外周血CD3+、CD4+、CD8+、CD19+水平與喉癌患者預后的相關性

張國順 黃曉陽 李守民

外周血CD3+、CD4+、CD8+、CD19+水平與喉癌患者預后的相關性

張國順 黃曉陽 李守民

目的 探討喉癌患者免疫水平的變化與病情進展的關系。方法 選取56例喉癌患者，用流式細胞儀檢測不同分組的喉癌患者外周血淋巴細胞和NK細胞的表達水平。結果 手術后患者CD19+顯著性下降(P<0.05)，而NK細胞顯著上升(P<0.05);有淋巴結轉移的患者比無淋巴結轉移的患者NK細胞上升，CD4+下降，二者均有統計學差異(P<0.05)；病理分期中Ⅲ～Ⅳ期的患者比Ⅰ～Ⅱ期表現出CD19+顯著性下降(P<0.05)，CD4+則顯著上升(P<0.05)。在術后隨訪18個月中，有復發或轉移的患者比無轉移且無復發患者CD4+下降，而NK細胞和CD19+上升，均具有統計學差異(P<0.05)。結論 喉癌患者免疫狀態和病情之間有一定的聯系。

喉癌；細胞免疫；NK細胞；流式細胞術

(ThePracticalJournalofCancer,2017,32:735～737)

喉癌(laryngeal cancer)是耳鼻咽喉頭頸外科中常見的惡性腫瘤。近年來，在我國北方其新發病例數和死亡人數逐年增加，發病率和死亡率亦居高不下[1]。癌細胞淋巴結轉移是導致惡性腫瘤復發和死亡的主要原因，同時也是影響喉癌患者預后的主要因素。研究顯示[2]，細胞免疫在抗腫瘤免疫應答中發揮重要作用，它通過功能不同的T細胞亞群完成免疫調控。CD8+淋巴細胞介導細胞毒效應在抗腫瘤免疫中起主要作用。CD4+細胞在細胞免疫和體液免疫起協助作用，CD3+僅存在于T細胞表面，故用作外周血所有成熟的T淋巴細胞的標記，CD19+則用作標記B淋巴細胞，NK細胞(natural killer cell)亦在細胞免疫中發揮重要作用。故本研究采用流式細胞術對56例喉癌患者術前和術后的外周淋巴細胞(CD8+、CD3+、CD4+、CD19+)以及自然殺傷細胞(NK細胞)的表達進行檢測，從而探討細胞免疫狀態與病情的關系。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

選取2012年6月至2014年6月在我院就診的喉癌患者共56例，其中男性47例，女性9例，年齡42～79歲，平均59.2歲；所有患者經手術后病理切片證實均為鱗狀細胞癌，按國際喉鱗狀細胞癌TMN分期法可分為：Ⅰ～Ⅱ期16例，Ⅲ～Ⅳ期40例；根據術后病理是否有淋巴結的轉移分為有淋巴轉移47例，無淋巴結轉移9例。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器 COULTERRQ-PREP自動溶血儀、EPICS XL/XL-MCL流式細胞儀，均為美國Beckman公司產品。

1.2.2 試劑 鼠抗人單克隆抗體：CD8/CD45/CD4/CD3、CD45/CD19/CD(16±56)/CD45，肝素。所有試劑均為美國Beckman公司產品。

1.3 方法

喉癌患者均于術前及術后清晨空腹時，用真空采血管抽取外周血2.0 ml，肝素抗凝。取100 μl抗凝全血后分別加入CD8/CD45/CD4/CD3、CD45/CD19/CD(16±56)/CD45熒光標記的單克隆抗體2 μl，混勻。室溫暗處反應30 min后加入細胞裂解液2.0 ml，待溶血后洗滌，用流式細胞儀檢測NK細胞，CD19+、CD8+、CD4+及CD3+，根據二維雙參數點圖，先設“門框”于CD45細胞，對熒光標記的細胞數量進行分析，計算以下細胞表達百分比：CD8+、CD4+、CD3+、CD3+/CD16+CD15+、CD3+/CD19+以及CD4+/CD8+比值；術后隨訪18個月，觀察統計患者是否有轉移、復發，隨訪率為100%。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 喉癌患者手術前后淋巴細胞表達水平的比較

相比于手術前，手術后NK細胞表達水平升高，CD19+細胞表達水平降低，差異均有統計學意義(P<0.05);而其它指標相比于術前無明顯改變(P>0.05)，見表1。

