利用 Primer Premier 5.0 設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物。除肌肉選取GAPDH基因作為內(nèi)參外，其他組織選取β-actin基因作為內(nèi)參基因并設(shè)計(jì)引物。GAPDH基因引物序列F: 5'-GCCATCAATGACCCC-3'; R: 5'-TCCCGTTCTCAGCCT-3'，β-actin基因引物序列F: 5'-AGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3'; R: 5'-CAATAGTGATGACCTGGCCGT-3'，COX-2基因引物序列F: 5' GACGACTAAACCAAGCC-3'; R: 5'-GGAATTATTTCTAGGACGAT-3'引物均由北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成。

采用實(shí)時(shí)PCR法在Bio-Rad CFX96 manager System上對(duì)COX-2和內(nèi)參基因的mRNA水平進(jìn)行檢測(cè)。所用試劑為實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒，反應(yīng)體系為20 μL體系。反應(yīng)條件如下: Q-PCR Master Mix 10 μL, 上游引物0.6 μL，下游引物0.6 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 7.8 μL。反應(yīng)程序均為: 95 ℃預(yù)變性5 min，之后94 ℃ 30 s，58 ℃ 35 s，共擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)結(jié)束時(shí)檢測(cè)熒光; 熔解曲線分析從48℃到63℃，每0.5℃檢測(cè)一次。

1.6 Western blotting

將新鮮的長(zhǎng)爪沙鼠骨骼肌、肝臟、腎臟組織，充分剪碎后用組織蛋白提取試劑盒提取總蛋白，用二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒對(duì)蛋白進(jìn)行定量。取30 μg總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分離，通過(guò)半干轉(zhuǎn)方式15 V 22 min將蛋白轉(zhuǎn)至NC膜。以Tris-HCl 緩沖液(25 mmol/L Tris,0.15 mol/L NaCL, pH 7.2)室溫封閉1～2 h。將膜與COX-2抗體(1∶1 000稀釋)4 ℃孵育過(guò)夜, TBST洗3次, 與二抗(辣根過(guò)氧化酶聯(lián)的抗兔血清用含0.5%脫脂牛奶TBST按照1∶5 000稀釋)室溫孵育1～2 h, TBST洗膜后用化學(xué)發(fā)光法顯色。骨骼肌、肝臟和腎臟做免疫印跡時(shí)內(nèi)參基因選用GAPDH作為內(nèi)參。最后用凝膠圖像分析系統(tǒng)掃描蛋白質(zhì)印跡條帶灰度。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,以P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同組織的COX-2 mRNA表達(dá)水平

COX-2是糖尿病長(zhǎng)爪沙鼠骨骼肌抑制消減雜交篩選出的一個(gè)重要基因，它在不同組織中mRNA的表達(dá)水平各不相同(圖1)。實(shí)驗(yàn)表明在骨骼肌組織中兩組間mRNA表達(dá)水平基本相同。在肝臟組織和腎臟組織中，COX-2在糖尿病組mRNA表達(dá)水平略高于對(duì)照組，但沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 不同組織的COX-2蛋白表達(dá)水平

在糖尿病動(dòng)物腎臟組織中COX-2蛋白表達(dá)顯著高于對(duì)照組(P＜0.05), 與實(shí)時(shí)PCR的結(jié)果一致。在糖尿病動(dòng)物肝臟組織中COX-2蛋白表達(dá)略高于對(duì)照組, 但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在骨骼肌組織中, COX-2蛋白總體表達(dá)沒(méi)有明顯差異(圖2)。

圖 1 COX-2在長(zhǎng)爪沙鼠不同組織中mRNA的表達(dá)情況Figure 1 The mRNA expression level of COX-2 in different tissues from diabetic and control gerbils

圖 2 長(zhǎng)爪沙鼠不同組織中COX-2 蛋白的表達(dá)情況Figure 2 Protein expression level of COX-2 in different tissues from diabetic and control gerbils

3 討論

糖尿病是當(dāng)前威脅全球人類健康最重要的非傳染性疾病之一[11]，可以由多種病因引起的。其中II型糖尿病是由遺傳因素和環(huán)境因素共同作用導(dǎo)致的復(fù)雜遺傳病[12-14]，以葡萄糖耐量降低、胰島素抵抗和胰島素分泌不足為主要特征[15]。深入研究胰島素抵抗，對(duì)于治療和防治II型糖尿病具有重要意義。最近幾年, 已有多種自發(fā)性糖尿病模型被開(kāi)發(fā)使用[16]，越來(lái)越多自發(fā)性糖尿病動(dòng)物模型能夠模擬各種人類糖尿病的癥狀，成為研究糖尿病遺傳相關(guān)分子機(jī)制的關(guān)鍵載體[17]。本研究前期經(jīng)過(guò)定向近交逐步培育成了一些生化指標(biāo)和病理組織形態(tài)均符合糖尿病標(biāo)準(zhǔn)的長(zhǎng)爪沙鼠自發(fā)性糖尿病模型群體。通過(guò)抑制消減雜交(suppression subtractive hybridization, SSH)的方法從同窩的高血糖和正常血糖長(zhǎng)爪沙鼠骨骼肌中發(fā)現(xiàn)環(huán)氧化酶(COX)-2差異表達(dá)，但是糖尿病動(dòng)物其他組織的表達(dá)情況還不清楚。本文研究COX-2在糖尿病沙鼠和正常沙鼠不同組織中mRNA和蛋白水平的表達(dá)情況。

