黃瓜耐低氮相關基因的克隆及表達分析

薛存寶+范蓮雪+張鉛+王悅+郭冬雪++秦智偉++武濤

摘要：從黃瓜葉片中分離獲得1個丙二烯氧化物環化酶基因，命名為[WTBX][STBX]CsAOC3[WTBZ][STBZ]。該基因cDNA全長為753 bp，編碼250個氨基酸，與甜瓜的丙二烯氧化物環化酶（AOC）序列同源性最高。通過熒光定量PCR（qRT-PCR）分析發現，[WTBX][STBX]CsAOC3[WTBZ][STBZ]在低氮脅迫條件下只有在耐低氮黃瓜品系D0328中的表達量明顯上調，在耐低氮能力弱的黃瓜品系D0422中的表達量并無明顯變化。研究結果可為黃瓜耐低氮的基因功能研究提供理論依據。

關鍵詞：黃瓜；耐低氮；基因；克隆；表達分析

中圖分類號：Q786 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2017）04-0026-04

氮素由于在植物生長發育中有著不可或缺的作用，因此一直被廣泛關注和研究。黃瓜（Cucumis sativus L.）作為一種喜硝態氮的蔬菜作物，對于氮素的需求也是毋庸置疑的。近幾年來，生產者在盲目追求黃瓜產量的同時，過度施用氮肥的現象十分嚴重，造成的環境污染、黃瓜產品質量下降等后果也十分嚴峻[1-2]。因此，有效提高黃瓜耐低氮能力、培育耐低氮黃瓜品種對于創造綠色農業、現代農業具有重要意義。隨著黃瓜基因的測序完成，許多研究已經發展到了分子水平，鑒于其他模式植物如擬南芥等的研究，通過挖掘氮素相關基因，利用基因工程手段提高植物的氮素代謝能力是研究黃瓜耐低氮的重要手段之一[3]。何紅梅等對低氮脅迫下黃瓜鈣依賴蛋白激酶基因CsCDPK進行了克隆、表達分析及遺傳轉化，也對谷氨酰胺合酶基因[WTBX][STBX]GS1[WTBZ][STBZ]和黃瓜硝酸鹽轉運蛋白基因[WTBX][STBX]CsNRT1.5[WTBZ][STBZ]等進行了克隆與表達分析[4-6]，證明通過轉錄水平找到黃瓜耐低氮相關基因是可行的。丙二烯氧化物環化酶（allene oxide cyclase，AOC）基因是茉莉酸合成的重要酶基因，目前已經在多種作物中被克隆，如番茄[7]、擬南芥[8]、大豆[9]等。盡管這些AOC基因來自不同的植物，但是它們都對生物、非生物脅迫具有類似的響應。例如，麻瘋樹JcAOC可響應鹽脅迫、低溫脅迫[10]；喜樹AOC基因的過表達可提高煙草對鹽脅迫、低溫脅迫的耐受性[11]；將大豆[WTBX][STBX]GmAO[WTBZ][STBZ]基因導入煙草可提高轉基因植株的抗氧化脅迫能力，而[WTBX][STBX]GmAOC1[WTBZ][STBZ]則提高了煙草的耐鹽性[9]。但是，關于黃瓜[WTBX][STBX]CsAOC3[WTBZ][STBZ]基因對低氮脅迫的響應還未見報道。

本研究對黃瓜[WTBX][STBX]CsAOC3[WTBZ][STBZ]基因進行分離，獲得該基因的全長cDNA序列，并闡述該基因的蛋白結構及系統進化情況，同時研究該基因在耐低氮能力不同的2個黃瓜品系中的表達模式。

1材料與方法

1.1材料

試驗材料為前期篩選出的2份黃瓜品系：耐低氮能力強的D0328、耐低氮能力弱的D0422[12]，由東北農業大學園藝學院黃瓜課題組提供。

1.2菌株與試劑

大腸桿菌DH5α菌株、pEASY-T1克隆載體、DNA凝膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒和Taq DNA聚合酶，購自北京全式金生物技術（TransGen Biotech）有限公司；TRIzol，購自Invitrogen公司；SYBR Green PCR Master Mix熒光定量試劑盒、cDNA第1鏈合成試劑盒，購自東洋紡（上海）生物科技有限公司（TOYOBO）；其他生化試劑均為進口或國產分析純產品。基因測序由金唯智生物科技（北京）有限公司完成。

