常壓等離子體降解黃曲霉毒素B1的效果研究

任翠榮，熊旭波，王世清，王振斌，張 巖，姜文利

(1.青島農業大學 食品科學與工程學院，山東 青島 266109；2.青島澳維康生物科技工程有限公司，山東 青島 266109；3.江蘇大學 食品與生物工程學院，江蘇 鎮江 212013)

黃曲霉毒素(Aflatoxins，AFT)是由黃曲霉和寄生曲霉所產生的一種次生代謝物，具有急慢性毒性、致突變性、致癌性和致畸性[1]。常見的有黃曲霉毒素B1(Aflatoxin Bl，AFBl)、B2(AflatoxinB2， AFB2)、G1(Aflatoxin Gl，AFG2)、G2(Aflatoxin G2，AFG2)、Ml(Aflatoxin M1，AFM1)5種[2]，其中AFB1毒性最強，其毒性是氰化鉀的10倍，砒霜的68倍，被世界衛生組織(WHO)列為一級致癌物[3-5]。AFT是迄今為止發現最穩定的一類真菌毒素，耐受高溫，一般的加熱過程對AFT的結構沒有影響。

國內外學者對AFT的脫除方法進行了大量研究，目前主要有化學法、生物法和物理法[6]，但大部分方法存在著處理時間長、損害農產品營養品質、降解效率低、成本高、不易操作、實踐應用受到限制等問題[7-9]。物理法是目前應用較多的一類AFT脫除方法，其中紫外線和γ-射線輻照是目前研究比較多的物理方法，它們具有操作容易、性能穩定、勞動強度小等優點，在AFT的脫除中受到了廣泛關注[10]。

等離子體被稱為物質的“第四態”，指部分或完全電離的氣體，且自由電子和離子所帶正、負電荷的總和完全抵消，宏觀上呈現中性電[11-13]。本課題組自2007年以來，嘗試采用減壓等離子體處理AFB1，并取得了初步的成效。張巖等研究發現，200 W常壓等離子體處理水中AFB1，時間為80 s時，其降解率達到51.67 %[14]；120 W的減壓等離子體處理乙腈中AFB1，時間為250 s時，其降解率達99.8%[15]，且降解率均隨等離子體處理功率的增大而增加。李玉鵬等利用低壓等離子體技術也能有效降解農產品中的AFB1，但比純水或純乙腈中的AFB1的降解率低，當增大處理功率或延長處理時間時能增加AFB1降解率[16]。說明減壓等離子體用于降解農產品中AFB1具有一定的可能性。

近些年出現的常壓等離子體技術發展勢頭逐漸勝過了傳統的減壓等離子體技術，因為前者無需使用真空設備能夠處理大面積物件，所以更適合在生產線上應用[18-19]。本實驗利用常壓等離子體處理AFB1，在單因素實驗基礎上進行了響應面優化設計，以期獲得AFB1降解最優的工藝條件，為實際應用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

AFB1：美國Sigma公司；乙腈(色譜純) ： 德國默克公司。

1.2 儀器與設備

常壓等離子體：中國科學院等離子體物理研究所；針筒式濾膜過濾器：天津市津騰實驗設備有限公司；一次性無菌注射器：侯馬市康福萊醫療器械有限公司；HPLC液相色譜儀：德國默克公司；智能超聲波清洗器：德國艾爾瑪公司。

1.3 實驗裝置

常壓等離子體裝置見圖1。

1-氬氣瓶；2-超凈工作臺；3-樣品；4-等離子體電極；5-TDGC2-2型接觸調壓器；6-LZB-10浮子流量計；7-高度調節器；8-等離子體火焰；9-高頻電壓交流電源圖1 常壓等離子體裝置圖

1.4 測試方法

1.4.1色譜條件

Agilent液相系統。色譜柱：Waters Symmetry-C18，4.6 mm×250 mm；粒度5μm；柱溫：30 ℃;流動相∶V(乙腈)∶V(水)=30∶70，流速：1 mL/ min，進樣量：20 μL，熒光檢測器:激發波長：365 nm，發射波長：440 nm。

