AKT/GSK—3β—Wnt/β—catenin信號通路調控糖尿病血管鈣化的研究新進展

許凱強+劉勇

【摘要】 在全世界范圍內，糖尿病的發病率越來越高，而血管鈣化作為糖尿病的并發癥之一，在2型糖尿病患者的疾病發生、發展過程中占據著越來越重要的地位。血管鈣化是一個與炎癥相關的類似于骨組織中的成骨分化形式的大型的主動調控的過程。有研究表明，在糖尿病血管鈣化中，PI3K/AKT信號通路能通過直接或者間接的方式激活wnt/β-catenin信號通路，從而促進了血管平滑肌細胞的成骨分化。本文分別從AKT、GSK-3β、Wnt/β-catenin等三個方面闡述其與血管鈣化之間的聯系。

【關鍵詞】 血管鈣化； AGEs； AKT； GSK-3β； Wnt/β-catenin

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2017.10.087 文獻標識碼 A 文章編號 1674-6805（2017）10-0162-03

血管鈣化大多數是在血管壁中以羥磷灰石的形式存在的礦物硫酸鈣的沉積。血管鈣化是許多疾病一個共同的顯著特點，這些疾病包括動脈粥樣硬化，糖尿病，慢性腎臟疾病等，在越來越多的國家，血管鈣化逐漸成為心腦血管疾病發病率和致死率的一個強有力的預測指標[1]。血管鈣化過去一度被認為僅僅是一個被動的細胞凋亡和死亡的過程，但越來越多研究結果證明，血管鈣化是一個與炎癥相關的類似于骨組織中的成骨分化的主動調控過程。Proudfoot等[2]研究發現，血管平滑肌細胞目前被認為是主要負責血管鈣化的細胞，來自平滑肌細胞的凋亡小體能作為鈣晶體形成的成核結構來啟動血管鈣化。Ox-LDL已經被揭示具有能在在動物體內和體外誘導血管平滑肌鈣化的能力[3]。此外，Trion等[4]研究發現，血管平滑肌細胞（Vascular smooth muscle cells，VSMCs）可以向成骨細胞分化和表達成骨關鍵轉錄因子-Runx2和其他骨形成相關蛋白，如Ⅰ型膠原蛋白（ColⅠ），堿性磷酸酶（ALP）、骨鈣素等，這些蛋白導致磷酸鈣在細胞外基質沉積。而這些成骨相關蛋白均受AKT/GSK-3β-Wnt/β-catenin信號通路的調控。只有少數學者闡述了Wnt/β-catenin信號通路的一些目標點之間的關系，如LRP5和血管平滑肌鈣化之間的關系。在Rajamannan 等[3]的研究中，證明了血管平滑肌的鈣化發生常伴隨GSK-3β和β-catenin蛋白表達的上調，而兩者均是Wnt/β-catenin信號通路的關鍵目標點。本文即是對該信號通路的最新研究進展作一綜述。

1 AGEs與血管鈣化

晚期糖基化終末產物（advanced glycation end products ，AGEs）是在蛋白質和糖殘基的非酶反應期間形成的分子異源基團。AGEs通過細胞外基質蛋白及細胞內信號分子的結構修飾和功能改變而引發糖尿病性微血管和大血管并發癥。AGEs與糖尿病血管并發癥關系復雜，迄今都未能完全闡明其相互關系，但是，AGEs的增加介導了糖尿病血管并發癥的發生已經得到大多數學者的公認。此外，糖尿病血管并發癥與內皮細胞、平滑肌細胞關系密切。

RAGE與AGEs的結合引起細胞內活性氧（ROS）生成，隨后活化有絲分裂原活化蛋白激酶（MAPK）和核因子κ-B（NF-κB）信號，隨后產生幾種炎癥和促纖維化因子，如細胞間粘附分子-1（ICAM-1），血管細胞粘附分子-1（VCAM-1），單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）和纖溶酶原激活物抑制劑-1（PAI-1）等來促進動脈血管粥樣硬化的進展。

2 AKT與血管鈣化

PI3K/AKT信號通路廣泛存在于各種細胞中，是參與細胞增殖、分化和生長的重要信號傳導通路。AKT是PI3K的下游效應子，PI3K激活AKT后使AKT的Ser473和Thr308位點磷酸化，從而激活AKT。而活化的AKT，進一步激活其下游因子，如bcl-2家族、糖原合成酶 3（GSK3）和S6 蛋白激酶等，對細胞周期、凋亡等產生調節作用。有研究表明，晚期糖基化終末產物（AGEs）能激活PI3K/AKT信號通路，從而使活化的磷酸化AKT在血管平滑肌細胞中的表達量明顯升高，而AKT的活化又能抑制下游GSK的活性，從而促進細胞的凋亡。多信號分子可以調節GSK-3活性。其中一個最好研究的GSK-3的調節劑是AKT，其位于PI3K/PTEN/AKT/mTORC1通路5。AKT是一種S/T激酶，描述了參與細胞生長調節的許多關鍵蛋白凋亡配體激活生長因子（GF）時，PI3K/PTEN/AKT/mTORC1，Ras/Raf/MEK/ERK和其他途徑同時也被激活[4-6]。AKT活化可作用于磷酸化GSK-3導致其失活。由此可見，在糖尿病血管鈣化中，PI3K/AKT信號通路能通過直接或者間接的方式激活wnt/β-catenin信號通路，從而促進了血管平滑肌細胞的成骨分化。

