酶解條件對麥麩低聚木糖含量及其性質的影響

王偉旭，汪麗萍，于 雷，譚 斌，韓 偉，劉艷香，田曉紅

(1.國家糧食局科學研究院，北京 100037；2.吉林農業大學，吉林 長春 130118)

低聚木糖是植物細胞壁中阿拉伯木聚糖的分解產物，其結構一般是由2～7個木糖以β-1,4-糖苷鍵連接而成的聚合性糖，又稱為木寡糖[1]。低聚木糖作為國際上頗受關注的低聚糖具有諸多的功能特性，例如，能夠調節腸道菌群，有助于有益腸道菌群增長；有利于糖尿病者，肥胖者等“三高人群”食用；具有抗氧化，提高免疫力等作用，因此被廣泛應用于食品、飼料以及醫藥產業中[2-3]。然而諸多的功能特性通常由低聚木糖的結構所決定，其中木二糖、木三糖是低聚木糖的有效成分[4]，同時低聚木糖的聚合度對其產品的理化性質和功能特性具有很大的影響[5]。

目前國內對于低聚木糖的研究主要集中于酶解條件變化對其含量和平均聚合度的影響，或以低聚木糖含量和平均聚合度為指標制備出的低聚木糖進行功能性評價[6-7]，而不同酶解條件對低聚木糖功能特性的影響未見報道。因此，本實驗采用木聚糖酶酶解麥麩水不溶性阿拉伯木聚糖制備低聚木糖，探討酶解溫度、酶解時間和加酶量對低聚木糖含量、平均聚合度、糖組成以及益生元活性的影響，為低聚木糖的工業化生產提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小麥麩皮水不溶性阿拉伯木聚糖：本實驗室堿法提取制得，阿拉伯木聚糖含量67.1%。

木糖、木二糖、木三糖、木四糖、木五糖、木六糖和木七糖標準品：SIGMA公司；乳酸、乙酸、丙酸、丁酸標準品：北京蘭博利德公司；木聚糖酶：諾維信生物科技有限公司；青春雙歧桿菌(Bifidobacteriumadolescentis)ATCC 15703：中國食品發酵工業研究院工業微生物菌種保藏中心；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

SHZ-88A水浴恒溫振蕩器：太倉市實驗設備廠；低速離心機：安慰中科中佳科學儀器有限公司；3-18K低溫高速離心機：德國SIGMA公司； DGG-9000型電熱恒溫鼓風干燥箱：上海森信試驗儀器有限公司；T6紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；LGJ-10D冷凍干燥機：北京四環科學儀器廠有限公司；PL3002-IC電子天平：梅特勒—托利多儀器有限公司；ICS-3000離子色譜：美國戴安公司；YQX-II型厭氧培養箱：上海新苗醫療器械制造有限公司；MLS-3781L高壓滅菌器：日本Panasonic公司；超凈工作臺：美國Thermo Scientific公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 低聚木糖制備工藝[8]

準確稱取一定量的麩皮水不溶性阿拉伯木聚糖，均勻分散于pH為5.0，0.1 mol/L的NaAC緩沖溶液中，配制成底物濃度為4%的懸浮液，加入定量的木聚糖酶后在一定溫度下水浴振蕩一定時間后，在沸水浴中滅酶10 min，冷卻后離心(4 000 r/min，20 min)，收集上清液。搖勻后一部分上清液測定還原糖和可溶性總糖含量，另一部分上清液冷凍干燥制成粉末狀。

1.3.2 酶解條件設定

設置酶解時間2 h，加酶量0.50 g/L，在酶解溫度分別為40、45、50、55、60 ℃的條件下水浴振蕩。研究酶解溫度對低聚木糖性質的影響。

設置酶解溫度50 ℃，加酶量0.50 g/L,在酶解時間分別為1、1.5、2、2.5、3 h的條件下水浴振蕩。研究酶解時間對低聚木糖性質的影響。

設置酶解時間2 h，酶解溫度50 ℃，在加酶量分別為0.125、0.250、0.50、1、2 g/L的條件下水浴振蕩。研究加酶量對低聚木糖性質的影響。

1.3.3 木聚糖酶活力測定[9]

