龜裂禿馬勃的分子鑒定及生物學(xué)特性

田亞琴 牛玉蓉 +劉宇 +李華敏 +王守現(xiàn)

摘要：以1株野生馬勃屬菌株為研究對(duì)象，通過(guò)核糖體rRNA基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）序列分析鑒定為龜裂禿馬勃。以菌絲生長(zhǎng)速度、菌絲干質(zhì)量、菌絲生長(zhǎng)勢(shì)為指標(biāo)，研究其生物學(xué)特性。結(jié)果表明，龜裂禿馬勃的最適碳源為淀粉，最適氮源為尿素，最適碳氮比為20 ∶[KG-*3]1，最適溫度為28 ℃，最適生長(zhǎng)因子為維生素B6，最適pH值為5.0。

關(guān)鍵詞：龜裂禿馬勃；鑒定；組織分離；生物學(xué)特性

中圖分類號(hào)： S646.01文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）04-0109-03

龜裂禿馬勃（Calvatia utriformis，Handkea utriformis），別稱浮雕禿馬勃、龜裂馬勃，是馬勃菌目馬勃菌科禿馬勃屬真菌[1]。其子實(shí)體中等至大型，陀螺形，寬6～10 cm，高8～12 cm，白色，漸變?yōu)榈P色，最后變淺褐色；外包被常龜裂，內(nèi)包被薄，頂部裂成碎片，露出青色的產(chǎn)孢體，基部的不孕體大，并有一橫膜與產(chǎn)孢體分隔開(kāi)；孢子球形，光滑，青黃色，直徑3.0～4.5 μm，內(nèi)含1個(gè)油點(diǎn)；孢絲絲狀，稍分枝，青黃色，易斷。劉波早在1984年報(bào)道，龜裂禿馬勃具有止血、消毒、解毒等藥用功效[2]。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)龜裂禿馬勃的研究較少，且多偏向于醫(yī)學(xué)方面。鄧志鵬等概述了馬勃的藥理作用和臨床應(yīng)用，為其進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)[3]；徐力等探討了大馬勃（C. gigantea）提取液體外抗腫瘤作用[4]；郭玫等對(duì)馬勃進(jìn)行了系統(tǒng)研究，從生藥學(xué)、品質(zhì)評(píng)價(jià)、化學(xué)成分、藥理研究等方面作了概述[5]。

盡管許多研究表明馬勃具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和藥用價(jià)值，但是對(duì)于馬勃馴化栽培的研究鮮有報(bào)道。近年來(lái)，筆者從野外采集了1株禿馬勃屬真菌，編號(hào)為JZB2115010，對(duì)其進(jìn)行分子鑒定，并以菌絲生長(zhǎng)速度、菌絲干質(zhì)量、菌絲生長(zhǎng)勢(shì)為指標(biāo)，開(kāi)展生物學(xué)特性的研究，以篩選出較佳生長(zhǎng)條件，為其人工馴化栽培提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1材料和方法

1.1培養(yǎng)基材料

1.1.1綜合PDA培養(yǎng)基

馬鈴薯200 g、瓊脂20 g、葡萄糖20 g、大豆蛋白胨5 g、KH2PO4 3 g、MgSO4 1.5 g、維生素B1 10 mg，加水至1 000 mL。

1.1.2基礎(chǔ)培養(yǎng)基

葡萄糖20 g、大豆蛋白胨2 g、KH2PO4 1 g、MgSO4 0.5 g、維生素B1 10 mg、瓊脂16 g，加水至 1 000 mL。

1.1.3加富培養(yǎng)基

葡萄糖20 g、大豆蛋白胨2 g、馬鈴薯200 g、KH2PO4 1 g、MgSO4 0.5 g、維生素B1 10 mg、瓊脂16 g，加水至1 000 mL。

1.2野生菌母種分離

2010年8月25日在北京市房山區(qū)蒲洼林地采集1種禿馬勃屬真菌，組織分離獲得該野生菌的母種。

1.3野生菌株分子鑒定

利用核糖體rRNA基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）序列的通用引物ITS4和ITS5對(duì)分離的野生菌株進(jìn)行ITS-PCR鑒定[6-9]。

1.4同步菌絲制備

母種純化分離好后轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基上，待菌絲基本長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿時(shí)，用6 mm的打孔器在菌絲邊緣打孔，用接種針挑取菌塊轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)皿的中央，置于25 ℃培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)，以獲得相同菌齡的菌絲，保證后續(xù)生物學(xué)特性研究的準(zhǔn)確[9]。

