1株高產甘油酸菌株的篩選與鑒定

方亞坤 周配++張磊++趙不思 +劉宇鵬

摘要：利用平板顯色法，從腐爛的水果中篩選出1株能夠轉化甘油產生甘油酸的菌株。根據生理生化、形態學鑒定以及16S rDNA基因序列結果的分析，確定該菌株的生物學分類地位。該菌株屬于醋酸桿菌科（Acetobacteraceae）葡萄糖酸桿菌屬（Gluconobacter）日本葡萄糖酸桿菌（Gluconobacter japonicus），將其命名為HD1025。初步發酵試驗表明，該菌株能夠以 150 g/L 甘油為底物生產49.47 g/L的甘油酸。

關鍵詞：甘油酸；甘油；生理生化；醋酸桿菌；平板顯色法

中圖分類號： S182文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）04-0224-03

甘油酸（2，3-二羥基丙酸）存在于自然界各種各樣的植物中，它作為一種中間代謝物同樣也存在于人體內。甘油酸及甘油酸的衍生物具有很多生物學功能：在人體內D-甘油酸能使胃部細胞在一定劑量乙醇刺激后增強活力從而促進乙醇分解代謝，因此它可以作為解酒藥成分[1]；據報道，在狗體內的甘油酸具有膽固醇活性和肝興奮劑的功能，甘油酸衍生的酯類低聚物能表現出抗胰蛋白酶活性[2]。同時，甘油酸由于自身生物可降解性優于其他的一些高聚物，可用作藥物的運輸載體。在食品方面，甘油酸同樣具有很多用途。

甘油酸的生產方法有化學法和生物法2種，目前市場上銷售的甘油酸大部分是通過化學方法生產而來的，化學方法與生物法相比，具有成本高、耗能大、產量低并且不具有立體選擇性等缺點。利用微生物發酵法生產甘油酸，環境溫和、產量高、方法簡便而且產物具有立體選擇性，因此被廣泛關注。但是，目前國外關于生產甘油酸菌株的報道較少，1987年日本報道泰國葡萄糖酸桿菌Gluconobacter thailandicus NBRC 3172、氧化葡萄糖酸桿菌G. oxydans NBRC 3292、氧化葡萄糖酸桿菌G. oxydans NBRC 3294、弗拉托葡萄糖酸桿菌G. frateurii NBRC 3262生產甘油酸產量分別為27.2、36.0、32.6、57.2 g/L[3-5]。Sato等報道利用熱帶醋酸桿菌Acetobacter tropicalis NBRC 16470、弗拉托葡萄糖酸桿菌G. frateurii NBRC 103465等菌株生產甘油酸，其中部分菌株產量可達100 g/L以上[6]。然而，到目前為止國內還未見有關甘油酸發酵方面的報道。

本研究在國內首次報道從腐爛的水果中篩選到1株能夠利用甘油發酵生產甘油酸的菌株，并對其進行形態學、生理生化鑒定以及16S rDNA基因序列分析，確定它屬于醋酸桿菌科葡萄糖酸桿菌屬，將其命名為HD1025。

1材料與方法

1.1菌株與培養基

1.1.1菌株

日本葡萄糖酸桿菌（Gluconobacter japonicus） HD1025由筆者所在實驗室從腐爛的水果中分離獲得。

1.1.2培養基

平板篩選培養基：甘油15%、蛋白胨 0.9%、酵母粉0.1%、K2HPO4 0.01%、KH2PO4 0.09%、MgSO4·7H2O 0.1%、溴甲酚紫0.05%、瓊脂2%，pH值6.5～7.0。

斜面保藏培養基：葡萄糖0.5%、蛋白胨0.5%、酵母粉0.5%、MgSO4·7H2O 0.1%、瓊脂2%，pH值6.5～7.0。

種子培養基：葡萄糖0.5%、蛋白胨0.5%、酵母粉05%、MgSO4·7H2O 0.1%，pH值6.5～7.0。

發酵培養基：甘油15%、蛋白胨0.9%、酵母粉0.1%、K2HPO4 0.01%、KH2PO4 0.09%、MgSO4·7H2O 0.1%、CaCO3 2%，pH值6.5～7.0。