參考飼料添加劑木聚糖酶活力的測定分光光度計法，GB/T 23874—2009。

1.3.4 低聚木糖含量測定

AXOs含量測定參考晁正[10]方法，以酶解液中還原糖含量表示。采用3,5-二硝基水楊酸法(DNS)測定(以木糖計，mg/mL)。

1.3.5 總還原糖含量測定

參考張軍華[11]方法稍作修改。取一定量的樣品溶液加入同體積濃度為8%的H2SO4于121 ℃下反應1 h，冷卻后用15%的NaOH溶液中和反應液，過濾后采用DNS法測定。

平均聚合度(DP)=可溶性還原糖的含量/還原糖的含量

1.3.6 低聚木糖糖組成測定

參考Swennen[12]方法稍作修改。準確稱取5 mg待測樣品溶于5 mL超純水中，經離心、過濾后，進樣10 μL。

色譜條件：色譜柱：Carbopac PA100分析柱(4×250 mm)，Carbopac PA100保護住(4×50 mm)；流速1 mL/min；進樣量：10 μL；柱溫：30 ℃；檢測器：脈沖安培檢測器，AgCl；淋洗液：100 mmol/L NaOH(A)和500 mmol/L NaOAC(B)進行二元梯度洗脫；洗脫程序：0～30 min時B相濃度由0 mmol/L線性增至120 mmol/L,30～40 min時以100%A沖洗系統。

1.3.7 厭氧培養

1.3.7.1 培養基制備[6]

混合0.2 g無水CaCl2和0.48 g MgSO4在300 mL蒸餾水中直到溶解，加500 mL蒸餾水邊攪拌邊緩慢加入1 g K2HPO4、1 g KH2PO4、10 g NaHCO3、2 g NaCl，繼續攪拌直到所有鹽全部溶解，加入200 mL蒸餾水，混勻配制成鹽溶液。分別稱取2.5 g蛋白胨、2.5 g胰胨、5 g酵母粉、5 g葡萄糖、20 mL鹽溶液、0.25 g L-半胱氨酸鹽酸鹽，500 mL蒸餾水于1 000 mL燒杯中配制基礎培養基，經過煮沸驅氧后，分裝，滅菌，轉入厭氧培養箱中，添加還原劑和調節pH值為7.0，最后接種。

增殖培養時將適量樣品加入基礎培養基中代替葡萄糖，滅菌，添加還原劑和調節pH值，分別在6、12、24 h定時取樣分析檢測。

1.3.7.2 菌體濃度測定[6]

比濁法和干重法相結合測定發酵液中菌體濃度。吸取10 mL菌體母液進行離心，菌體經生理鹽水洗滌3次后用生理鹽水定容至10 mL，按一定梯度吸取上述經搖勻的菌液，用生理鹽水稀釋至5 mL，以生理鹽水為空白，用分光光度計在 620 nm測定吸光度，同時測定上述一定體積菌液的固含量，根據吸光度和固含量繪制標準曲線。分別在6、12、24 h取一定量的發酵液離心后(3 000 r/min，15 min)，菌體經生理鹽水洗滌3次，用生理鹽水稀釋至同等體積后搖勻，以生理鹽水為空白測定吸光值。

1.3.7.3 有機酸含量測定

參考趙夢麗[13]方法稍作改動。分別取6、12、24 h發酵液經10 000 r/min離心10 min，上清液經超純水適當稀釋后過濾，用離子色譜進行測定。

色譜條件：色譜柱：IonPac AS11-HC(4×250 mm)分析柱，IonPac AG11-HC(4×50 mm)保護柱；流速：0.5mL/min；進樣量：25 μL；柱溫：30 ℃；檢測器：電導檢測器；抑制器型號：ASRs-4mm；淋洗液：A為100 mmol/L NaOH，B為超純水，0～7 min 4%A，7.1～15 min 20%A，15.1～22 min 40%A，22.1～33 min 4%A。

1.3.8 數據處理

所有實驗重復3次，數據均以平均值±標準偏差表示，數據處理采用Excel和SPSS 17進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 酶解條件對低聚木糖含量的影響

