豬冷凍精液質量影響因素

黃文佳+金穗華

摘要： 本文從豬精液冷凍的過程入手，著重分析了精液稀釋液中的添加劑，并探索了豬冷凍精液質量的影響因素。

關鍵詞：豬冷凍精液；質量；影響因素

中圖分類號： S828 文獻標識碼： A DOI編號： 10.14025/j.cnki.jlny.2017.09.039

人工授精是現代生物技術的一種，能夠充分發揮公畜的遺傳潛力，而精液冷凍是人工授精的重要環節，為人工授精提供了精子庫。但是，人工授精要保證精液在冷凍之后的受精能力。豬冷凍精液質量受到冷凍前處理、稀釋液、冷凍保護劑、解凍等各方面的影響。在冷凍之后，豬冷凍精液的細胞結構很可能發生改變精子的質膜完整性，精子活力和發育能力遠遠低于鮮活精子，因此豬精液冷凍技術要選用合適的稀釋液和糖類，避免精子在冷凍過程主動形成冰晶，進而提高精子的活率，降低冷凍技術對精子質膜和頂體的影響。研究豬冷凍精液質量影響因素不僅能夠優化精液冷凍技術，而且對人工授精的發展有著深刻的現實意義。

1 精液冷凍的過程

1.1降溫

精液在冷凍的過程中需要降溫處理，降溫主要指精液溫度從體溫降低到冰點溫度。而精液降溫需要度過一定的危險溫區，降溫過程對精子的影響非常大，這種影響被稱為低溫打擊。并且精子在解凍的過程中需要從冰點溫度恢復到體溫，而這個過程也需要經過危險溫區，溫度的變化會導致精子的活力下降。具體來說，低溫打擊會損害精子的代謝功能和精子的細胞膜，因為在降溫過程中，精子的細胞膜結構發生了變化。溫度降低會導致細胞膜中的磷脂類物質轉移到溫度較高的地方，精液從結晶狀態轉為凝膠狀態，進而導致細胞膜結構發生變化。在解凍的過程中，磷脂類物質的轉移會誘發精子頂體膜與細胞膜的結合，進而改變精子細胞周圍的蛋白質環境，影響精子細胞蛋白質的活性。另外，低溫打擊還會影響精子細胞的其他功能，例如低溫打擊會損害精子頂體膜，降低細胞膜的通透性。

1.2冷凍與細胞損傷

在冷凍精液的過程中，當溫度降低到零下5℃時，精子細胞內外的水分處于過冷狀態而不會形成結晶。而隨著溫度的降低，當溫度降低到零下10℃時，精子細胞外部的水分會形成結晶，而精子細胞內部的水分也開始固化。而冰晶會產生機械性刺激，損害精子細胞的固有結構。當溫度降至在零下5℃～10℃之間時，冰晶會形成在精子細胞外面的電解質當中，細胞內的水分仍處于過冷狀態，但是從精子細胞脫水的角度來說，精子冷凍過程中的細胞降溫速度必須十分緩慢，允許精子細胞脫水的完全發生，進而避免精子細胞內部水分的固化。速度足夠快的精子細胞脫水能夠避免精子細胞處于高滲環境，而脫水嚴重會導致細胞分子的極端收縮，損害精子。另外精子細胞外部水分形成冰晶之后會縮小精子細胞的空間，對精子細胞造成機械性傷害，這種機械性傷害無法彌補。除此之外，在冷凍的過程中需要在精液稀釋液中添加冷凍保護物質，避免精子細胞內冰晶的形成。常用的冷凍保護物質是甘油，甘油的滲透性較強，能夠降低精子細胞內水分的含量可以滲入到精子細胞內，調節精子細胞由脫水而產生的滲透壓變化。

2 精液稀釋液中的添加劑

為提高精子在冷凍之后的受精能力，相關人員對精子冷凍技術進行了深入研究。在大量的研究中，相關人員發現某些物質可提高精子在冷凍后的運動能力，延長精子解凍后的生存時間，使精子在輸卵管內運動，提高授精率，因此在冷凍精子的過程中，技術人員常在精液稀釋液中添加能夠提高精子活力、延緩精子衰老的物質，這些物質主要包括咖啡因、氨基多糖、己酮可可堿、細胞因子、維生素等。