1.3方法

1.3.1植物培養將D0328、D0422種子浸種催芽后，在人工氣候室中進行播種培養，光—暗周期16 h—8 h，晝—夜溫度26 ℃—18 ℃，空氣相對濕度保持在65%～70%之間，使用全蛭石為基質，澆灌營養液栽培。待其子葉展平時，分別用含低氮（3 mmol/L NO3-）、正常氮（14 mmol/L NO3-）的營養液進行處理，基礎營養液配方：1.512 mmol/L NaH2PO4·2H2O，0.257 mmol/L Na2HPO4·12H2O，1.5 mmol/L MgSO4·7H2O，4 mmol/L Ca（NO3）2·4H2O，6 mmol/L KNO3，8.6 μmol/L C10H12FeN2NaO8·3H2O，10.3 μmol/L MnSO4，1 μmol/L CuSO4·5H2O，30 μmol/L H3BO3，24 nmol/L Na6Mo7O24·4H2O，130 nmol/L CoCl2·6H2O[13]。用KCl、KNO3調整營養液中的K+、Ca2+平衡，每隔1 d澆灌營養液1次。在播種后37 d分別取根、莖、葉，液氮速凍后，存放于-80 ℃備用。

1.3.2總RNA提取及cDNA第1鏈合成采用TRIzol法提取各部位總RNA，用分光光度計檢測吸光度及濃度；cDNA第1鏈的合成參照TOYOBO公司的ReverTra Ace qPCR RT Kit說明書進行。

1.3.3引物設計與合成以黃瓜基因組數據庫中序列號為Csa5M366670.1的基因編碼序列為模板，利用Primer Premier 5.0軟件進行克隆引物、qRT-PCR引物設計

1.3.4黃瓜[WTBX][STBX]CsAOC3[WTBZ][STBZ]基因的克隆與序列分析以D0328葉片cDNA為模板，利用PCR技術進行CsAOC的克隆，20 μL反應體系：2 μL 10×Taq Buffer，2 μL dNTP Mix，各0.5 μL CsAOC-F（10 μmol/L）、CsAOC-R（10 μmol/L），0.2 μL 5 U/μL Taq DNA聚合酶，2 μL 200 ng/μL模板cDNA，12.8 μL ddH2O。反應條件：96 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，25次循環；72 ℃ 10 min。反應結束后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并進行目的條帶的回收，與pEASY-T1克隆載體連接，轉入大腸桿菌DH5α感受態細胞中，將菌液鋪平板，于37 ℃培養過夜，挑斑，搖菌，然后進行質粒提取，酶切鑒定后送陽性樣本測序。

利用美國國立生物技術信息中心（網址：http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/，簡稱NCBI）在線Blast工具和DNAMAN、DNAStar進行序列比對、分析；利用在線軟件Expasy、TMHMM等進行氨基酸組成、穩定系數、親水系數等分析；利用MEGA 5.10軟件，采用鄰近法構建系統進化樹。

1.3.5低氮脅迫條件下的表達分析以低氮、正常氮處理植株的根、莖、葉cDNA為模板，進行qRT-PCR，20 μL反應體系：10 μL SYBR Green PCR Master Mix，各0.5 μL [WTBX][STBX]CsAOC3[WTBZ][STBZ]-qF（10 μmol/L）、[WTBX][STBX]CsAOC3[WTBZ][STBZ]-qR（10 μmol/L），1 μL 150 ng/μL cDNA，8 μL ddH2O。反應條件：96 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s，56 ℃ 15 s，72 ℃ 45 s，45次循環。以本試驗中的[WTBX][STBX]CsEF1α[WTBZ][STBZ]作為參照基因。

2結果與分析

2.1克隆

以低氮處理的黃瓜葉片cDNA為模板，以[WTBX][STBX]CsAOC3[WTBZ][STBZ]-F、[WTBX][STBX]CsAOC3[WTBZ][STBZ]-R為引物，通過PCR擴增出1條約750 bp的亮帶（圖1）?；厥漳繕藯l帶，并與pEASY-T1克隆載體連接，經陽性菌液酶切檢測后，送交金唯智生物科技（北京）有限公司測序得到堿基序列，全長為753 bp，該序列與黃瓜基因組數據庫[WTBX][STBX]Csa5M366670.1[WTBZ][STBZ]基因編碼區序列完全一致，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA，表明成功獲得全長目的基因。

2.2序列分析

利用DNAMAN 8.0軟件翻譯該序列，發現該序列共編碼250個氨基酸（圖2）。通過NCBI對該基因的氨基酸序列保守結構域分析發現，其蛋白屬于丙二烯氧化物環化酶超家族

