青錢柳多糖對高脂血癥小鼠SOD、GSH—Px、CAT基因mRNA表達的影響

趙靜+吳茹+李楠+楊占威+胡文兵+王文君

摘要：為研究青錢柳多糖對高脂血癥小鼠抗脂質過氧化相關基因表達的影響，將建模成功的高脂血癥小鼠隨機分為青錢柳多糖高、中、低劑量組，辛伐他汀組，高脂模型組和空白對照組，其中前4組分別灌胃400、200、100 mg/kg青錢柳多糖水溶液，4 mg/kg辛伐他汀水溶液，另2組灌胃等量無菌水，每組16只，連續喂養4周。試驗結束后采用逆轉錄PCR（RT-PCR）測定肝臟、脂肪組織中超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、過氧化氫酶（CAT）基因的mRNA表達水平，探討青錢柳多糖抗脂質過氧化機制。結果表明，不同劑量青錢柳多糖可使SOD、GSH-Px、CAT mRNA表達量顯著或極顯著上升（P<0.05或P<0.01），其中肝臟組織中SOD、CAT表達量最大增幅分別達1309%、108.6%，GSH-Px表達量未出現顯著變化；脂肪組織中SOD、GSH-Px的最大上調幅度分別為507%、1000%，而CAT表達量無顯著差異。結果顯示，青錢柳多糖可調節高脂血癥小鼠抗氧化相關基因的表達，增強其機體抗脂質過氧化能力。

關鍵詞：青錢柳；多糖；脂質過氧化；高脂血癥；mRNA表達

中圖分類號： S188文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）04-0124-04

隨著經濟快速發展及人民生活水平的提高，肥胖已成為人們面臨的一個重要健康問題，高脂、高蛋白食物的過多攝入，導致人體脂質代謝異常，脂質過氧化程度加重。高脂、高蛋白食物消化產物可引起細胞的功能損傷并伴隨多種疾病的發生，如心血管疾病、癌癥、動脈粥樣硬化等[1]。目前，降血脂仍主要依賴于他汀類藥物，其副作用日益被人們關注，因此，研究開發天然無毒、無副作用的植物提取物作為抗脂質過氧化的功能性食品藥品顯得格外重要。已有研究發現，植物中分離得到的多糖類化合物能夠清除體內自由基，抑制亞油酸氧化，具有防止細胞脂質過氧化的作用[2]。青錢柳[Cyclocarya paliurus （Batal） Iljinskkaja]別稱青錢李或金錢柳，系胡桃科青錢柳屬落葉喬木，該屬現僅存1種，且僅存于我國，是我國瀕臨絕種的珍稀樹種之一，已于2013年被納入我國新食品原料。青錢柳中含有人體所需的胡蘿卜素、維生素E、維生素C、蛋白質和人體必需氨基酸等多種成分，在民間已被制作為一種保健茶飲用。此外，青錢柳還含有對人體健康有積極意義的大量、微量元素[3]，已有研究表明，青錢柳多糖具有降血糖、降血脂、降血壓、抗氧化、提高免疫力等作用[4]，然而關于青錢柳多糖抗脂質過氧化的分子機制鮮有報道。

筆者所在實驗室前期研究表明，青錢柳多糖可通過調節高脂血癥大鼠脂代謝相關基因的表達，降低血脂水平[5]；同時，青錢柳多糖在體內、體外也有明顯的抗氧化作用，可清除羥基自由基、對二苯代苦味酰基自由基（DPPH·），并能夠顯著提高高脂血癥小鼠肝臟超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，簡稱SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，簡稱GSH-Px）活性，降低丙二醛（malondialdehyde，簡稱MDA）、游離脂肪酸（nonestesterified fatty acid，簡稱NEFA）含量[6]。本試驗在前期研究基礎上采用逆轉錄PCR（RT-PCR）測定抗氧化相關基因SOD、GSH-Px、過氧化氫酶（catalase，簡稱CAT）在肝臟、脂肪細胞中的表達水平，在分子水平上進一步探討青錢柳多糖的抗氧化機制，以期為青錢柳多糖的開發、利用提供理論依據。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1試驗動物本研究所用試驗動物為120只出生21d的雌性昆明種小鼠，體質量18～22 g[合格證號：SY（贛）2010-0002]，購自南昌大學醫學部實驗動物中心，小鼠飼養環境溫度（23±2） ℃，相對濕度（55±5）%，光照時間12h/d（光照時間范圍：07：00—19：00）。

1.1.2藥物、試劑和儀器青錢柳葉采用水提醇沉法提取多糖[6]，經D301R樹脂純化后，測得多糖含量為60.71%；全價飼料，由南昌大學醫學部實驗動物中心提供。辛伐他汀膠囊，上海云峰藥業有限公司；總膽固醇（TC）測定試劑盒，中生北控生物科技股份有限公司；焦炭酸二乙酯（DEPC），美國Amresco公司；瓊脂糖，美國Promega公司；2×Taq PCR Master Mix，美國BEST ALL公司；RNase噴霧清除劑、TRIzol試劑盒、RT-PCR試劑盒，北京全式金生物技術有限公司；PCR引物，生工生物工程（上海）股份有限公司。其他試劑均為分析純。

