2—氨基磷酸茚處理對新疆紫草懸浮細胞次生代謝物積累的影響

呂朝耕+王升+楊婉珍+劉談+郭蘭萍

[摘要] 用不同濃度2-氨基磷酸茚（AIP），并結合茉莉酸甲酯（MeJA）處理新疆紫草懸浮細胞，測定不同處理組、不同處理時間細胞中迷迭香酸及乙酰紫草素、脫氧紫草素、β，β′-二甲基丙烯酰紫草素、異戊酰紫草素等次生代謝物的含量，考察AIP抑制苯丙氨酸通路后對紫草懸浮細胞中次生代謝物合成、積累的影響。結果顯示MeJA處理能夠明顯促進新疆紫草細胞中次生代謝物的合成積累；AIP處理能夠抑制新疆紫草細胞中上述次生代謝物的積累，并在二者聯(lián)合處理時能一定程度上抵消MeJA的促進作用，且抑制作用的強弱與處理劑量、處理時間存在正相關性。表明苯丙氨酸途徑在紫草素類化合物生物合成中具有重要作用，可為通過細胞培養(yǎng)方式生產紫草素類化合物的代謝調控及紫草素類化合物生物合成等進一步研究提供參考。

[關鍵詞] 新疆紫草；2-氨基磷酸茚；次生代謝；紫草素

Secondary metabolic responses to treatment of 2-aminoindan-2-

phosphonic acid in cell lines from Arnebia euchroma

LV Chao-geng1， WANG Sheng1， YANG Wan-zhen1，2， LIU Tan 1， GUO Lan-ping1*

（1. National Resource Center for Chinese Materia Medica， China Academy of Chinese Medical Sciences，

State Key Laboratory Breeding Base of Dao-di Herbs，Beijing 100700， China；

2. School of Traditional ChineseMedicine，Capital Medical University，Beijing 100069， China）

[Abstract] The accumulation of rosmarinic acid， acetylshikonin， deoxyshikonin， β， β′-dimethylacrylshikonin and isovalerylshikonin was investigated in cell suspension cultures of Arnebia euchroma （Royle） Johnst under the influence of 2-aminoindan-2-phosphonic acid （AIP）， an inhibitor of phenylalanine ammonia lyase （PAL）， and of the effector methyl jasmonate （MeJA）. The results showed that methyl jasmonate promoted the accumulation of rosmarinic acid and shikonin derivatives. Conversely， 2-aminoindan-2-phosphonic acid suppressed the formation of rosmarinic acid， which indicated that AIP， indeed， was able to inhibit the phenylpropanoid pathway in A. euchroma. Meanwhile， the content of total shinkonins and other four kinds of shikonin derivatives， though varied in degrees， was also inhibited. And the inhibition was dose-dependent and time-dependent. Acetylshikonin responsed most rapidly to the treatment of AIP， the content reduced after 24 h of treatment and decreased to only half of those untreated control 48 h after teratment. β， β′-Dimethylacrylshikonin， difffer from acetylshikonin， responded much slowly to the treatment， inhibition could only be observed 96 h later. These suggest that phenylpropanoid pathway plays an important role in the shikoninsbiosynthesis， and this study provides a reference for the further research in metabolic regulation of producing shikonins by cell culture technology and biosynthesis pathways of shikonin derivatives. Still， shikonins biosynthesis pathways is complicated， the exact dose- and time-effect relationship of AIP and interaction between AIP and other effectors like MeJA need further research.

[Key words] Arnebia euchroma；2-aminoindan-2-phosphonic acid；secondary metabolites；shikonin

紫草科軟紫草屬新疆紫草Arnebia euchroma （Royle） Johnst是傳統(tǒng)中藥材紫草Arnebiae Radix的重要來源，其有效成分的含量高，臨床療效好，具有廣泛的藥理作用[1]。

新疆紫草中主要次生代謝物包括萘醌類的紫草素類化合物，紫草呋喃等呋喃類化合物和迷迭香酸等酚酸類化合物[1]，其中紫草素類化合物為其主要活性成分。通常認為紫草素類化合物生物合成途徑為苯丙氨酸（PP）途徑-甲羥戊酸（MVA）途徑/甲基磷酸赤蘚糖醇（MEP）途徑的復合途徑，紫草呋喃來自于紫草素類衍生物生物合成的中間產物。迷迭香酸生物合成途徑在丹參、紫蘇等植物中研究更為清晰，目前認為迷迭香酸生物合成途徑包含了2條平行的苯丙氨酸支路和酪氨酸支路[2-4]（圖1）。

