活血止痛膏有效成分經皮滲透性研究

楊暢+杜守穎+白潔+李鵬躍+崔雅華+楊冰

[摘要] 建立透皮接收液中丹皮酚、丁香酚及胡椒堿的含量測定方法并對活血止痛橡膠膏劑經皮滲透性進行研究。利用HPLC測定透皮接收液中丹皮酚、丁香酚及胡椒堿的含量；以24 h累積透過量、經皮滲透速率及皮膚刺激性為指標，優選透皮接收液；采用Franz擴散池法考察活血止痛橡膠膏劑體外透皮特征及規律。結果表明，以聚乙二醇-乙醇-生理鹽水 3∶3∶4為透皮接收液，丹皮酚、丁香酚及胡椒堿的累積透過量和經皮滲透速率均較丙二醇-乙醇-生理鹽水 3∶3∶4和乙醇-生理鹽水 3∶7作為接收液高，皮膚刺激性較丙二醇-乙醇-生理鹽水 3∶3∶4作為接收液??；活血止痛橡膠膏劑中丹皮酚、丁香酚及胡椒堿 24 h累積透過量分別為2.84，19.9，0.753 μg·cm-2，三者經皮滲透速率分別為0.18，1.22，0.02 μg·cm-2·h-1。由此，活血止痛橡膠膏劑中丹皮酚、丁香酚及胡椒堿的透皮過程與其在膏中含量無關，且這一過程為擴散過程。

[關鍵詞] 丹皮酚；丁香酚；胡椒堿；經皮滲透性；活血止痛膏

Transdermal permeation of effective components in Huoxue Zhitong patch

YANG Chang， DU Shou-ying*， BAI Jie*， LI Peng-yue， CUI Ya-hua， YANG Bing

（Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100102， China）

[Abstract] To establish a determination method for the contents of paeonol， eugenol and piperine in receptor liquid and to research the transdermal permeability of Huoxue Zhitong patch. The contents of paeonol， eugenol and piperine in receptor liquid were determined by high pressure liquid chromatography（HPLC）； and the receptor liquid was optimized by taking accumulative amount penetrated within 24 hours， percutaneous permeation rate and skin irritation as indexes. In vitro Franz diffusion experiment was applied to assess the percutaneous penetration characteristics and regularity of Huoxue Zhitong patch. The results showed that the accumulative penetration amount and penetration rate by using PEG 400-ethanol-normal saline 3∶3∶4 as receptor liquid were higher than those by using propylene glycol∶ethanol∶normal saline 3∶3∶4 and ethanol-normal saline 3∶7， the and skin irritation of PEG 400-ethanol-normal saline 3∶3∶4 was smaller than propylene glycol：ethanol： normal saline 3∶3∶4. Results of percutaneous permeability experiments displayed that the accumulative amount penetrated of paeonol， eugenol and piperine within 24 hours was 2.84， 19.9， and 0.753 μg·cm-2 respectively in Huoxue Zhitong patch and the penetration rate was 0.18， 1.22， and 0.02 μg·cm-2·h-1 respectively. Thus， the permeation of paeonol， eugenol and piperine through the skin was a diffusion process， which was irrelevant to their content in patch.

[Key words] paeonol； eugenol； piperine； transdermal permeation； Huoxue Zhitong patch

活血止痛膏是安徽安科余良卿藥業有限公司自主研發的一種橡膠膏劑，現收載于2015年版《中國藥典》一部[1]。其由牡丹皮、胡椒、丁香等20多味藥組成，能夠活血止痛、舒筋通絡，臨床上廣泛用于筋骨疼痛、肌肉麻等的治療。作為外用給藥劑型，有效成分穿過皮膚屏障（角質層）到達靶部位是發揮治療作用的前提。通常認為，橡膠膏劑載藥量小[2]，有效成分是否能到達皮下及皮下組織，將直接影響治療效果，因此有必要對活血止痛膏有效成分的經皮滲透性進行研究。

體外透皮實驗法操作簡單、實驗條件易于控制，在經皮給藥制劑經皮滲透性研究中得到廣泛的應用[4]。該方法通常采用人體皮膚、動物皮膚或人工膜模擬在體皮膚環境，以生理鹽水作為接收液，用Franz擴散池來評價藥物的釋放和皮膚滲透性[3]。但由于活血止痛膏中存在大量的脂溶性成分，在生理鹽水中的溶解度很小，難以滿足漏槽條件，因此本課題對透皮接受液進行篩選，建立活血止痛膏透皮接受液中丹皮酚（paeonol，Pae）、丁香酚（eugenol，Eug）、胡椒堿（piperine，Pip）的HPLC，并對活血止痛膏的經皮滲透性進行研究，為其進一步研究與開發提供理論依據。