（allene oxide cyclase superfamily）（圖3）。通過在線軟件Expasy-ProtParam（http：//www.expasy.org/）分析該基因所編碼蛋白的理化性質，結果表明，CsAOC3蛋白的分子量為27.17 ku，理論等電點為8.93，不穩定系數為 51.92，平均親水系數為-0.155，因此該蛋白屬于不穩定型的疏水蛋白。利用TMHMM Server v 2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）跨膜結構區預測表明，CsAOC3蛋白不具有跨膜蛋白結構。用TargetP（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）分析表明，該蛋白無信號肽，此外亞細胞定位顯示，該蛋白最可能定位于葉綠體。

2.3系統進化分析

將DNAMAN 8.0軟件翻譯獲得的[WTBX][STBX]CsAOC3[WTBZ][STBZ]編碼的氨基酸序列在NCBI蛋白數據庫中比對發現，該蛋白與甜瓜、菜豆、胡楊等16種植物的AOC蛋白有65%～94%的同源性，其中與甜瓜的蛋白同源性最高，為94%。將CsAOC3與這十余條AOC蛋白序列進行多重比較并用MEGA 5.10軟件構建系統進化樹，可以看出，這17條蛋白序列明顯地聚為2類：CsAOC3與甜瓜、大豆、擬南芥、煙草等為第1類，其中黃瓜與同屬葫蘆科作物的甜瓜親緣關系非常接近；菜豆、葡萄則為第2類。

在低氮脅迫條件下的表達分析

在播種37 d后對低氮處理、正常氮處理的2個黃瓜品系D0328、D0422的第3張葉片進行取材，提取總RNA，進行反轉錄獲得cDNA。利用qRT-PCR技術對CsAOC3在低氮脅迫條件下2個耐低氮能力不同的黃瓜品系葉片中的表達情況進行分析。圖5表明，在耐低氮強的黃瓜品系D0328中，與正常氮處理相比，CsAOC3在低氮脅迫條件下的表達量明顯上調，提高了11倍多；在耐低氮能力弱的黃瓜品系D0422中，低氮脅迫條件與正常氮條件下的CsAOC3表達量并沒有明顯變化。

3討論與結論

本研究首先利用PCR技術，從黃瓜葉片中擴增獲得丙二烯氧化物環化酶基因的cDNA全長。通過保守結構域分析表明，該基因編碼植物丙二烯氧化物環化酶超家族蛋白；其氨基酸序列與其他植物AOC基因編碼的氨基酸序列同源性較高，其中與同屬葫蘆科的甜瓜同源性最高。而且進化分析表明，該蛋白與多數作物親緣關系較近，符合植物進化規律。

丙二烯氧化物環化酶（AOC，E 5.3.99.6）可以將不穩定的丙二烯氧化物衍生物轉變為12-氧-植物二烯酸還原酶（12-oxo-phytodienoic acid，簡稱OPDA），進而促進茉莉酸基本結構的形成[7，9]，因此AOC被視為茉莉酸合成中極其重要的酶。許多研究已經證明，茉莉酸是一種植物適應多種逆境的重要激素之一[14-17]。因此涉及茉莉酸合成和信號的基因也逐漸被研究，如擬南芥、番茄、水稻、玉米等[16-19]。

目前，盡管AOC基因在不同作物中已有較為廣泛的研究，但是關于該基因對低氮響應的研究尚不明確。現有研究表明，茉莉酸、乙烯能夠調控硝酸鹽轉運蛋白AtNFP7.2、AtNPF7.3，從而影響和調節植物的氮素吸收和轉運[20]。本研究對[WTBX][STBX]CsAOC3[WTBZ][STBZ]在低氮脅迫條件下的表達進行分析，發現該基因在低氮條件下的耐低氮黃瓜品系中的表達量顯著上調，而在耐低氮弱的黃瓜品系中表達量幾乎不變，說明該基因是在耐低氮品系中特異上調表達的基因，暗示2個黃瓜品系之所以有耐低氮能力差異，可能是由于二者在低氮脅迫時，對于氮素吸收的能力有明顯差異引起的，也就是說，對于耐低氮品系D0328來說，低氮脅迫會激發它通過的迅速上調表達來促進茉莉酸合成，從而增強氮素的吸收能力；而耐低氮弱品系STBZ]則沒有作出相應反應。Wang等最近研究發現，陸地棉基因過表達可增強擬南芥對銅的耐受性[21]，因此該基因可能會對植物營養脅迫作出響應。

目前，關于黃瓜耐低氮相關基因的報道較少。本研究通過克隆獲得了并對它在低氮脅迫下的響應作了初步檢測，證明該基因是耐低氮黃瓜品系中特異上調表達基因，這一結論將為后續研究黃瓜耐低氮生理及分子機制提供思路和線索，也為下一步利用轉基因技術提高黃瓜耐低氮能力奠定了基礎。

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