表1 喉癌患者手術前后淋巴細胞表達水平的比較±s)

2.2 有無淋巴結轉移的喉癌患者淋巴細胞表達水平的比較

與無淋巴結轉移患者比較，有淋巴結轉移的喉癌患者CD4+細胞表達水平下降，其NK細胞表達水平明顯增高，差異均有統計學意義(P<0.05)；而其它指標無明顯差異，P>0.05，見表2。

表2 喉癌患者有無淋巴結轉移淋巴細胞表達水平 的比較

2.3 不同病理分期喉癌患者淋巴細胞表達水平比較

根據流式細胞儀結果可知，Ⅰ～Ⅱ期患者相比于Ⅲ～Ⅳ期喉癌患者CD19+細胞水平明顯增高及CD4+細胞水平明顯下降，差異均有統計學意義(P<0.05);其它指標二者相比無明顯差異，P>0.05，見表3。

表3 不同分期喉癌患者淋巴細胞表達水平 的比較

2.4 是否轉移、復發的喉癌患者淋巴細胞表達比較

術后隨訪18個月，56例患者中有15例出現轉移和復發現象。相比無轉移或復發患者，有轉移或復發患者中的CD19+、NK細胞均明顯增高，其CD4+細胞表達水平明顯降低(P<0.05);而其它指標相比于無轉移或復發患者組無顯著差異，P>0.05，見表4。

表4 有復發或轉移與無轉移且無復發的喉癌患者淋巴細胞 表達水平的比較±s)

3 討論

流式細胞儀通過分析上萬個細胞的側向角散射、前向角散射和及光信號等參數，從而檢測外周血淋巴細胞亞群的改變而動態評估機體免疫功能，從而反映腫瘤細胞的活性。對腫瘤患者進行機體免疫狀態的檢測具有便捷、快速、敏感且準確的特點，故其在評價療效及判斷預后中具有重要價值[3]。

從免疫學角度分析，機體具有自我免疫監視的功能，故可以及時清除癌變細胞，但腫瘤患者機體的腫瘤免疫逃逸作用及患者免疫監視系統的失調，而導致了腫瘤的發生、發展。在機體抗腫瘤免疫作用中，主要以T細胞、NK細胞和MΦ細胞的細胞免疫發揮重要作用[4-5]。有研究表明[6]，在喉癌患者中其外周血 CD8+淋巴細胞表達率明顯高于常人，比較不同病理分級患者，CD8+細胞亦有顯著性差異。再者，患者CD4+/CD8+比值顯著性低于常人。故本研究通過檢測外周血淋巴細胞亞群的變化以了解機體細胞免疫狀態，從而判斷患者細胞免疫與預后之間的關系。

本研究通過對喉癌患者外周血T淋巴細胞亞群的測定，我們發現，有淋巴結轉移的喉癌患者外周血CD4+細胞表達水平比無淋巴結轉移患者下降(P<0.05)；在不同病理分期中同樣也觀察到，病理分期Ⅲ～Ⅳ期喉癌患者的CD4+水平低于Ⅰ～Ⅱ期(P<0.05)；此現象在術后18個月內有轉移或復發的患者也顯著低于無轉移且無復發患者(P<0.05)，且比較文獻，喉癌患者的CD8+細胞表達水平均高于健康常人，故可知，CD4+/CD8+比值高于健康常人。此外可觀察到Ⅲ～Ⅳ期CD19+顯著性低于Ⅰ～Ⅱ期(P<0.05)，故可推測，因癌癥的發生，患者的免疫功能抑制加重，細胞免疫受破壞同時體液免疫也呈現減弱趨勢。細胞免疫受到抑制，隨之其對癌細胞的清除能力也隨之降低，從而也導致腫瘤的進一步發展。

自然殺傷細胞(NK細胞)又稱大顆粒淋巴細胞(large granular lymphocytes，LGL)，是參與機體天然免疫的主要細胞，具有抗腫瘤、抗感染和免疫調節等功能[7]。NK細胞表面表達的抑制性殺傷細胞免疫球蛋白樣受體(inhibitory killer cell immunoglobulin-like receptor,KIR)和活化性受體NKG2D是調節NK細胞殺傷活性的主要受體。NK細胞表面的活化性受體(KIR)與腫瘤細胞表面的相應配體結合，從而激活NK細胞對腫瘤細胞的殺傷活性。NK細胞對腫瘤細胞的殺傷作用取決于這兩種受體識別相應配體后的綜合作用結果[8]。NK 細胞不依賴抗體和補體，同時也不受主要組織相容復合物的限制，它通過分泌IL-2、GM-CSF、IFN-α和IFN-γ等細胞因子從而直接殺傷腫瘤細胞，成為腫瘤免疫的第一道防線。