1 材料

LC-20AT型高效液相色譜儀（日本島津，含1690型柱溫箱和SPD-20A型紫外檢測器）；BT125D型電子分析天平（北京賽多利斯科學儀器有限公司）；TK-20B型透皮擴散試驗儀（上海鍇凱科技貿易有限公司）；KQ5200DA 數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；BSA2245電子天平（賽多利斯科學儀器北京有限公司）；RE-539C雷瓦電動理發器（上海雷瓦電器有限公司）；Quanta 250掃描電子顯微鏡（美國FEI 公司）。

丹皮酚對照品（成都曼斯特生物科技有限公司中國科學院成都生物研究所，批號MUST-15020401）；丁香酚對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號110725-201414）；胡椒堿對照品（成都曼斯特生物科技有限公司中國科學院成都生物研究所，批號MUST-15071310）；活血止痛膏（安科余良卿藥業有限公司）。甲醇（Fisher公司，色譜純）；純凈水（娃哈哈集團有限公司）；乙酸（Fisher公司，色譜純）；無水乙醇（北京化工廠，分析純）；聚乙二醇-400（國藥集團化學試劑有限公司，分析純）；1，2-丙二醇（國藥集團化學試劑有限公司，分析純）；戊二醛溶液25%（國藥集團化學試劑有限公司）；乙酸異戊酯（北京化工廠，分析純），其他試劑均為分析純。

雄性KM小鼠，體重（20±1） g，由維通利華實驗動物中心提供，合格證號SCXK（京）2012-0001。

2 方法

2.1 色譜條件

2.1.1 丁香酚和丹皮酚的色譜條件 Diamonsil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；以甲醇為流動相A，以酸水（乙酸調節pH至2.8）為流動相B，梯度洗脫（0～20 min，55%～40% B；20～25 min，40%～20% B；25～30 min，20% B；30～35 min，20%～55% B），流速1.0 mL·min-1；分別以274，280 nm 作為丹皮酚、丁香酚的檢測波長；柱溫30 ℃。

2.1.2 胡椒堿的色譜條件 Diamonsil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；以甲醇-酸水（乙酸調節pH至2.8）（77∶23）為流動相，流速1.0 mL·min-1；檢測波長343 nm；柱溫30 ℃。

2.2 對照品溶液的制備

分別精密稱定丹皮酚、胡椒堿及丁香酚適量，置于10 mL 量瓶中，用無水乙醇溶解并定容至刻度，分別制備成質量濃度為 0.593，0.983，1.056 g·L-1的對照品母液。

2.3 標準曲線的制備

用無水乙醇將上述對照品母液制備成不同濃度的混合對照品溶液，按2.1項下色譜條件檢測。以待測成分質量濃度C （mg·L-1）為橫坐標，以待測成分峰面積A為縱坐標，進行線性回歸，得到Pae，Eug，Pip的標準曲線。Pae在0.094 85～9.485 mg·L-1線性關系良好，標準曲線回歸方程為A=48 607C-1 233.9，r=0.999 8；Eug在0.08 448～8.448 mg·L-1線性關系良好，標準曲線回歸方程為A=10 177C-903.7，r=0.999 2；Pip在0.039 31～3.931 mg·L-1線性關系良好，標準曲線回歸方程為A=75 507C-4 529.6，r=0.999 3。

2.4 離體皮膚的制備

取雄性KM小鼠，斷頸椎處死，除去腹部鼠毛，確保角質層完好，分離腹部皮膚，用脫脂棉擦去脂肪組織和結締組織，生理鹽水沖洗干凈。用鋁箔包裹后-20 ℃冷凍保存，1周內用完。

2.5 Franz 擴散池法[5]

將2.4所制備的離體皮膚自然解凍，備用。將鼠皮固定在滲透擴散裝置的供給室與接收室之間，角質層朝向供給室（有效擴散面積3.46 cm2），分別加入20 mL透皮接收液，池內置磁力攪拌子，轉速350 r·min-1，溫度（32.5±0.2） ℃下平衡30 min，排盡皮膚下的空氣，濾紙吸干皮膚表面的液體。將剪好的活血止痛膏置于離體皮膚上方，使其與皮膚緊密接觸。分別于不同時間點取樣0.4 mL，同時補加等體積同溫度的新鮮接收液。所取接收液經0.22 μm微孔濾膜過濾，按上述色譜方法進行HPLC測定，按下述公式計算相應時間丹皮酚、丁香酚及胡椒堿的累計透過量（Qn）和透皮速率（Jss）。