不同酶解條件對低聚木糖含量影響見圖1。由圖1a可知，酶解溫度對低聚木糖含量影響較大，隨著溫度的升高低聚木糖含量顯著增加，當酶解溫度從40 ℃升高至50 ℃時，低聚木糖含量從74 mg/g增至95 mg/g，提高了約28%，可能由于隨著酶解溫度的增加，使酶與底物中間體轉化為目標物的速度加快，在最適溫度50 ℃下木聚糖酶能夠長時間發揮作用而不失活；繼續增加溫度低聚木糖含量反而降低，由于酶是蛋白體，溫度升高會降低酶的穩定性，使一部分酶失活。由圖1b可看出，酶解時間由1 h延長至2 h時，低聚木糖含量緩慢增加，當繼續增加酶解時間含量反而下降，可能由于隨著時間的延長酶與底物接觸漸漸充分使得更易獲取目標物，但隨著時間的推移酶的活性降低導致低聚木糖含量下降。由圖1c顯示，加酶量由0.125 g/L增至1.0 g/L時，低聚木糖含量迅速增加，當超過1 g/L時，含量下降。可能由于較小的加酶量不能夠充分的降解底物導致低聚木糖含量低，隨著加酶量的增加單位體積水解液中酶分子數量提高，使得酶分子與底物充分結合，提高反應效率。綜上所述，酶解溫度約50 ℃，酶解時間約2 h和加酶量約1 g/L時，低聚木糖含量最大。

圖1 酶解條件對低聚木糖含量的影響

2.2 酶解條件對低聚木糖糖組成的影響

表1～表3顯示了不同酶解條件對AXOs糖組成的影響。由表可知不同酶解溫度、酶解時間和加酶量獲得的AXOs其糖組成主要由木糖、木二糖、木三糖和木四糖組成，其中木二糖和木三糖為主要成分。文獻表明[14]木二糖、木三糖和木四糖混和組分的培養基對雙歧桿菌的增值效果最好。由表1可知，木糖和木四糖的含量隨著酶解溫度的增加而增加，當酶解溫度為50 ℃時木四糖相對含量達到最大；木三糖含量隨著酶解溫度由40 ℃增加至50 ℃時沒有明顯變化，繼續增加酶解溫度，木三糖含量減小；酶解溫度的變化對木二糖相對含量影響較小。由表2可看出，木糖和木四糖含量隨著酶解時間的延長而增加，當酶解時間為2 h時，木四糖相對含量達到最大；當酶解時間由1 h延長至2 h時木二糖相對含量緩慢增加，而木三糖相對含量大幅度下降，可能由于隨著酶解時間的延長，木三糖之間的1,4-β糖苷鍵被內切型木聚糖甘酶斷裂，被分解為木糖和木二糖。由表2可知，加酶量對木糖和木三糖相對含量影響較明顯，隨著加酶量的增加，木三糖相對含量大幅度下降，而木糖相對含量明顯增加；木二糖和木四糖相對含量隨著加酶量的增加而增加。綜上所述，酶解時間和加酶量對木三糖的產生具有很大影響，在短時間和低加酶量條件下有利于木三糖的產生，當酶解時間和加酶量越大時木三糖越易分解為木糖或木二糖，導致木三糖相對含量減??；酶解溫度、酶解時間和加酶量的增加均有利于木四糖的產生，當酶解溫度為50 ℃，酶解時間為2 h和加酶量為1 g/L時木四糖相對含量達到最大，而且木二糖：木三糖：木四糖的比值最小。