2.1咖啡因

處理精子的過程中，在精液稀釋液中加入咖啡因能夠有效提高解凍之后，精子的體外受精率和精子的活力。在解凍精子進行體外受精的過程中，需要應用流式細胞儀對精子實行細胞分離，在這個過程中，咖啡因能夠有效保證體外受精。因為咖啡因能夠抑制精子細胞中的磷酸二酯酶的活性，提高精子內的cAMP濃度，促進精子頂體反應發生，進而實現體外受精。但是，咖啡因會影響受精卵的早期發育，因此在受精卵形成之后需要采用離心方式去掉受精卵中的咖啡因，保證受精卵健康發育。

2.2氨基多糖類

一是肝素經常用于誘導動物精子體外獲能，肝素與精子結合能夠使鈣離子進入精子細胞內，進而促進精子的頂體反應，提高精子的受精率；二是透明質酸屬于現行大分子多糖物質，能引起動物精子頂體反應和動物精子獲能。透明質酸存在于雌性動物的生殖道內，促進體內受精。在處理體外受精的過程中，在精液稀釋液中加入透明質酸能夠提高精子的存活率。

2.3己酮可可堿

己酮可可堿是當前生物技術行業十分重視的精子體外處理劑，能有效增強解凍后的精子活力，改善解凍后質量較差的精子。己酮可可堿在體外受精技術中應用十分廣泛，效果較好。己酮可可堿不僅能影響精子的頂體反應和運用能力，而且能刺激精子的運動，使精子在一段時間后仍保持被刺激的運動。另外，己酮可可堿能增強精子的受精力，提高體外受精的幾率。

2.4生殖激素

在精液稀釋液中加入生殖激素可有效提高精子的受精幾率，孕酮能夠誘發精子的頂體反應。孕酮使精液中的鈣離子流進精子內部而發生頂體反應。另外，研究發現，濃度適當的孕酮增強精子的穿卵能力，提高人工授精的成功率。

2.5細胞因子

血小板活化因子被廣泛運用于生物學，是一種活性較強的甘油磷脂，與哺乳動物的排卵、受精、胚胎發育、分娩等生殖過程有著密切聯系。血小板活化因子與磷脂相關，能夠誘導精子發生頂體反應，提高卵細胞的體外受精率，并且血小板活化因子能夠提高精子的運動速度，增強精子活力。

3 豬冷凍精液質量的影響因素

3.1稀釋液與冷凍保護劑的影響

稀釋液是精子在冷凍過程中的保護劑，決定了精液的冷凍效果。常用的精液稀釋液主要由糖、脂質、蛋白質、添加劑、緩沖液、防凍劑等成分組成。而常見的稀釋液主要包括甘油、卵黃、糖類和緩沖物質及其他添加物質等。其中甘油是最重要的冷凍保護劑，能夠深入精子細胞內部，結合或濃縮精子細胞內部的水分。甘油也有一定的稀釋作用，能降低稀釋液中的濃度，減小冷凍液的滲透壓，進而保護處于低溫的精子。但甘油對精子也有一定的負面作用，甘油的濃度、溫度等對豬精子在冷凍之后的存活率有著重要影響，需要冷凍技術人員合理把握添加甘油的時機和甘油的濃度。卵黃能夠有效維持精子的活力，充分保護精子的頂體膜。卵黃的滲透性和緩沖性較強，能使精子承受高滲和低滲。在冷凍技術中，稀釋液中的卵黃濃度約為20%左右。精液稀釋液中的糖類物質主要有果糖、葡萄糖和乳糖，糖類物質能利用自身的滲透性保護細胞，抵抗低溫。但高濃度的糖類物質會低效甘油對精子頂體的傷害，提高精子的活力。另外，葡萄糖在精液稀釋液中的保護效果很好。其他添加物質主要包括HA、HBCD、OEP等物質。HBCD能增加解凍后精子的運動速度，HA能增強精子脂質膜的穩定性。