Qn=（VCn+1.0×∑n-1i-1Ci）/S

公式中Qn為第n個時間點的單位面積累積透過量（μg），V為接收液的體積（20 mL），Cn為取樣點接收液的質量濃度（mg·L-1），S為擴散池的有效面積（3.46 cm2）。

以累計透過量Qn縱坐標，t為橫坐標，繪制累積透過量-時間曲線，其斜率為透皮速率Jss[6]。

2.6 皮膚標本的制備[7]

按2.4所述方法制備離體皮膚，隨機分成4組，按2.5所述方法將其固定于滲透擴散裝置的供給室與接收室之間，分別將30%聚乙二醇400-30%乙醇-40%生理鹽水（PEG-Et-NS）、30%丙二醇-30%乙醇-40%生理鹽水（PG-Et-NS）以及30%乙醇-生理鹽水（Et-NS）作為透皮接收液。12 h后用眼科剪迅速將不同組離體皮膚于相同部位剪下面積為0.5 cm×0.5 cm的小塊，迅速置于2.5%戊二醛溶液中固定。12 h 后用去離子水清洗3次，乙醇梯度脫水，CO2臨界點干燥，真空濺射儀噴金，掃描電子顯微鏡觀察超微結構。

3 結果

3.1 透皮接收液的篩選

3.1.1 不同接收液滲透量、滲透速率比較研究 分別以PEG-Et-NS，PG-Et-NS，Et-NS作為透皮接收液，活血止痛膏中丹皮酚、胡椒堿及丁香酚透皮吸收情況見圖1，2。

由圖可知，以PEG400-Et-NS 3∶3∶4為接收液，丹皮酚的Q24和Jss略大于以PG-Et-NS 3∶3∶4為接收液，明顯高于以Et-NS 3∶7為接收液；丁香酚的Q24和Jss明顯高于以PG-Et-NS 3∶3∶4，Et-NS 3∶7為接收液；胡椒堿的Q24略大于以Et-NS 3∶7為接收液，明顯高于以PG-Et-NS 3∶3∶4為接收液，但3種接收液條件下Jss無明顯差異。

3.1.2 不同接收液皮膚刺激性比較研究 取2.6項下皮膚樣本，于掃描電鏡下觀察不同接收液條件下，小鼠皮膚下表面微觀結構變化情況，結果見圖3。

NS組：皮膚下表面膠原纖維豐滿，呈緊密堆積排列；Et-NS組：皮膚下表面膠原纖維較豐滿，排列整齊；PG-Et-NS組：皮膚下表面膠原纖維稀疏，排列紊亂，纖維較細，能看到纖維下皮膚有明顯的褶皺；PEG400-Et-NS組：皮膚下表面膠原纖維較稀疏，排列紊亂，纖維較細。

綜上所述，以PEG400-Et-NS 3∶3∶4為活血止痛膏經皮透過研究的透皮接收液。

3.2 活血止痛膏經皮滲透性研究

以PEG400-Et-NS 3∶3∶4為透皮接受液，活血止痛膏24 h累計經皮滲透量隨時間變化規律見圖4，表1。分別采用零級模型、一級模型、Higuchi 模型、Hixson-Crowell 模型對活血止痛膏經皮滲透曲線進行回歸分析，結果見表2。

4 討論

本課題組通過預實驗發現，以生理鹽水作為活血止痛膏透皮接收液，所收集的樣品中Pae，Eug，Pip的濃度均不能達到HPLC的定量限。結合前期研究對微透析灌流液的篩選，以30%乙醇生理鹽水作為灌流液，微透析探針對Pae，Eug，Pip均無明顯吸附[8]，同時參考于娟等[9]活血止痛凝膠體外釋放和經皮滲透性研究中的透皮接收液，選擇30%乙醇生理鹽水作為透皮接收液。又因為該3個成分尤其是Pip 的脂溶性較強，為增加三者在透皮接收液中的溶解度，對透皮接收液進行進一步的篩選。

本研究所制備的離體皮膚下緣處于真皮深層的網狀層，與透皮接收液接觸的下表面主要由各種纖維構成，以膠原纖維為主。本研究主要以纖維的排列規則度、稀疏程度、粗細為指標對透皮接收液的皮膚刺激性進行評判。由結果可知，Et-NS組皮膚下表面纖維更飽滿，排列更規則，更接近生理鹽水組；PG-Et-NS組皮膚下表面纖維細，稀疏，排列紊亂，最偏離皮膚正常結構。因此，透皮接收液皮膚刺激性由大到小為：PG-Et-NS 3∶3∶4>PEG-Et-NS 3∶3∶4> Et-NS 3∶7。結合累計透過量和透過速率兩指標，最終選擇PEG-Et-NS 3∶3∶4為透皮接收液。