胰島素抵抗(或)胰島素分泌不足會(huì)引起一些外周組織和器官代謝功能的紊亂，易引起并發(fā)癥的發(fā)生。骨骼肌是最大的葡萄糖吸收和脂肪酸氧化的器官，在胰島素的作用下吸收人體大部分的血糖以進(jìn)行肌肉的有氧和無(wú)氧呼吸。血糖濃度過(guò)高(或低), 肝臟通過(guò)合成肝糖原(或肝糖原分解、糖異生)途徑參與糖代謝并對(duì)機(jī)體血糖的儲(chǔ)存和分布進(jìn)行調(diào)節(jié)[18]。持續(xù)的高血糖狀態(tài)會(huì)引起慢性并發(fā)癥的發(fā)生，其中微血管病變是糖尿病特異性的并發(fā)癥，表現(xiàn)為循環(huán)障礙和微血管基底膜的增厚，微血管病變可累及全身各組織器官，其中以糖尿病腎病最重要。腎臟中糖尿病相關(guān)的血糖紊亂、微血管病變可致慢性腎功能不全、蛋白尿以及腎小球病變[19-21]。因此，作者選取骨骼肌、肝臟和腎臟組織作為糖尿病疾病作用的靶組織，研究COX-2在各組織的表達(dá)情況。

本實(shí)驗(yàn)中，檢測(cè)了COX-2在不同組織中的表達(dá)水平。實(shí)時(shí)PCR和Western blotting結(jié)果均顯示，在肝臟和腎臟組織中，該基因在糖尿病組的mRNA表達(dá)量和蛋白水平較對(duì)照組有升高趨勢(shì)，且腎臟組織蛋白表達(dá)存在明顯差異。但在骨骼肌組織中糖尿病組mRNA和蛋白表達(dá)量與對(duì)照組無(wú)明顯差異。COX-2是在糖尿病動(dòng)物骨骼肌組織中經(jīng)SSH篩選出來(lái)的基因，本研究中肝臟和腎臟結(jié)果與SSH結(jié)果一致，證明了SSH結(jié)果的可靠性，也首次闡釋COX-2基因在糖尿病動(dòng)物肌肉組織表達(dá)不明顯。這些結(jié)果說(shuō)明肝臟和腎臟可能是COX-2基因作用的靶器官，與長(zhǎng)爪沙鼠糖尿病的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)。

總之，本文結(jié)果表明在長(zhǎng)爪沙鼠糖尿病模型中, COX-2可能與糖尿病的發(fā)生發(fā)展有關(guān), 特別是在肝臟和腎臟組織中。這為研究糖尿病及其相關(guān)的分子調(diào)控機(jī)制以及模型動(dòng)物的推廣應(yīng)用奠定了基礎(chǔ), 為進(jìn)一步深入研究Ⅱ型糖尿病的防治提供新的思路。參考文獻(xiàn)：

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Analysis on Cyclooxygenase 2 Expression in Different Tissues from Spontaneous Diabetic Mongolian Gerbils

WANG Fei-fei, GONG Jing-jing, HUO Xue-yun, LU-jing, GUO-Meng, LIU-Xin, LI Chang-long, DU Xiao-yan, CHEN Zhen-wen, LV Jian-yi
(School of Basic Medical Science, Capital Medical University, Beijing 100069, China)

ObjectiveTo analyze Cyclooxygenase 2(COX-2) expression level in different tissues of diabetic gerbils and to explore the relationship of diabetes occurrence and development in Mongolian gerbils.MethodsDifferent tissues including skeletal muscle, liver and kidney were collected from 6 diabetic gerbils and 6 control animals respectively. COX-2 mRNA and protein expression level in different tissues were separately detected by Real-time PCR and Western blotting.ResultsThe Real-time PCR showed that compared with control animal, the mRNA expression of COX-2 in skeletal muscle had no obvious difference whereas it exhibited uptrend in liver and kidney. As the results of Western blotting, the difference of COX-2 in skeletal muscle was almost undetectable in diabetes group. The relative expression level in diabetic group exhibited uptrend compared with control in liver and kidney. And there was statistical significance in the kidney.Conclusions COX-2 was high expressed in liver and more remarkably in kidney of diabetic gerbils. It may illustrate that the effect of COX-2 mainly occurred in liver and kidney of diabetic gerbils.

Mongolian gerbils; Type 2 diabetes; Cyclooxygenase 2 (cox-2); Real-time PCR; Western blotting

Q95-33

A

1674-5817(2017)02-0118-05

10.3969/j.issn.1674-5817.2017.02.007

2016-09-30

國(guó)家科技支撐計(jì)劃(No. 2015BAI09B01); 國(guó)家自然科學(xué)基金 (Nos. 31272393 and 31402027); 北京市自然科學(xué)基金(No. 7141002)

王菲菲(1992-), 女, 碩士研究生, 專業(yè): 遺傳學(xué)。E-mail: wff23967321@163.com

呂建祎(1976-), 女, 博士, 講師。研究方向:遺傳學(xué)。E-mail: susanvalid@aliyun.com