表1 酶解溫度對低聚木糖糖組成的影響

表2 酶解時間對低聚木糖糖組成的影響

表3 加酶量對低聚木糖糖組成的影響

注：a,b和c表示不同酶解條件下制備的低聚木糖糖組成的差異性，不同小寫字母表示處理在P<0.05水平差異顯著。

2.3 酶解條件對低聚木糖平均聚合度的影響

酶解條件對低聚木糖平均聚合度的影響見圖2。由圖2可知，通過不同酶解條件得到的低聚木糖平均聚合度均小于5。由圖2a顯示，隨著酶解溫度的增加，總還原糖和還原糖的含量均增加，而平均聚合度呈下降趨勢，當酶解溫度為50 ℃時，總還原糖濃度和還原糖濃度達到最大，在此條件下的低聚木糖平均聚合度趨于最??；由圖2b可看出，隨著酶解時間的延長總還原糖含量無明顯變化，還原糖含量逐漸增加，平均聚合度減小，當酶解時間增加至2 h時，還原糖含量達到最大，低聚木糖平均聚合度最小；由圖2c可知，加酶量對總還原糖含量影響作用小，而對還原糖含量影響較大，當加酶量由0.125 g/L增至1 g/L時，還原糖含量達到最大，總還原糖含量趨于平穩，此時低聚木糖平均聚合度最小。總之，不同酶解條件對低聚木糖平均聚合度影響較大，當酶解溫度50 ℃，酶解時間2 h和加酶量1 g/L時低聚木糖平均聚合度趨于最小。

圖2 酶解條件變化對低聚木糖平均聚合度的影響注：平均聚合度=可溶性還原糖含量/還原糖含量。

2.4 不同酶解條件制得低聚木糖對益生元活性的影響

2.4.1 不同酶解條件制得低聚木糖對菌體濃度的影響

不同酶解溫度、酶解時間和加酶量制得的低聚木糖對青春雙歧桿菌增值情況的影響見圖3。由圖3可知，隨著發酵時間的延長不同酶解條件下制得的低聚木糖對菌種增值變化規律均相似，其中發酵時間由0 h增至6 h時呈對數期生長，隨后由6 h延長至24 h時呈平穩或緩慢生長的趨勢。不同酶解條件下制得的低聚木糖對菌種均有增值作用，但菌體濃度增加量不盡相同，由圖3a可知，酶解溫度越高得到的低聚木糖用于增值菌體的效果越好，當溫度達到50 ℃時，菌體濃度自0.07 g/L增至最大值0.219 g/L,增加了3.1倍。由圖3b可看出，WUAX經不同酶解時間處理得到的低聚木糖培養菌種時發酵液中起始菌體濃度為0.07g/L，當代謝由酶解時間1 h延長至2 h制備的低聚木糖時，菌體濃度呈現上升趨勢，當酶解時間為2 h時，菌體濃度達到最大，繼續增加酶解時間制備AXO將不利于菌體增值。圖3c可知，添加不同加酶量制得的低聚木糖作為碳源培養青春雙歧桿菌時發酵液中初始菌體濃度為0.06 g/L，隨著加酶量的增加，發酵液中菌體濃度呈現上升趨勢，當菌體代謝加酶量為1 g/L制備的低聚木糖時，發酵液中菌體濃度達到最大，其值為0.339 g/L，增加到5.65倍，此結果與徐勇[15]實驗中菌體增長倍數相一致。綜上所述，當酶解溫度50 ℃，酶解時間2 h和加酶量1 g/L條件下得到的低聚木糖用于增值青春雙歧桿菌的效果最好。結合前述研究結果可得出：當在一定酶解條件下得到的低聚木糖含量最高，平均聚合度最小，木二糖，木三糖和木四糖的含量比值最小時，低聚木糖增值青春雙歧桿菌的效果最佳。

圖3 不同酶解條件制得低聚木糖對發酵液中菌體濃度的影響 注：在發酵0 h時，不同酶解溫度和酶解時間制備的低聚木糖培養菌種時發酵液中菌體濃度均為0.07 g/L；在發酵0 h時，不同加酶量制備的低聚木糖培養菌種時發酵液中菌體濃度均為0.06 g/L；a,b和c表示在相同發酵時間時，不同酶解條件下制備的低聚木糖培養菌種時菌體濃度差異性, 不同小寫字母表示處理在P<0.05水平差異顯著。