1.4.2 標準曲線的繪制

準確吸取濃度分別0、5、10、15、20、30、40、50 mg/L的AFB1標準溶液各5 mL，采用HPLC分析，每個濃度重復3次，以AFB1的峰面積對AFB1標準溶液的濃度進行線性回歸，標準曲線見圖2。由標準曲線可知，線性方程為y=33.71x-20.634，R2=0.999 5。

圖2 AFB1標準曲線

1.5 實驗方法

1.5.1 單因素實驗

1.5.1.1 常壓等離子體放電距離的降解實驗

用乙腈配制初始濃度為10 mg/L的AFB1溶液，置于等離子體上進行處理，放電距離設定為1、2、3、4、5 cm，電壓設定為170 V，處理時間為100 s。

1.5.1.2 常壓等離子體處理電壓的降解實驗

用乙腈配制初始濃度為10 mg/L的AFB1溶液，置于等離子體上進行處理，電壓設定為150、155、160、165、170 V，放電間距設為2 cm，處理時間100 s。

1.5.1.3 常壓等離子體處理時間的降解實驗

用乙腈配制初始濃度為10 mg/L的AFB1溶液，置于等離子體上進行處理，處理時間設定為50、100、150、200、250 s，放電間距設為2 cm，電壓設定為170 V，處理時間100 s。

1.5.1.4 AFB1初始濃度的脫毒實驗

用乙腈配制初始濃度為10、20、30、40、50 mg/L的AFB1溶液，置于等離子體上進行處理，放電間距設為2 cm，電壓設定為170 V，處理時間為100 s。

1.5.2 Box- Behnken實驗設計

根據單因素實驗結果，由于放電間距對常壓等離子降解AFB1的降解效果已經非常明確，即放電間距越大，AFB1的降解率越小，放電間距不作為響應面法實驗設計的主要因素。因此，選取處理電壓、AFB1初始濃度、處理時間作為主要因子，以AFB1的降解率為響應值，采取3因素3水平的響應面分析法進行實驗設計，以獲得最優實驗參數。實驗設計的因子和水平見表1。

表1 響應面法實驗設計的因子和水平

1.6 AFB1降解率的計算

2 結果與分析

2.1 單因素實驗對AFB1降解率的影響

2.1.1 常壓等離子體放電間距對AFB1降解率的影響

由圖3可知，毒素在170 V的等離子體條件下，放電間距設為1 cm時，AFB1的降解率高達79.76%。放電間距設為5 cm時，AFB1的降解率達22.10%?？梢姡S著放電間距的增加，AFB1的降解率明顯降低。這是由于常壓等離子體的放電間距越大，帶電粒子與AFB1之間的相互作用越小，毒素的降解率越低。

圖3 常壓等離子體放電間距對AFB1降解率的影響

2.1.2 常壓等離子體處理電壓對AFB1降解率的影響

由圖4可知，在常壓等離子體處理電壓為150～170 V范圍內，隨著電壓的升高，AFB1的降解率呈不斷增大的趨勢。原因是常壓等離子體處理電壓變大，帶電粒子運動速度會加快，所以積累電子的速度就快，噴出的等離子體能量、密度均會升高，使得毒素的降解率增大[20]。綜合考慮，選取處理電壓160、165、170 V作為響應面實驗設計的因素水平。

圖4 常壓等離子體處理電壓對AFB1降解率的影響

2.1.3 常壓等離子體放電時間對AFB1降解率的影響

由圖5可知，毒素在170 V的等離子體條件下處理250 s時，AFB1的降解率達92.03%?？梢?，運用常壓等離子體可有效降解AFB1。且在放電時間50～250 s范圍內，隨著時間的增加，AFB1的降解率不斷增大，但增大幅度有所下降。綜合考慮，選取放電時間150、200、250 s作為響應面實驗設計的因素水平。

圖5 常壓等離子放電時間對AFB1降解率的影響

2.1.4 黃曲霉毒素初始濃度對AFB1降解率的影響

由圖6可知，AFB1的降解率隨著AFB1初始濃度的增大而減少。原因可能是當常壓等離子體處理電壓相同時，帶電粒子的運動速度不變，噴出的等離子體能量一定，溶液的初始濃度越低，每個溶質分子接觸到的等離子體能量越大，毒素的降解率越高。即AFB1初始濃度升高不僅使得AFB1的降解效果變差，而且增加成本。綜合考慮，選取AFB1初始濃度5、10、15 mg/L作為響應面實驗設計的因素水平。