本研究通過對喉癌患者自然殺傷細胞的檢測，可以發現，相比于手術前，手術后喉癌患者的NK細胞顯著性增高(P<0.05)，同樣，對于有淋巴結轉移的患者其NK細胞表達亦顯著性增高(P<0.05)，在術后隨訪18個月中，發現有轉移或復發的喉癌患者的NK細胞表達也顯著性增高(P<0.05)，這些表明NK 細胞與腫瘤的進展之間具有一定關系。

機體的免疫機制會對腫瘤細胞做出應對，同時腫瘤對機體的抗腫瘤免疫功能產生影響，可知腫瘤的發生發展與免疫功能的強弱間具有一定的內在聯系。本研究通過流式細胞儀對NK細胞，CD19+、CD8+、CD4+及CD3+監測，可有效地觀察喉癌患者某一階段的免疫功能的變化，對于喉癌患者的治療和預后情況具有一定的臨床意義。

[1] 劉權忠.CO2激光喉鏡顯微手術治療早期聲門型喉癌療效觀察〔J〕.安徽醫藥,2015,19(6):1167-1168.

[2] Elinav EL,Nowarski R,Thaiss CA,et al.Inflammation-induced cancer:crosstalk between tumours,immune cells and microorganisms〔J〕.Nat Rev Cancer,2013,13(11):759-771.

[3] 張艷橋.腫瘤自體細胞免疫治療的臨床應用情況〔J〕.中國醫院用藥評價與分析,2012,12(2):99-100.

[4] 陳 海,毛建平.腫瘤免疫逃逸與T淋巴細胞關系的研究進展〔J〕.中國生物工程雜志,2012,32(10):74-79.

[5] Mallappa S,Sinha A,Gupta S,et al.Preoperative neutrophil lymphocyte ratio greater than five is a prognostic factor for recurrent colorectal cancer〔J〕.Colorectal Dis,2013,15(21):323-328.

[6] 吳姍姍,嚴 峰,鄧玉玲，等.小細胞和非小細胞肺癌晚期患者CD3+、CD4+及CD3+、CD8+T 淋巴細胞亞群的差異〔J〕.中國免疫學雜志,2015,31(2):114-121.

[7] Pietra G,Manzini C,Vitale M,et al.Natural killer cells kill human melanoma cells with characteristics of cancer stem cells〔J〕.Int Immunol,2009,21(7):793-801.

[8] 趙 艷,陳 偉.Pim-1激酶對小鼠CD4CD4,CD4,CD4,CD4.CD4CD4+T細胞分化的影響〔J〕.腫瘤藥學,2016,6(1):35-38.

(編輯：甘 艷)

Relationship between the Levels of Peripheral Blood CD3+,CD4+,CD8+,CD19+and Prognosis of Laryngeal Cancer

ZHANGGuoshun，HUANGXiaoyang，LIShoumin.

AnyangDistrictHospital,Anyang，455000

Objective To study the relationship between the changes of immunity lever and progression of disease in patients with laryngeal cancer.Methods The levels of peripheral blood lymphocytes and the level of natural killer cell(NK) in the 56 patients were determined by Flow cytometry.Results The level of CD19+decreased while the level of NK cell increased in 56 patients after surgery(P<0.05).Compared to the patients without lymph node metastasis,the patients with lymph node metastasis had a increase in the level of NK cell and a decrease in the level of CD4+.Compare to the patients with stageⅠ～Ⅱ,the patients with stage Ⅲ～Ⅳ had a increase in the level of CD4+and a decrease in the level of CD19+(P<0.05).After 18 months follow-up,the recurrent or metastatic patients had increases in the level of NK cell and the level of CD19+while had a decrese in CD4+,compared to the patients who didn’t have any recurrence or metastasis(P<0.05).Conclusion There is a certain relationship between the changes of immunity lever and progression of disease in patients with laryngeal cancer.

Laryngeal cancer;Cellular immunity;Natural killer cell;Flow cytometry

455000 河南省安陽地區醫院

10.3969/j.issn.1001-5930.2017.05.012

R739.65

A

1001-5930(2017)05-0735-03

2016-11-09

2017-03-23)