1.5野生菌株生物學(xué)特性研究

碳源、氮源、碳氮比、生長(zhǎng)因子、溫度、pH值的測(cè)定，參照文獻(xiàn)[9-11]中的方法。

菌絲日生長(zhǎng)速度、菌絲干質(zhì)量、菌絲生長(zhǎng)勢(shì)的測(cè)定，參照文獻(xiàn)[9]中的方法。

2結(jié)果與分析

2.1野生菌株的鑒定結(jié)果

用ITS4、ITS5通用引物對(duì)野生菌株的DNA進(jìn)行擴(kuò)增、測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果提交至GenBank，登錄號(hào)為JQ293098.1。BLAST分析表明，野生菌JZB2115010擴(kuò)增序列與登錄號(hào)為EU833659.1、JN411549.1的龜裂禿馬勃（H. utriformis）同源性均達(dá)到99%。因此，結(jié)合圖1子實(shí)體形態(tài)可確定分離菌株為龜裂禿馬勃。

2.2.4生長(zhǎng)因子對(duì)龜裂禿馬勃菌絲生長(zhǎng)的影響

由表4可知，不同生長(zhǎng)因子對(duì)龜裂禿馬勃菌絲生長(zhǎng)有一定影響，其中維生素B6處理的菌絲生長(zhǎng)速度最快，達(dá)1.45 mm/d，但與維生素C、玉米漿、維生素B2、肌醇處理差異不顯著。在菌絲干質(zhì)量方面，維生素B2的干質(zhì)量最高，達(dá)0.082 0 g，但與肌醇、維生素B6、維生素C處理差異不顯著；對(duì)照和維生素B1處理菌絲干質(zhì)量最低，但差異不顯著。在菌絲生長(zhǎng)勢(shì)方面，維生素B6處理表現(xiàn)最好，菌絲潔白濃密；對(duì)照和維生素B1處理表現(xiàn)最差。綜合考慮，龜裂禿馬勃的最適生長(zhǎng)因子為維生素B6。

2.2.5溫度對(duì)龜裂禿馬勃菌絲生長(zhǎng)的影響

2.2.6pH值對(duì)龜裂禿馬勃菌絲生長(zhǎng)的影響

由表6可知，不同pH值對(duì)龜裂禿馬勃菌絲生長(zhǎng)影響明顯。龜裂禿馬勃菌絲在pH值為 4.5～8.0范圍內(nèi)均能生長(zhǎng)；在pH值為4.5～60時(shí)，菌絲潔白，生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)；當(dāng)pH值為5.0時(shí)，菌絲生長(zhǎng)最快，達(dá)1.63 mm/d，pH值為5.5時(shí)，長(zhǎng)速為 1.60 mm/d，二者差異不顯著；pH值為8.0時(shí)，菌絲生長(zhǎng)速度最慢，僅為 0.96 mm/d。從菌絲體干質(zhì)量來(lái)看，pH值為5.0時(shí)，菌絲體干質(zhì)量最高，為0.253 7 g，且與pH值為4.5、5.5、6.0的處理之間差異不顯著；pH值為7.5時(shí)菌絲干質(zhì)量最低，僅為0039 9 g，與pH值為8.0的處理差異不顯著。從菌絲生長(zhǎng)勢(shì)來(lái)看，pH值為5.0時(shí)菌絲長(zhǎng)勢(shì)最旺；其次是pH值為4.5、5.5、6.0處理；菌絲在pH值為8.0長(zhǎng)勢(shì)最弱。因此，綜合以上分析，本試驗(yàn)選取的最適pH值為5.0。

3討論與結(jié)論

龜裂禿馬勃子實(shí)體鮮嫩可食，營(yíng)養(yǎng)豐富，有益于人體健康，既具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值，又具有藥用價(jià)值。因此，對(duì)龜裂禿馬勃進(jìn)行生物學(xué)特性研究，有助于更好地培育龜裂禿馬勃，促進(jìn)其開(kāi)發(fā)利用。本研究表明，龜裂禿馬勃最適碳源是淀粉，這一結(jié)果與賀新生等報(bào)道的雙環(huán)林地蘑的最適碳源一致[12]，當(dāng)龜裂