2-氨基磷酸茚（AIP）是一種苯丙氨酸的結構類似物，可以通過競爭性結合而特異性地抑制苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性，從而達到對PP途徑的抑制性調控[5-6]。在已有報道AIP處理可以抑制硬紫草中迷迭香酸合成[7]的基礎上，本實驗通過AIP處理新疆紫草紅色系懸浮細胞，考察抑制PP途徑對新疆紫草細胞中紫草素類化合物合成、積累的影響，探索PP途徑在新疆紫草紫草素合成中發(fā)揮的作用。考慮到懸浮細胞材料本身培養(yǎng)狀態(tài)與酶活性的不穩(wěn)定，避免出現(xiàn)PP途徑本身處于低活性狀態(tài)下AIP處理后出現(xiàn)假陰性結果，根據(jù)文獻報道茉莉酸甲酯（MeJA）可以增強PP途徑活性、促進新疆紫草細胞次生代謝物合成與積累[2，8]的現(xiàn)象，本研究設計考察了AIP結合MeJA處理懸浮細胞后，AIP對活性上調狀態(tài)下PP途徑的調控作用，作為參考。

1 材料

新疆紫草愈傷細胞取自中國科學院植物研究所葉和春研究員處，并由本實驗室保存并繼代為懸浮細胞。

超高效液相色譜儀（UPLC）：Waters ACQUITY UPLCTM系統(tǒng)（美國Waters公司，包括四元高壓梯度泵、真空脫氣機、自動進樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器、Empower 3色譜工作站）；UPLC Column：ACQUITY UPLC HSS T3 C18（2.1 mm × 100 mm，1.8 μm）；熒光酶標儀（Thmeral，Varioskan Flash）；電子精密天平（SartoriusBS2202S）；球磨儀（Retsch公司，MM 400混合型球磨儀）；電熱干燥箱（上海恒科儀器有限公司，DHG-9145AZ）；超聲波清洗機（寧波新芝生物科技有限公司）；及其他常規(guī)組織培養(yǎng)所需設備等。

AIP（購自愛拓化學有限公司，純度97%）；茉莉酸甲酯（購自Aldrich化學試劑公司，純度95%）；迷迭香酸、β，β′-二甲基丙烯酰紫草素（購自中國食品藥品檢定研究院），乙酰紫草素（購自上海同田生物科技公司），脫氧紫草素、異戊酰紫草素（購自日本TCI化成株式會社），純度均 ≥ 98%；色譜純甲醇、乙腈（購自Fisher Chemical公司）；培養(yǎng)基配制所需試劑等為國藥集團化學試劑有限公司產品。

2 方法

2.1 材料處理

參照已有報道及預實驗，選定20 μmol·L-1為MeJA處理濃度，20 μmol·L-1為低濃度AIP處理，200 μmol·L-1為高濃度AIP處理。AIP，MeJA以甲醇配制成母液并稀釋。以培養(yǎng)至第13天的新疆紫草紅色系懸浮細胞為材料，分別以終濃度20 μmol·L-1AIP，200 μmol·L-1 AIP，20 μmol·L-1 AIP+20 μmol·L-1 MeJA，200 μmol·L-1 AIP+20 μmol·L-1 MeJA，20 μmol·L-1 MeJA，甲醇（CK）為6個處理組處理。于處理后0，24，48，72，96 h分別取樣，真空抽濾，置平皿中于電熱干燥箱40 ℃烘干。每組設3個重復。

2.2 供試品制備

精密稱取0.02 g新疆紫草干細胞，研磨粉碎后加入1.5 mL甲醇，25 ℃超聲提取60 min，離心，取上清液，0.22 μm濾膜過濾制樣。

2.3 含量測定

2.3.1 總紫草素測定 以脫氧紫草素標定總萘醌，測定新疆紫草細胞中紫草素類化合物的含量。以2.2項中制得供試品適量，稀釋一定倍數(shù)，以紫外-可見分光光度法在520 nm處測定吸光度，按脫氧紫草素所得標準曲線（表1）計算，即得。