3.2冷凍前處理影響

豬精子在迅速冷卻時會失去活力，當精液在采集之后迅速冷卻到5℃或0℃時，會失去活力，這種現象被稱為冷休克。豬精子對冷休克十分敏感，需要在冷凍前進行處理。豬精子在用低倍數稀釋液稀釋并緩慢降溫1～5小時之后，才具備一定的抗凍能力。豬精液冷凍需要數個小時，平衡在15℃以上，才能夠保證精液在冷凍之后具備受精能力。

3.3冷凍劑影響

一是安瓿瓶法。安瓿瓶法主要使用硅酸鹽硬質玻璃支撐的容器盛裝豬精液，計量為0.5毫升或1.0毫升。從20世紀50年代開始，豬精液冷凍便開始采用安瓿瓶法。安瓿瓶法的優點是劑量標準、密封性強、標記明顯，不需要使用解凍溶液，精子的復蘇率較高，但是安瓿瓶法也有與一定的缺陷，制作成本較高，容易破裂，體積較大。目前，豬精液冷凍已經很少使用安瓿瓶法；二是顆粒冷凍法。顆粒冷凍法主要指將經過預處理的豬精液滴入干冰內，進而使豬精液快速冷凍。目前，顆粒冷凍法在豬精液冷凍保存中的應用十分廣泛。顆粒冷凍法主要包括快速制凍法和緩慢制凍法；三是細管法。細管法主要將稀釋之后的豬精液裝入大型細管之中，并將細管密封放在液氮上冷凍。運用細管法冷凍之后的豬精子在解凍之后的存活率低于顆粒法，但是細管法冷凍的豬精子受胎率高于顆粒法。細管法的體積較小，容易存放，精子利用率也高，在精液冷凍保存中應用比較廣泛；四是鋁箔袋法。鋁箔袋法主要將經過兩次稀釋之后的豬精液放入鋁箔袋內，封印并用液氮蒸汽冷凍。

3.4冷凍速率影響

在冷凍過程中，豬精子細胞不僅要承受保存溫度，還要承受溫度的變化。豬精子細胞有其理想的解凍和冷凍速率，如果冷凍速率太慢，豬精子與冷凍保護劑接觸的時間過長，會導致豬精子易受到冷凍保護劑的破壞而死亡。但是，如果冷凍速率過快，豬精子細胞在冷凍的過程中會產生細胞內液體結晶現象，對豬精子細胞造成化學或物理損傷。

3.5解凍影響

精子細胞在冷凍過程中需要經受溫度的挑戰，忍受致死溫度區，而精子細胞在解凍過程中還需要接受溫度的挑戰，經歷致死溫度區，而且不同細胞的解凍速率不同。含有精子的冷凍液冷凍到冰點左右時，冷凍液會結冰，但是精子內部的物質并不一定會結冰。精子內部的膜質會與妨礙冰晶的擴張，導致液體在精子細胞內外流動。當溫度下降時，過冷的精子細胞水分會受到細胞外的滲透壓力滲出精子細胞外。精子細胞水分的滲透率會受到細胞因素的影響，尤其是特定溫度下精子細胞膜對甘油和水的滲透率的影響。精子細胞冷凍技術利用外部因素來調節細胞水分滲透的方法是通過控制豬精液冷凍速率或添加冷凍保護劑完成的。如果冷凍速率夠慢，精子能夠通過細胞外部的滲透壓力來減少精子細胞內部的水分，避免精子細胞內部大冰晶的形成。如果冷凍速率過快，精子細胞內部的水分將無法滲出，產生大冰晶。另外，如果解凍速率過慢，豬精子與解凍液的接觸時間過長而受到解凍液破壞，如果解凍速率過快，豬精液很容易出現沒有完全解凍的現象，從而影響豬精子的活力。

參考文獻

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作者簡介：黃文佳，本科學歷，助理工程師，研究方向：遺傳育種。

通訊作者：金穗華，高級畜牧師，研究方向：家畜繁殖與家畜精液質量檢驗技術等。