禿馬勃以其他成分為碳源時(shí)，菌絲可以生長(zhǎng)，但長(zhǎng)勢(shì)不好，其中以乳糖長(zhǎng)勢(shì)表現(xiàn)最差。在氮源利用方面，龜裂禿馬勃最適氮源是尿素，在黃豆粉上表現(xiàn)最差，該結(jié)果與張國(guó)廣等報(bào)道的野生小馬勃的最適氮源為黃豆粉和麥麩混合物的結(jié)果不一致[13]，這可能是因?yàn)樾●R勃和龜裂禿馬勃同屬不同種，故對(duì)氮源利用存在差異；此外，本研究結(jié)果與陳芝蘭等報(bào)道的黑脈羊肚菌[14]和黃春燕等報(bào)道的大球蓋菇[15]的最適氮源相一致。最適碳氮比是20 ∶[KG-*3]1，這與鄒莉等對(duì)亞側(cè)耳所報(bào)道的適宜碳氮比[10]相一致。最適生長(zhǎng)因子是維生素B6，這與丁珊珊等對(duì)野生裸蓋菇L-001菌株報(bào)道的最適生長(zhǎng)因子[16]相一致。最適溫度為28 ℃，這一結(jié)果與張國(guó)廣等報(bào)道的野生小馬勃的最適溫度[13]相一致，當(dāng)溫度高于36 ℃時(shí)龜裂禿馬勃不生長(zhǎng)，另外筆者近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，多數(shù)食用菌的最適生長(zhǎng)溫度為28 ℃[9，17]。最適pH值為5.0，這一結(jié)果與張國(guó)廣等報(bào)道野生小馬勃的最適pH值不一致，其最適pH值為5.5[13]，兩者差別不大，可能是由于試驗(yàn)誤差造成的數(shù)據(jù)不一致，但由此可知馬勃屬大多適宜在較低pH值的環(huán)境下生長(zhǎng)。目前，未見(jiàn)其他關(guān)于龜裂禿馬勃最適氮源、碳源、碳氮比及最適生長(zhǎng)因子的綜合研究報(bào)道，本研究可為龜裂禿馬勃的人工馴化栽培提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]彭衛(wèi)紅，甘炳成，譚偉，等. 四川省龍門(mén)山區(qū)主要大型野生經(jīng)濟(jì)真菌調(diào)查[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2003，16（1）：36-41.

[2]劉波. 中國(guó)藥用真菌[M]. 太原：山西人民出版社，1984.

[3]鄧志鵬，孫隆儒. 中藥馬勃的研究進(jìn)展[J]. 中藥材，2006，29（9）：996-998.

[4]徐力，許冰. 大馬勃體外抗腫瘤作用初探[J]. 中國(guó)醫(yī)藥指南，2011，9（34）：264-265.

[5]郭玫，張揚(yáng). 中藥馬勃的研究概況[J]. 甘肅中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，27（1）：60-62.

[6]沙濤，丁驊孫，張漢波，等. 利用松茸ITS特異性引物對(duì)松茸分離物進(jìn)行鑒定[J]. 云南植物研究，2004，26（5）：524-528.

[7]戴溈田，張平. 中國(guó)幾種劇毒鵝膏菌的ITS序列分析[J]. 生命科學(xué)研究，2006（3）：110-113.

[8]王曉娥，姚方杰. 塊菌rDNA的ITS序列分析試驗(yàn)條件的初步研究[J]. 中國(guó)食用菌，2006，25（5）：37-39.

[9]王守現(xiàn)，劉宇，許峰，等. 荷葉離褶傘菌株的ITS鑒定及生物學(xué)特性研究[J]. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（社會(huì)科學(xué)版），2012，28（5）：148-152.

[10]鄒莉，王義，王軼，等. 亞側(cè)耳菌絲生物學(xué)特性研究[J]. 菌物學(xué)報(bào)，2008，27（6）：915-921.[HT][HJ][HT][LM]

[11]蔡丹鳳，陳美元，郭仲杰，等. 茯苓菌株生物學(xué)特性的研究[J]. 中國(guó)食用菌，2009，28（1）：23-26.

[12]賀新生，李純?nèi)A，康曉惠. 青藏高原黃綠蜜環(huán)菌純培養(yǎng)菌種的分離培養(yǎng)及分子鑒定雙環(huán)林地蘑菇的生物學(xué)特性和栽培特性[J]. 食用菌學(xué)報(bào)，2001，20（3）：23-28.

[13]張國(guó)廣，劉振富，張穎，等. 野生小馬勃的鑒定及其生物學(xué)特性研究[J]. 中國(guó)食用菌，2009，28（6）：30-31，61.

[14]陳芝蘭，張涪平. 黑脈羊肚菌菌絲的生物學(xué)特性[J]. 食用菌，2004，26（6）：6-7.

[15]黃春燕，萬(wàn)魯長(zhǎng)，張柏松，等. 大球蓋菇菌絲生長(zhǎng)適宜氮源研究[J]. 中國(guó)食用菌，2012，31（6）：18-19，23.

[16]丁珊珊，毛寧. 野生裸蓋菇L-001菌株的生物學(xué)特性[J]. 食用菌，2010，32（1）：24-26.

[17]王守現(xiàn)，劉宇，許峰，等. 野生黃傘JZB2116005菌株的鑒定及生物學(xué)特性研究[J]. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，35（3）：603-608.