由透皮接收液的篩選結果可以看出，同比例的PEG400和丙二醇，PEG400對3種成分的溶解作用更強。經分析，PEG400同丙二醇均可與生理鹽水、乙醇組成潛溶劑，從而增加脂溶性成分在透皮接收液中的溶解度。但PEG400作為一種非離子表面活性劑，除有潛溶作用外，還可以與脂溶性化合物形成膠束[10]，因此增溶作用更強。

由方程模型擬合結果可以看出，接收液中Pae，Eug，Pip的濃度變化規律均符合零級模型，說明藥物的透皮過程與膏中藥物濃度無關；又因為三者Higuchi模型的相關系數r均大于Hixson-Crowell模型，因此可以推測3種成分是從活血止痛膏中擴散到達皮膚表面的。因活血止痛橡膠膏劑基質主要是橡膠、松香等，要經過混煉的步驟將基質和中藥浸膏進行均勻混合，隨后經歷精煉、烘膠等步驟使藥物被嚴密的包裹在以橡膠為骨架的混合基質中[11]。因為橡膠、松香等均不宜溶于水中，不會出現凝膠（膏）劑中藥物在擴散和骨架溶蝕雙重作用[12]下釋放的現象。

由活血止痛膏橡膠膏劑經皮滲透性研究結果可以看出，3種成分24 h累積透過量較低、滲透速度較慢，尤其是胡椒堿Q24為0.753 μg·cm-2，Jss為0.02 μg·cm-2·h-1。同時與于娟等[9]研究結果相比，丹皮酚的Jss約為凝膠膏劑中丹皮酚Jss的1/10，這與其他研究[13-14]所得橡膠膏劑透皮性能較差相一致。另外，橡膠膏劑還存在皮膚刺激性、皮膚殘留性等缺點，提示為提高活血止痛膏的生物利用度及藥效，可尋找新型、安全、高效的載藥體系。

[參考文獻]

[1] 中國藥典.一部[S].2015：1294.

[2] 朱靜，賈曉斌，鄭智音.揮發性成分在橡膠膏劑處方中的作用及如何提高其穩定性[J].中華中醫藥雜志，2012，27（5）：1360.

[3] 徐月紅，葉卉，關素桃，等.白芥子涂方凝膠膏劑的體外釋放及透皮特性研究[J].中成藥，2011，33（12）：2068.

[4] Shiow-Fern Ng，Jennifer J Rouse，Francis D Sanderson，et al.Validation of a static Franz diffusion cell system for in vitro permeation studies[J].AAPS Pharm Sci Tech，2010，11（3）：1432.

[5] 白潔，陸洋，杜守穎，等.川芎貼膏制備工藝及其體內外評價研究[J].中華中醫藥雜志，2013，28（5）：1259.

[6] Nielsen J B，Benfeldt E，Holmgaard R.Penetration through the skin barrier[J].Curr Probl Dermatol，2016，49：103.

[7] 宇克莉，孫建華.幾種透皮吸收促進劑的作用機理探討[J].山東醫藥，2007，47（11）：30.

[8] 楊暢，白潔，杜守穎，等.丹皮酚、丁香酚、胡椒堿經皮微透析體內外回收率的研究[J].中國中藥雜志，2016，41（22）：4247.

[9] 于娟，杜茂波，劉淑芝，等.活血止痛凝膠體外釋放和經皮滲透性研究[J].中國中藥雜志，2014，39（24）：4778.

[10] 楊明.中藥藥劑學 [M].3版.北京：中國中醫藥出版社，2012：145.

[11] 王永剛.熱壓法生產橡膠膏劑工藝探討[J].中國實驗方劑學雜志，2015，21（21）：222.

[12] 章燁雯，王瓊，于競新，等.止痛微乳凝膠膏的制備及體外評價[J].北京中醫藥大學學報，2015，38（4）：253.

[13] 朱力陽，傅超美，馬建，等.丁桂活絡貼劑與丁桂活絡膏體外透皮行為的比較[J].中國醫院藥學雜志，2015，35（7）：587.

[14] 姚譞，沈侃，劉然，等.關節止痛膏橡膠膏與熱熔壓敏膠劑型的體外透皮特性、藥效以及皮膚刺激性比較[J].中草藥，2013，44（4）：443.

[責任編輯 曹陽陽]