2.3.2 UPLC測定各成分含量 參照本實驗室建立的新疆紫草次生代謝物測定方法[2]，測定懸浮細胞中迷迭香酸、乙酰紫草素、脫氧紫草素、β，β′-二甲基丙烯酰紫草素、異戊酰紫草素含量。系統(tǒng)為ACQUITY UPLC；色譜柱為HSS T3超高效液相柱（Waters Corporation，Milford，MA，USA，2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流動相為乙腈（A）-0.1%甲酸-水（B）；梯度洗脫：10%～35% A，0～4 min；35%～60% A，4～4.3 min；60%～72% A，4.3～10 min；72%～80% A，10～11 min；流速0.5 mL·min-1，柱溫30 ℃，進樣量1 μL。標準曲線及線性范圍見表1。

2.4 數(shù)據(jù)處理

使用Microsoft Excel 2013和OriginPro 8.0進行數(shù)據(jù)整理與處理。

3 結果與分析

3.1 各處理對新疆紫草細胞中總紫草素合成積累影響

各測定結果見圖2。CK組中總紫草素含量在24～96 h隨時間而升高，各處理組處理24 h內即表現(xiàn)出相應作用。其中，MeJA可以促進新疆紫草紅色系懸浮細胞中紫草素的合成與積累，與已有報道相一致，24 h取樣中MeJA處理組總紫草素含量即達到2.05%，高于CK組的1.79%，且處理后72 h內促進作用隨時間增強，最高時MeJA處理組相比CK組含量提高0.52%。比較AIP處理組與CK組，48 h后AIP處理組逐漸表現(xiàn)出明顯的抑制作用，且抑制作用隨時間而增強，最高時含量相差達1.08%。AIP處理組與AIP+MeJA處理組相比，后者總紫草素含量則高于前者，而AIP+MeJA處理組與MeJA處理組比較，MeJA處理組的總紫草素含量更高，表明AIP處理可以部分消除MeJA的促進作用。AIP處理組內部比較，高濃度處理組相比低濃度處理組在96 h表現(xiàn)出更強的抑制作用，而在72 h之前，二者并無明顯差異。

3.2 各處理對新疆紫草細胞中迷迭香酸合成積累影響

對照組新疆紫草懸浮細胞中迷迭香酸含量96 h內存在先降低后升高的波動。MeJA處理可以明顯提高迷迭香酸含量，最高時質量分數(shù)由0.128%提高至0.228%，增幅超過75%。迷迭香酸對AIP處理反應靈敏，高濃度AIP處理后24 h即能明顯抑制細胞系中迷迭香酸的合成積累，且抑制作用隨處理時間增加而增強，96 h時高濃度處理組含量0.085%相比CK組0.153%降低接近一半。低濃度AIP處理則并沒有表現(xiàn)出明顯的抑制作用，表明AIP對新疆紫草中迷迭香酸合成積累的抑制可能存在劑量相關性。AIP+MeJA處理組與CK組、MeJA單獨處理組相比，AIP+MeJA處理組與CK組迷迭香酸含量基本持平，而低于MeJA單獨處理組，同樣表明AIP可部分抵消MeJA的促進作用。

3.3 各處理對新疆紫草細胞中各紫草素類化合物合成積累影響

乙酰紫草素、脫氧紫草素、β，β′-二甲基丙烯酰紫草素、異戊酰紫草素四類紫草素類化合物對處理的反應有所差異。其中乙酰紫草素對各處理反應最為靈敏，脫氧紫草素、異戊酰紫草素靈敏度稍低，β，β′-二甲基丙烯酰紫草素變化不明顯。

乙酰紫草素對處理反應靈敏，MeJA處理24 h后即表現(xiàn)出促進作用，處理48 h后質量分數(shù)達到0.3%以上并保持穩(wěn)定，相比CK組最高提高0.12%，提高近一半。無論低濃度AIP處理組還是高濃度AIP處理組，乙酰紫草素含量均明顯低于CK組，且高濃度處理組含量均低于低濃度處理組，表明AIP對乙酰紫草素合成積累有明顯的抑制作用，且抑制作用強弱可能存在劑量正相關性。低濃度AIP+MeJA處理組乙酰紫草素含量均高于AIP處理組，與CK組接近，低于MeJA處理組。而高濃度AIP+MeJA處理組含量與高濃度AIP處理組含量相近，低于低濃度AIP+MeJA處理組，表明200 μmol·L-1的AIP處理濃度對乙酰紫草素合成積累的抑制作用可能已超過20 μmol·L-1MeJA的促進作用。