主要儀器：PE9600 PCR儀，PERKIN ELMER公司；GeneGenius全自動數碼成像及分析系統，SYNGENE公司；移液器、5415D型小型高速離心機，德國Eppendorf公司；超微量分光光度計，美國Thermo Scientific公司。

1.2試驗方法

1.2.1高脂血癥小鼠建模與給藥本試驗高脂乳劑配制方法見文獻[6]，120只小鼠適應性喂養1周后隨機分成空白對照組（20只）、模型組（100只）。每天09：00模型組灌胃高脂乳劑（1 mL/kg），空白對照組灌胃等體積的無菌水，其間自由飲水攝食。灌胃2周后，禁食、不禁水12 h，眼眶靜脈采血，測定小鼠血清總膽固醇含量。模型組小鼠血清TC值與空白對照組相比差異極顯著（P<0.01）視為建模成功，選取80只造模成功的小鼠，隨機分高脂模型組、對照組與青錢柳多糖低、中、高劑量組和辛伐他汀組，每組16只。除空白對照組外，其余5組小鼠每天9：00灌胃高脂乳劑（1 mL/kg），16：00青錢柳多糖低、中、高3組分別以100、200、400 mg/kg青錢柳多糖水溶液灌胃，高脂模型組、對照組灌胃等體積的無菌水，陽性對照組（辛伐他汀組）灌胃辛伐他汀水溶液4 mg/kg。連續灌胃4周，每周稱量1次體質量，以調整給藥劑量，試驗期間各組小鼠均自由飲水攝食。

1.2.2RNA的提取、逆轉錄和RT-PCR試驗結束后，禁食、不禁水12 h，乙醚麻醉后迅速解剖小鼠，取肝臟、腹腔脂肪放入液氮速凍，于-80 ℃保存備用。

總RNA的提取：參照TRIzol試劑盒說明書提取各組小鼠肝臟和腹腔脂肪總RNA，經超微量紫外分光光度計測定，D260 nm/D280 nm值在1.8～2.0之間，電泳檢驗完整性符合下游試驗要求。

逆轉錄合成cDNA。按照試劑盒要求配制逆轉錄體系：5～500 ng總RNA、10 μL 2×ES Reaction Mix、1 μL Anchored Oligo（dT）18 （0.5 μg/μL）、1 μL EasyScriptTM RT/RI Enzyme Mix，補充脫RNase水至20μL。輕輕混勻此反應體系，42 ℃ 孵育30 min，85 ℃加熱5 min滅活逆轉錄酶。取出 1 μL cDNA 測定其濃度，剩余cDNA保存于-20 ℃或立即用于PCR。

RT-PCR：登錄GenBank查找SOD、GSH-Px、CAT、β-肌動蛋白（β-actin）基因序列，用DNAMAN（Version 3.0）設計所需引物，并由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，相關引物序列信息見表1。PCR反應體系：1 μL cDNA，各05 μL上、下游引物，12.5 μL 2×Taq PCR Master Mix，補充雙蒸水至25 μL。反應條件：95 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，61 ℃（SOD、GSH-Px、CAT基因）30 s，59.3 ℃（β-actin基因）30 s，72 ℃ 30 s，34次循環。

1.2.3凝膠成像分析及數據分析RT-PCR擴增結束后，分別取各組SOD、GSH-Px、CAT PCR產物電泳[條件為15%瓊脂糖凝膠（含0.05%溴化乙錠），1×TAE（成分為三羥甲基氨基甲烷、乙酸、乙二胺四乙酸）電泳緩沖液，80 V電泳 1 h]，用凝膠圖像分析軟件（Gene Tools Analysis）進行光密度掃描半定量分析，目的基因的相對表達量以該基因和[JP2]β-actin 電泳帶于260 nm的吸光度比值表示。設空白對照組mRNA吸光度為1，計算其他各試驗組mRNA相對吸光度比值。試驗數據用DPS統計軟件（V3.01專業版）統計分析，結果以“平均值±標準差”（x[TX-*5]±s）表示，P<0.05視為差異顯著。[JP]

2結果與分析

2.1青錢柳多糖對高脂血癥小鼠肝臟和脂肪組織中SOD mRNA表達的影響[HT]