圖6 AFB1初始濃度對AFB1降解率的影響

2.2 響應面實驗設計結果

在單因素實驗結果，以常壓等離子體處理電壓、放電時間、AFB1初始濃度為自變量，進行響應面分析實驗，實驗設計結果見表2 。

表2 響應面實驗設計及結果

2.3 響應面實驗結果分析

由表3可知，回歸模型極顯著，失擬項不顯著，R2=0.989 6>0.960 0，說明模型的擬合度較好。在所選的各因素水平范圍內，對AFB1降解率影響的排序為：處理電壓(A)>放電時間(B)>AFB1初始濃度(C)。

表3 響應面方差分析結果

續表3

方差來源平方和自由度均方F值P值顯著性C24．5314．531．940．2067?殘差16．3872．34失擬項13．1934．405．510．0664?純誤差3．1940．8073．71總差1568．6516R21552．27

注：*為差異不顯著(P>0.05)；**為差異顯著(P<0.05)；***為差異極顯著(P<0.01)。

應用Design-Expert 8.0.6進行回歸分析擬合，可得各因素與AFB1降解率之間的回歸方程：

Y=74.36+11.37A+6.18B-2.27C-1.17AB+1.88AC-0.30BC+4.85A2-3.63B2+1.04C2。

圖7顯示，在AFB1初始濃度為10 mg/L時，處理電壓和放電時間對AFB1降解率的交互作用。可知，處理電壓一定時，隨著放電時間的增大，AFB1的降解率增大。當放電時間一定，處理電壓增大時，AFB1的降解率呈上升趨勢，而且響應面顯示坡度較陡，表明放電時間和處理電壓的交互作用顯著。

圖7 處理電壓與放電時間交互影響AFB1降解率的響應面圖

圖8顯示，在放電時間為200 s時，處理電壓和AFB1初始濃度對AFB1降解率的交互作用。處理電壓一定時，隨著AFB1初始濃度的增加，AFB1的降解率減少，但變化幅度不大。當AFB1初始濃度一定時，隨著處理電壓的增大，AFB1的降解率不斷增大。因此，在AFB1初始濃度和處理電壓兩個因素相互影響下，處理電壓對響應值的影響大。

圖8 處理電壓與AFB1初始濃度交互影響AFB1降解率的響應面圖

圖9 放電時間與AFB1初始濃度交互影響AFB1降解率的響應面圖

圖9顯示，在處理電壓165 V時，放電時間和AFB1初始濃度對AFB1降解率的交互作用。當放電時間一定時，AFB1的降解率隨著AFB1初始濃度的增大而減少。當AFB1初始濃度一定時，隨著放電時間的增加，AFB1的降解率不斷增大。

2.4 最佳實驗條件的預測和驗證

通過回歸模型的預測，得到常壓等離子體降解AFB1的最佳實驗條件：處理電壓170 V、放電時間236 s、AFB1初始濃度5 mg/L、放電間距2 cm,此時AFB1理論降解率的最大值為93.94%。在此最佳實驗條件下進行實驗操作，AFB1的降解效果達到92.45%，與模型預測值相接近，偏差為1.49%，得到AFB1降解前后的高效液相色譜圖見圖10。

圖10顯示，乙腈中AFB1經常壓等離子體處理后有明顯的降解效果。

圖10 常壓等離子體降解前后乙腈中AFB1的高效液相色譜圖

3 結論

常壓等離子體對乙腈中的AFB1具有很好的降解作用。AFB1的降解率與處理電壓、放電時間呈正相關；與放電間距、AFB1初始濃度呈負相關關系。

常壓等離子降解乙腈中的AFB1的最佳工藝條件為處理電壓170 V、放電時間236 s、AFB1初始濃度5 mg/L、放電間距2 cm。AFB1的降解率高達92.45%，與模型預測值93.94%相接近，偏差為1.49%。說明該模型可用于常壓等離子體對乙腈中黃曲霉毒素B1降解效果的預測。

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