脫氧紫草素與異戊酰紫草素在MeJA處理后均表現(xiàn)出促進作用，在AIP處理48 h后開始表現(xiàn)出較明顯的抑制作用，且抑制作用隨時間而增強。低濃度與高濃度AIP處理組相比，脫氧紫草素高濃度處理組表現(xiàn)出更強的抑制作用，但差別并不明顯；異戊酰紫草素在處理后48 h內高濃度組比低濃度組含量更低，48 h后差異消失。AIP+MeJA處理組脫氧紫草素與異戊酰紫草素含量72 h后表現(xiàn)出高于AIP處理組，低于MeJA處理組的現(xiàn)象。

β，β′-二甲基丙烯酰紫草素對各處理反應均較遲緩，處理0～72 h內各組均未表現(xiàn)出明顯差異，72 h后MeJA處理組開始相對CK組表現(xiàn)出一定促進作用，96 h后AIP處理組表現(xiàn)出抑制作用，且AIP+MeJA處理組β，β′-二甲基丙烯酰紫草素含量高于AIP處理組而低于MeJA單獨處理組。

整體看來，迷迭香酸在AIP處理后表現(xiàn)出明顯的合成、積累量下降現(xiàn)象且高濃度處理組抑制強于低濃度處理組，表明AIP處理的確對紫草懸浮細胞次生代謝的苯丙氨酸途徑表現(xiàn)出抑制作用，進而抑制了迷迭香酸的合成與積累，且抑制作用的強弱與處理時間、處理劑量呈正相關性。在總紫草素含量分析中發(fā)現(xiàn)，AIP處理組相對CK組同樣表現(xiàn)出一定的抑制作用，72 h后抑制作用表現(xiàn)更為明顯。更進一步，不同紫草素類化合物對AIP處理在反應強度、敏感性上表現(xiàn)有較大差異，其中乙酰紫草素對抑制作用表現(xiàn)尤為明顯；脫氧紫草素與異戊酰紫草素反應相似，弱于乙酰紫草素；β，β′-二甲基丙烯酰紫草素AIP處理組相對CK組沒有表現(xiàn)出明顯的抑制作用，但可以部分抵消MeJA的促進作用。探討上述現(xiàn)象出現(xiàn)的原因，筆者初步認為可能與各成分在細胞中含量、生理所用及細胞的自我調控有關。即，紫草細胞本身可能僅需要一定量的某種成分來維持自身生理功能，而此成分自身含量與需求量相接近，則該成分的合成積累會在各種調控下表現(xiàn)出更強的穩(wěn)定性，如β，β′-二甲基丙烯酰紫草素；而有的成分自身需求量較高，且其含量高于自身需求量，則對各種調控的反應可能會更為敏感，如乙酰紫草素等，但出現(xiàn)此現(xiàn)象的真正內在原因與其具體調控機制尚需進一步深入研究。

4 討論

由于新疆紫草紫草藥用及工業(yè)上的價值，近年來被大量采集，加上本來就分布狹窄，資源嚴重受損[9]，而利用細胞培養(yǎng)、微生物合成等生物工程技術生產紫草素是當前解決紫草素供應問題的重要研究方向，近年來在紫草細胞系培養(yǎng)調控、功能基因鑒定[10-12]等方面研究已有很多進展。

苯丙氨酸途徑在植物次生代謝中有重要作用，與水楊酸、黃酮、萜類等的合成密切相關。而AIP作為苯丙氨酸途徑中關鍵酶PAL的特異性抑制劑，通過AIP處理調節(jié)PP途徑的代謝，進而探索該通路在植物整體次生代謝中的作用也有相關報道，如Ren等[13]利用AIP處理抑制經(jīng)PP途徑合成的水楊酸合成，考察內生菌在白術根腐病保護方面的作用；王逸文等[14]考察了AIP與MeJA處理對高山紅景天愈傷組織生長和紅景天苷積累的影響，發(fā)現(xiàn)AIP處理可控制PP途徑碳流，間接提高其他通路碳流量，提高紅景天苷的合成等。

本研究通過結合AIP與MeJA處理，考察AIP對新疆紫草懸浮細胞中PP途徑的抑制作用帶來的次生代謝物合成積累的變化，為進一步了解新疆紫草中PP途徑在紫草素合成中的功能及特性奠定基礎，同時還可為各代謝途徑之間的相互作用以及代謝通路的代謝分流等問題的研究提供參考。本研究中選用高、低2種AIP處理濃度，發(fā)現(xiàn)AIP的抑制作用與處理濃度、處理時間有正相關性，但具體的量效、時效關系仍有待進一步研究。同時AIP與MeJA等誘導子間的相互作用關系也有待進一步挖掘。

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[責任編輯 呂冬梅]