Snail、N-Cadherin、MMP-9在轉移性脊柱腫瘤中的表達及其相關性研究

劉寶軍 裴 斐 李繼華 吳艷麗 王 靜 崔永鵬

Snail、N-Cadherin、MMP-9在轉移性脊柱腫瘤中的表達及其相關性研究

劉寶軍 裴 斐 李繼華 吳艷麗 王 靜 崔永鵬

目的 研究Snail、N-Cadherin、MMP-9在轉移性脊柱腫瘤中的表達及其相關性。方法 選取轉移性脊柱腫瘤標本70例為研究組，患者術前均未行放化療或生物治療。另選取70例正常組織(脊柱腫瘤病灶旁正常組織)標本為正常組。采用S-P免疫組織化學染色方法，對標本中Snail、N-Cadherin、MMP-9表達進行檢測，并分析其相關性。結果 Snail、N-Cadherin、MMP-9陽性表達率研究組依次為75.71%、70.00%、90.00%。Snail表達與N-Cadherin及MMP-9表達呈正相關；N-Cadherin表達與MMP-9表達呈正相關。結論 Snail、N-Cadherin、MMP-9表達水平在轉移性脊柱腫瘤中均升高，呈正相關性，與轉移性脊柱腫瘤密切相關，可為臨床治療提供參考。

Snail；N-Cadherin；MMP-9；轉移性脊柱腫瘤；陽性表達率

(ThePracticalJournalofCancer,2017,32:731～734)

脊柱腫瘤是指主要多發于脊柱骨骼部位，其附屬組織存在轉移性或原發性腫瘤及瘤樣病變，脊柱腫瘤發病率為全身骨腫瘤發病率的5%，轉移性脊柱腫瘤占全身骨轉移腫瘤比例50%左右[1]。因轉移性脊柱腫瘤臨床解剖位置相對較特殊，腫瘤的生長具有侵襲性會對椎體、椎旁組織、附件等直接造成破壞，脊柱穩定性喪失多累及神經根、骨髓等主要結構，嚴重時將導致患者出現神經功能障礙、癱瘓甚至死亡，對患者生存質量及生命安全造成威脅[2]。近年來臨床相關研究表示[3]，Snail、N-Cadherin、MMP-9可能與轉移性脊柱腫瘤進展及轉移存在一定關聯，均可為臨床轉移性脊柱腫瘤防治提供新思路新方法。本研究主要對Snail、N-Cadherin及MMP-9的表達情況進行檢測，對3者相關性進行分析，旨在為臨床治療轉移性脊柱腫瘤提供有參考價值的分子生物學指標，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 一般材料

選取我院2010年9月至2015年6月轉移性脊柱腫瘤標本70例為研究組，另選70例脊柱腫瘤病灶旁正常組織標本為對照組，本研究所選轉移性脊柱腫瘤原發病均為胃癌，分別對患者臨床資料及病理分型分期、侵襲轉移情況進行分析。

1.2 主要試劑與儀器

本研究所用鼠抗人N-Cadherin單克隆抗體、兔抗人Snail單克隆抗體、兔抗人MMP-9單克隆抗體、DAB顯色劑及檸檬酸鹽緩沖粉劑，均選購于北京中杉金橋生物科技有限公司。中性樹膠由北京中山生物科技有限公司提供。包埋模具及防脫玻片選自武漢博士德生物制品有限公司。脫色搖床TS-2000A由海門市其林貝爾儀器有限公司提供，OLYMPUS BX51正置熒光顯微鏡選購于日本OLYMPUS公司。

1.3 方法

1.3.1 HE染色 使用二甲苯常規脫蠟，切片借助梯度酒精清洗至水化；將切片采用蘇木精染色，浸泡時間為10～15 min，之后水洗；采用1%鹽酸酒精進行分化，時間為2～5 s，水洗及飽和碳酸鋰藍化數秒，之后借助流水進行沖洗，水洗時間控制在15～30 min；借助1%醇溶性伊紅浸染，時間5～15 s，后行常規脫水、透明并封片。

1.3.2 免疫組化方法 采用SP免疫組化染色方法進行實驗：①切片置于60 ℃條件下2 h，借助二甲苯脫蠟并使用酒精梯度水化；②抗原修復；③切片上均滴一滴3%過氧化氫溶液，室內孵育10 min，PBS沖洗，每次5 min，共3次；④切片滴加動物血清(非免疫性)防治溫室進行孵育，時間10 min，無需沖洗；⑤滴加一抗室溫孵育1 h，PBS沖洗同時；⑥滴加二抗室溫孵育10 min，PBS沖洗；⑦滴加鏈霉素-生物素-過氧化酶，室溫孵育10 min，PBS沖洗；⑧滴加DAB溶液顯色，控制顯色時間，借助顯微鏡隨時觀察；⑨水沖洗后實施復染并使用中性樹膠封固，借助顯微鏡觀察；⑩以PBS溶液為一抗進行陰性對照，正常組組織為陽性對照。