上述培養基中種子培養基和斜面培養基是在115 ℃下滅菌30 min，篩選培養基和發酵培養基在121 ℃下滅菌30 min。每個試驗做3個重復，取平均值并計算誤差。

發酵罐培養條件：400 r/min，裝液量為3 L，通氣量為 1 L/（L·min），30 ℃。

1.2菌株的分離與篩選

在河南省開封市區內取樣，樣品包括污水、淤泥、腐爛的水果和蔬菜、地表土樣、蜂蜜等。將取得的樣品粉碎，取10 g樣品加入到90 mL無菌水中，在搖床中振蕩1 h。取菌懸浮液，稀釋成一系列濃度梯度。取10-5、10-6、10-7等3個梯度0.2 mL懸浮液涂布于平板篩選培養基上，30 ℃培養3～4 d。挑取菌落周圍培養基顏色由紫色變成黃色的菌株，分別接種于斜面培養基和發酵罐發酵培養基進行初篩，220 r/min、[JP+1]30 ℃，好氧培養72 h。取72 h后的發酵液，測定甘油酸含量。選取初篩產量較高的菌株接種在發酵培養基進行復篩，培養條件和初篩相同。取72 h發酵液測定甘油酸和殘留的甘油含量。選取甘油酸高產菌株進行斜面保存，進行下步試驗。[JP]

1.3分析測定

采用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，簡稱HPLC）測定發酵液中甘油酸、甘油含量[7-8]。

檢測條件：1515泵、2489紫外檢測器（檢測波長 210 nm）、2414示差檢測器、1500柱溫箱、2707自動進樣器。色譜柱型號：Aminex HPX-87H色譜柱（300 mm×7.8 mm，9 μm）；柱溫60 ℃；流動相為5 mmol/L H2SO4、20%乙腈；流速0.3 mL/min；進樣量20 μL。

1.4菌種鑒定

1.4.1細胞形態特征

菌落形態觀察：取試管斜面上的菌體平板劃線制備單菌落，挑取單菌落接在種子培養基上，30 ℃搖瓶好氧培養24 h，取種子培養液梯度稀釋至合適倍數后，將稀釋液涂布于平板培養基上，30 ℃培養4 d得到單菌落，觀察菌落外形及特征。

掃描電鏡觀察：取試管斜面上的菌體平板劃線制備單菌落，挑取單菌落樣品制成菌懸液然后制片，制作方法如下：（1）將菌液在6 000 r/min下離心6 min后，用0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液清洗3次；（2）將菌體經火焰固定于蓋玻片上；（3）將蓋玻片置于盛有2.5%戊二醛溶液的染盆中，固定1.5 h；（4）取出蓋玻片用乙醇（30%、50%、70%、90%、100%，依次脫水15 min；（5）噴金儀中噴金；（6）掃描電鏡觀察及拍照。

1.4.2生理生化特征鑒定

根據《伯杰氏手冊》《常見細菌系統鑒定手冊》，選取幾種特征性生理生化項目進行鑒定[9-10]。

1.4.316S rDNA基因序列分析

委托寶生物工程（大連）有限公司進行DNA測序；在NCBI網站上用BLAST檢索 GenBank 中相關菌株的16S rDNA基因序列，下載同源性最高的序列，用BioEdit 7.0軟件編輯后再使用MEGA 4.0軟件進行系統發育分析，確定該菌的分類地位。

1.5遺傳穩定性試驗

采用群體傳代的方法，傳接10代后，檢測搖瓶發酵液中甘油酸的含量，與第1代相比，觀察菌株發酵性能的變化，確定遺傳穩定性，是否適用于工業生產。

2結果與分析

2.1甘油酸產生菌株的分離和篩選

按照“1.2”節的方法采集樣品分離純化菌株，根據“1.3”節的檢測方法，檢測發酵液中甘油酸的含量。初步分離共得到25株能夠氧化甘油產生甘油酸形態各異的菌株，不同菌株形成的變色圈大小不同，初步表明它們產酸能力的大小，再利用搖瓶發酵對25株菌株進行復篩。檢測發酵液中產物甘油酸、副產物二羥基丙酮和剩余底物甘油的含量。在腐爛的水果中篩選出1株產量較高的菌株，其產量初步發酵達到2203 g/L，將其命名為HD1025。