在通常情況下，生物體內的自由基處于動態平衡，當此平衡被打破后，將引發許多相關疾病。SOD、GSH-Px、CAT常被用作重要的抗氧化指標，它們的協同作用維持了機體自由基的動態平衡，可以阻止脂質過氧化和此過程中的中間產物對機體造成的損害。SOD是生物體內重要的抗氧化酶之一，通過催化超氧化物轉化為過氧化氫、氧氣而達到抗氧化作用，在維持生物體自由基產生、平衡過氧化物清除能力上起重要作用[7]。Zeng等報道，L-蘋果酸可提升大鼠肝臟細胞中SOD mRNA的表達量[8]。Fer[KG-*5]n[DD（-1*2][HT6]′[DD）]andez-Iglesias等發現，在葡萄籽原花色素提取物和富含二十二碳六烯酸（DHA）的水藻提取物混合作用下，大鼠SOD活性、肝臟SOD表達量顯著提高[9]。

設正常對照組小鼠脂肪中SOD mRNA表達吸光度為1，計算其他各組mRNA表達相對吸光度。由表2、圖1可知，在肝臟中，與空白對照組相比，高脂模型組小鼠肝臟中SOD mRNA表達量下降45.0%（P<0.05）；與高脂模型組相比，青錢柳多糖高劑量組、中劑量組、辛伐他汀組小鼠肝臟中SOD mRNA表達量顯著或極顯著升高（P<0.05或P<0.01），上升率分別為130.9%、527%、56.4%，此外低劑量組也上升40.0%。在脂肪中，與空白對照組相比，高脂模型組小鼠脂肪中SOD mRNA表達量下降330%，差異極顯著（P<0.01）；與高脂模型組相比，青錢柳多糖高劑量組、中劑量組、低劑量組、辛伐他汀組小鼠脂肪中SOD mRNA表達量分別上升了50.7%、38.8%、104%、23.9%，且高劑量和低劑量組與之差異顯著（P<005）。結果表明，青錢柳多糖可通過調節SOD mRNA的表達量提高抗氧化能力。

2.2青錢柳多糖對高脂血癥小鼠肝臟中GSH-Px mRNA表達的影響[HT]

作為一種重要的催化氧化酶，谷胱甘肽過氧化物酶廣泛分布在細胞質、線粒體內， 不僅能清除生物體內自由基，還能

阻斷脂質過氧化鏈式反應，保護細胞膜的結構和功能不被破壞[10]。Han等研究發現，2種富含花青素的紫薯提取物可顯著提高大鼠肝臟中GSH-Px的表達水平，從而抑制肝臟中脂質過氧化的發生[11]；另外有研究顯示，在紅茶提取物干涉下，秀麗隱桿線蟲細胞中GSH-Px的活性增加，其mRNA表達水平也顯著上升[12]。設空白對照組小鼠組織中GSH-Px mRNA 表達吸光度為1，計算其他各組mRNA表達相對吸光度。由表3、圖2可見，在肝臟中，與空白對照組相比，高脂模型組小鼠GSH-Px mRNA表達量升高4.2%；與高脂模型組相比，青錢柳多糖高劑量組、中劑量組、低劑量組及辛伐他汀組小鼠肝臟中GSH-Px mRNA表達量沒有顯著性差異，隨著

2.3青錢柳多糖對高脂血癥小鼠CAT mRNA表達的影響

過氧化氫酶又稱觸酶，是生物防御體系中重要的末端氧化酶。CAT主要作用是清除生物體內的過氧化氫，它以過氧化氫為底物，催化1對電子的轉移，將其最終分解為水、氧氣，進而阻止對機體有害的羥基自由基生成[13]。已有研究發現，迷迭香提取物可以提高高脂膳食小鼠肝臟中CAT mRNA的活性和表達水平，并減少脂質過氧化產物[14]。

設空白對照組小鼠肝臟中CAT mRNA表達吸光度為1，計算其他各組mRNA表達相對吸光度。由表4、圖3可見，在肝臟中，與空白對照組相比，高脂模型組小鼠肝臟中CAT mRNA 表達量下降42.0%（P<0.05）；與高脂模型組相比，青錢柳多糖高劑量組、中劑量組、低劑量組、辛伐他汀組小鼠肝臟中CAT mRNA表達量分別提高了108.6%、89.7%、241%、41.4%，其中高劑量組肝臟中CAT mRNA表達量較高脂模型組極顯著提高（P<001）。在脂肪中，與空白對照組相比，高脂模型組脂肪中CAT mRNA下降6.0%；與高脂模型組比較，青錢柳多糖高劑量組、中劑量組、低劑量組、辛伐他汀組CAT mRNA表達量提高幅度分別為39.4%、39.4%、106%、287%。結果說明，青錢柳多糖可影響CAT在肝臟中的表達，調節機體抗脂質過氧化能力，在脂肪組織中各組CAT mRNA的表達量未出現顯著差異，出現這種現象可能是因為CAT主要存在于動物的肝臟、紅細胞中，在脂肪中表達

3結論

本研究發現，青錢柳多糖能顯著提高小鼠SOD、GSH-Px、CAT基因的表達量，從而提升體內抗氧化酶的活性和清除自由基的能力，在分子水平上解釋了青錢柳多糖抗脂質過氧化的可能的機制，可為青錢柳的開發提供理論依據。

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