1.4 結果觀察及判定方法

每個切片均隨機選取高倍視野(400倍)5個，各視野分別觀察100個細胞，計算其中陽性細胞平均數，即為待測蛋白陽性細胞平均表達率。

Snail陽性表達為細胞核呈棕黃色；MMP-9以胞質、胞膜呈棕黃色或黃色為陽性表達；N-Cadherin表達以細胞質近細胞膜部位、細胞膜棕黃色判定為陽性細胞；根據染色深淺計分，無染色為0分、弱染色為1分，強染色為2分。根據陽性細胞表達率進行評估，1%～25%為陰性，26%～100%為陽性。

1.5 統計學方法

應用SPSS 20.0統計學分析軟件進行數據處理，Snail、N-Cadherin、MMP-9在兩組所得數據等計數資料均用率(%)描述，采用χ2進行檢驗；借助Spear man分析組間相關性；組間兩兩進行對比，以P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Snail、N-Cadherin、MMP-9在正常及轉移性脊柱腫瘤組織中的表達

細胞核或胞質出現棕黃色為Snail免疫組化陽性表達。Snail陽性表達率，研究組高于正常組(P<0.05)，見表1。

表1 兩組組織中Snail表達情況/例

細胞膜及細胞質近細胞膜部位出現棕黃色為N-Cadherin免疫組化陽性表達。研究組N-Cadherin表達率明顯高于正常組(P<0.05)，見表2。

表2 兩組組織中N-Cadherin表達情況/例

以胞質、胞膜呈黃色或棕黃色為MMP-9陽性表達。兩組MMP-9陽性表達率相比，研究組高于正常組(P<0.05)，見表3。

表3 兩組組織中MMP-9表達情況/例

2.2 轉移性脊柱腫瘤中Snail、N-Cadherin、MMP-9表達相關性

70例轉移性脊柱腫瘤標本中，N-Cadherin陽性表達49例，其中43例與Snail共同表達為陽性，比率為87.76%。Snail表達與N-Cadherin表達呈正相關，γ=0.732，見表4。

70例轉移性脊柱腫瘤標本中，MMP-9陽性表達共63例，其中49例與Snail共同表達為陽性，比率為77.78%。Snail表達與MMP-9表達呈正相關，γ=0.674，見表5。

表4 轉移性脊柱腫瘤中Snail、N-Cadherin表達的關系/例

表5 轉移性脊柱腫瘤中Snail、MMP-9表達的關系/例

70例轉移性脊柱腫瘤標本中，MMP-9陽性表達共63例，其中46例與N-Cadherin共同表達為陽性，比率為73.02%。N-Cadherin表達與MMP-9表達呈正相關，γ=0.657，見表6。

表6 轉移性脊柱腫瘤中N-Cadherin、MMP-9表達的關系/例

3 討論

轉移性脊柱腫瘤可直接對患者脊椎骨質造成侵襲，破壞脊柱生物力學穩定性，具有極大危害性，該病癥致殘率及致死率均較高[4]。相關研究表明[5]，胃癌引發轉移性脊柱腫瘤患者術后腫瘤轉移、復發的風險較高，會為患者造成極大痛苦，且二次手術治療難度大[6]。相關研究認為[7]，對轉移性脊柱腫瘤患者Snail、N-Cadherin、MMP-9表達進行檢測分析，可為臨床疾病診療提供新的依據。

Snail蛋白是Snail家族中被發現的第一個蛋白，其抑制活性主要由氨基端區域結構與指結構決定，Snail蛋白表達升高會對腫瘤細胞轉移及侵襲起進一步促進作用[8]。國外學者實驗結果證實[9]，Snail蛋白表達作用在淋巴結狀況及乳腺癌組織分級中關系密切。目前越老越多研究結果顯示[10]，Snail蛋白表達強度可展示出腫瘤侵襲能力。本研究結果顯示，Snail免疫組化陽性表達為胞漿、細胞核顯示棕黃色，研究組Snail陽性表達高于正常組差異顯著。