2.2培養特征和形態觀察[HT]

按照“1.4.1”節的方法，將菌懸液涂布于篩選培養基上，30 ℃培養4～5 d，菌落的培養特征：菌落較小，濕潤，圓形，不透明，白色，直徑可達0.5～1.0 cm（圖1）。掃描電鏡觀察細胞形態特征：細胞呈短圓桿狀，無鞭毛，不運動。

2.3生理生化鑒定

由表1中HD1025菌株的生理生化試驗結果可見：革蘭氏染色、接觸酶、氧化酶、還原硝酸鹽、液化明膠、產吲哚、氧化乙醇到乙酸、氧化乙酸鹽生成長CO2和H2O、多醇類生酮、水解淀粉、D-木糖產酸、D-葡萄糖產酸等屬間特征生理生化反應結果鑒定該菌株屬于葡萄糖酸桿菌屬（Gluconobacter），根據形成5-酮基葡萄糖酸、[JP+1]甘油產甘油酸、利用D-阿拉伯糖醇生長、利用赤蘚糖醇生長等種間生理生化特性鑒定該菌株與弗拉托葡萄糖酸桿菌（Gluconobacter frateurii）存在一定的區別，與日本葡萄糖酸桿菌（Gluconobacter japonicus）類似[11-14]。[JP]

2.4基因序列分析及其系統發育分析

經過對HD1025的16S rDNA基因測序，獲得1 398 bp長度的基因序列，將該序列提交GenBank（登記號為KT964237），對相關數據進行相似性分析，然后采用BioEdit 7.0軟件編輯后再使用MEGA 4.0軟件構建進化樹分析。由圖3可知，HD1025與日本葡萄糖酸桿菌（Gluconobacter japonicus）（相似度100%）和弗拉托葡萄糖酸桿菌（Gluconobacter frateurii）（相似度99.86%）的親緣關系較近，然而試驗表明，HD1025與弗拉托葡萄糖酸桿菌菌株在部分生理生化試驗上仍有不同，而與日本葡萄糖酸桿菌親緣關系最接近。因而，最終將該菌種確定為日本葡萄糖酸桿菌（Gluconobacter japonicus），擬將該菌株命名為2.6菌株G. japonicus HD1025發酵罐發酵曲線

在“1.1.2”節給出的條件將菌株HD1025發酵72 h，甘油酸產量達到49.47 g/L，殘余底物含量為 92.22 g/L（圖4）。

3討論

目前，國外關于微生物法生產甘油酸報道較多的是弗拉托葡萄糖酸桿菌（Gluconobacter frateurii）、弱氧化葡萄糖酸桿菌（Gluconobacter suboxydans）、氧化葡萄糖酸桿菌（Gluconobacter oxydans）等菌株，其中弗拉托葡萄糖酸桿菌（Gluconobacter frateurii）[CM（18]菌株產甘油酸的能力較強，但在生產甘油

酸的過程中會受到底物甘油的抑制。到目前為止，國內外尚未有利用日本葡萄糖酸桿菌（Gluconobacter japonicus）菌株進行甘油酸生產的報道。

本試驗從腐爛水果中篩選出1株能夠氧化甘油生產甘油酸的菌株。經形態學鑒定、生理生化試驗和16S rDNA基因序列分析，將該菌株命名為日本葡萄糖酸桿菌（Gluconobacter japonicus）。該菌株可以耐高濃度甘油，在150 g/L的初始甘油濃度下生長良好。該菌株分批發酵72 h可產甘油酸 49.47 g/L，預計經菌種選育及發酵工藝優化后甘油酸的產量會有較大的提升，具有很好的工業化應用價值。

參考文獻：

[1]盧英華，陳慧敏，蒲洋，等. 一種用于生產甘油酸的熱帶醋桿菌的馴化方法：CN104263689A[P]. 2015-01-07.

[2]Habe H，Fukuoka T，Kitamoto D，et al. Biotechnological production of D-glyceric acid and its application[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2009，84（3）：445-452.