2.4.2 不同酶解條件得到的低聚木糖對菌種代謝產物的影響

青春雙歧桿菌代謝低聚木糖后發酵液的pH值均有明顯下降，這是因為雙歧桿菌代謝糖類化合物時產生有機酸的影響。表4顯示了不同酶解條件得到的低聚木糖培養青春雙歧桿菌時對發酵液中代謝產物的影響。由表4～表6可知，以不同酶解溫度、酶解時間和加酶量產生的低聚木糖作為碳源培養青春雙歧桿菌時代謝產物主要為乳酸、乙酸和丙酸，其中乙酸含量最多；所有碳源發酵時，隨著發酵時間的延長，乳酸、乙酸和丙酸的含量均有明顯增加，當發酵時間為24 h時乙酸和丙酸含量達到最大，乳酸含量趨于平穩或稍有降低，這與發酵液中pH值的變化趨勢相一致。表4表明了青春雙歧桿菌代謝經不同酶解溫度處理獲得的低聚木糖時發酵液中代謝物含量變化，在發酵12 h時，菌種代謝酶解溫度由40 ℃升高至50 ℃制備的低聚木糖時發酵液中總有機酸含量逐漸上升，繼續增加酶解溫度制備低聚木糖培養青春雙歧桿菌時發酵液中的總有機酸含量逐漸下降；由酶解溫度為45 ℃得到的低聚木糖，當培養24 h時發酵液中乙酸含量最大，占總有機酸的54.81%，酶解溫度為50 ℃的次之，占總有機酸含量的52.60%，當代謝酶解溫度為50 ℃制備的低聚木糖時丙酸含量最大，占總有機酸含量的41.42%。青春雙歧桿菌代謝經不同酶解時間處理得到的低聚木糖產生的代謝物含量。由表5可見，隨著酶解時間的延長得到的低聚木糖培養菌種時發酵液中總有機酸含量逐漸增加，當酶解時間為2 h時總有機酸含量達到最大為3.08 g/L；酶解時間為1.5 h得到的低聚木糖在發酵24 h時產生的乙酸含量最多，酶解時間為2 h的次之，丙酸含量在發酵酶解時間為2 h得到的低聚木糖時達到最大。表6顯示青春雙歧桿菌代謝經添加不同加酶量得到的低聚木糖產生代謝物的含量，當加酶量由0.125 g/L增至0.25 g/L所得到的低聚木糖培養24 h時，發酵液中總有機酸、乙酸和丙酸含量均達到最大，當繼續增加加酶量時乙酸和丙酸含量均無明顯變化。因此結合不同酶解條件下得到的低聚木糖對青春雙歧桿菌增值影響結果可得出，酶解條件對青春雙歧桿菌產生代謝物含量的影響與菌種增值變化趨勢相一致。

表4 不同酶解溫度下得到的低聚木糖對發酵液中代謝產物的影響

表5 不同酶解時間下得到的低聚木糖對發酵液中代謝產物的影響

表6 不同加酶量下得到的低聚木糖對發酵液中代謝產物的影響

注： a,b和c表示在相同發酵時間時，不同酶解條件制備的低聚木糖培養菌種時代謝產物含量的差異性，不同小寫字母表示處理在P<0.05水平差異顯著。

3 結論

通過研究不同酶解條件對麥麩低聚木糖含量、平均聚合度、糖組成和益生元活性的影響可得出，在一定的范圍內隨著酶解時間的延長、酶解溫度和加酶量的增加，低聚木糖含量增加，平均聚合度降低，木二糖，木三糖和木四糖含量比值減??；不同酶解條件下得到的低聚木糖培養青春雙歧桿菌的菌體濃度含量均有不同程度的增加，青春雙歧桿菌代謝不同酶解條件下得到的低聚木糖發酵液中代謝產物均包含乳酸、乙酸和丙酸，乙酸含量最高，其產酸量變化趨勢與菌體濃度和低聚木糖含量相一致，與低聚木糖平均聚合度相反；當酶解溫度50 ℃，酶解時間2 h和加酶量1 g/L時，低聚木糖含量達到最大為101 mg/g，平均聚合度降至最小3.23，菌體濃度增值倍數達到最大為5.65倍；可得出低聚木糖結構和益生元活性兩者之間的關系：隨著酶解條件的變化，低聚木糖含量最大時，平均聚合度趨于最小，木二糖、木三糖和木四糖的相對含量比值趨于最小，低聚木糖的益生元活性最佳。

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