N-Cadherin多見于神經中、外胚層組織中[11]。相關前列腺癌、乳腺癌研究[12]認為，N-Cadherin蛋白表達反常會加快腫瘤浸潤及轉移，可使癌細胞轉化為浸潤性惡性表型，其作用較直接切明顯，提示N-Cadherin蛋白與腫瘤轉移及侵襲密切相關，會對腫瘤患者預后造成直接影響。本研究結果顯示，研究組N-Cadherin表達高于正常組，表明轉移性脊柱腫瘤中N-Cadherin陽性表明較多。

MMP-9基因約長4.5kb，位于人體染色體20q12.1-q13.1部位，在金屬蛋白酶家族中加重中所占分子最大，其作用底物較多包括：多類型膠原、纖維粘連蛋白、彈性蛋白等[13]。MMP-9蛋白主要因巨噬細胞、毛細血管內皮細胞、中性粒細胞等間質細胞及惡性腫瘤細胞酶原形式分泌產物，主要功能為破壞細胞基底膜穩定；對細胞外基質Ⅳ、Ⅴ型膠原進行降解；協助腫瘤細胞浸潤；促進形成新生血管及毛細血管內皮細胞再生，對腫瘤生長起擴展作用[14]。相關研究表明[15]，MMP-9蛋白表達與多類型癌癥侵襲、生長及轉移成正相關。與本研究結果相似，研究組MMP-9陽性表達高于正常組，表明MMP-9表達與轉移性脊柱腫瘤有關。

本研究結果顯示，70例轉移性脊柱腫瘤標本中，Snail陽性表達53例，N-Cadherin陽性表達49例，MMP-9陽性表達63例。研究組Snail、N-Cadherin、MMP-9陽性表達均高于正常組。表明，Snail、N-Cadherin、MMP-9表達與轉移性脊柱腫瘤進展存在一定關聯。43例(87.76%)Snail與N-Cadherin共同表達為陽性，兩者陽性表達呈正相關聯。63例(77.78%)MMP-9與Snail共同表達為陽性，呈正相關聯。可證實，Snail表達輕度可對腫瘤侵襲能力進行判斷，其表達程度高低可作為臨床判斷轉移性脊柱腫瘤預后預測的標志物，并提示轉移性脊柱腫瘤對N-Cadherin表達的敏感性相對較高。MMP-9與N-Cadherin共同表達為陽性例數為46例(73.02%)，呈正相關聯。可表明MMP-9表達程度越高對腫瘤生長促進作用越大，Snail、N-Cadherin、MMP-9 3者間關系均呈正相關聯，存在互相推動增強的作用，可作為臨床診療轉移性脊柱腫瘤的分子生物學指標。

綜上所述，Snail、N-Cadherin、MMP-9表達與轉移性脊柱腫瘤關系密切，可作為評價腫瘤情況的指標，但本研究不排除因操作者主觀意識造成的陽性細胞統計數據誤差，可能對研究結果造成影響。

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(編輯：吳小紅)

Research on Expressions and Correlations of Snail,N-Cadherin and MMP-9 in Metastatic Spinal Tumors

LIUBaojun,PEIFei,LIJihua,etal.

KailuanGeneralHospital,Tangshan,063000

Objective To study the expression and correlation of Snail,N-cadherin and MMP-9 in metastatic spinal tumors.Methods 70 cases of metastatic spondyloma were selected as the study group.No patients were treated with chemotherapy or biotherapy before operation.Another 70 cases of normal tissue (normal tumor tissue adjacent to the tumor) specimens were the normal group.The expression of Snail,N-cadherin and MMP-9 in the samples were detected by S-P immunohistochemical staining,and the correlation was analyzed.Results The positive expression rates of Snail,N-Cadherin and MMP-9 were 75.71%,70.00% and 90.00% respectively.Snail expression was positively correlated with N-cadherin and MMP-9 expression;N-cadherin expression was positively correlated with MMP-9 expression.Conclusion The expression of Snail,N-Cadherin and MMP-9 is up-regulated in metastatic spondyloma,which is closely related to metastatic spine tumor and can provide reference for clinical treatment.

Snail;N-Cadherin;MMP-9;Metastatic spinal tumors;Positive-expression rate

063000 開灤總醫院(劉寶軍，裴 斐，李繼華，王 靜，崔永鵬)；063000 河北省唐山市路北區疾控中心(吳艷麗)

吳艷麗

10.3969/j.issn.1001-5930.2017.05.011

R738.1

A

1001-5930(2017)05-0731-04

2016-07-06

2017-03-28)