3 GSK-3β與血管鈣化

糖原合酶激酶-3（GSK-3）是一種參與一系列關鍵細胞過程的絲氨酸/蘇氨酸激酶。主要由GSK-3α（51kDa）和GSK-3β（47kDa）組成。雖然這兩個GSK-3家庭成員有許多保守的生化功能，但其在神經和血管及其他組織中也有著獨特的活性和發揮著不同的生物學功能[7]。GSK-3還涉及許多信號通路，其不僅調節代謝，而且還參加包括細胞周期進程、細胞更新、分化、細胞凋亡、胚胎發生、遷移、基因轉錄調節、干細胞生物學等一系列過程。

GSK-3是一種可以磷酸化絲氨酸（S）和蘇氨酸（T）殘基上許多底物的激酶。許多底物首先被酪蛋白激酶Ⅰ（CKI）和其他有著特定底物蛋白的激酶磷酸化，其他激酶也可以通過磷酸化GSK-3以調節其活性。這些激酶包括促分裂原活化激酶[aka胞外調節激酶1，2（ERK1，2）]，p38 MAPK，蛋白激酶A。此外，GSK-3還可以通過酪氨酸（Y）激酶如Src，蛋白酪氨酸激酶2β（PYK2）來調節其活性。GSK-3也可以通過蛋白磷酸酶脫磷酸化來調節其活性，這些蛋白磷酸酶包括：蛋白磷酸酶2A（PP2A）和PP1[8]。此外GSK-3也可以自身磷酸化。

在細胞應激期間，糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）可以通過絲氨酸-1235磷酸化來抑制AKT與mTORC2的結合。在沒有功能的雷帕霉素靶蛋白C2（mammalian target of rapamycin， mTORC2）作用下，AKT沒有被完全激活。因此，雖然AKT可以負面調節GSK-3活性，但GSK-3依然可以在一定的環境下促進或抑制AKT的激活。通過雷帕霉素抑制Wnt介導的mTORC1的活化抑制Wnt介導的細胞增殖。同樣，通過二甲雙胍激活AMPK也可抑制Wnt介導的細胞增殖[9]。除了GSK-3，其他Wnt信號組分，如DKK 1，Dvl和Axin都可以調節Wnt對mTORC1和細胞增殖的影響。

GSK-3β是腺瘤性大腸桿菌/axin/GSK-3β復合物的組分部分，參與β-catenin的泛素化和蛋白酶體的降解，而β-catenin是Wnt/β-catenin信號通路的關鍵分子[10]。TWS119是GSK-3β的抑制劑。因此，TWS119通過抑制GSK-3β來抑制β-catenin的降解，理論上激活Wnt/β-catenin信號通路，從而引起糖尿病血管中膜的鈣化。

4 Wnt/β-catenin與血管鈣化

Wnt信號通路作為一種在進化中高度保守的信號通路，在生長、發育、代謝和干細胞維持等多種生物學過程中發揮重要作用。Wnt/β-catenin信號傳導通路在正常生長和發育中發揮著重要的作用，若該通路失調，則有可能引起癌癥和其它疾病的發生[11]。Wnt通路的過度激活與多種癌癥（包括結腸癌、胃癌、乳腺癌等）的發生緊密相關，這已經也得到了大多數學者的認可。然而，目前關于其通路對血管鈣化的影響的研究卻為數不多。Schans等[12]最新研究表明，Wnt信號被認為能在血管發育的不同方面起作用，包括血管內皮和血管平滑肌細胞的增殖等。許多研究都聚焦在了經典Wnt通路也就是Wnt /β-catenin信號通路上面。Wnt信號在成骨細胞分化中扮演著多重角色，包括成骨細胞譜系分化，調節各個方面骨穩態和破骨細胞形成的衰減等[13]。

Wnt蛋白是生長因子大家族中的一員，Wnt蛋白家族由至少19個成員組成，它對于體內多種細胞發揮生物學功能起著重要的作用[14]。一些Wnt蛋白，如Wnt1、Wnt3a、Wnt4、Wnt5、Wnt10b和Wnt13等，都可以通過激活兩條主要的信號通路來調控成骨細胞的形成[15]。在經典的Wnt/β-catenin途徑中，Wnt蛋白通過結合低密度脂蛋白受體相關pro-TIN5/6（LRP5/6）共受體和膜卷曲G蛋白偶聯受體的受體復合物（FGRs）來發揮作用。這種結合可以誘導腺瘤性息肉病大腸桿菌、軸突復合物和糖原合酶激酶（GSK）-3β等的解離，導致胞質的積累和β-catenin的核易位[16]。Wnt通路也激活轉錄因子T細胞因子（TCF）和淋巴細胞增強因子（LEF）并與β-catenin一起來控制體軸的形成、成骨細胞的分化、存活以及增殖。在非經典Wnt途徑，G-蛋白介導的Wnt-β-catenin，Wnt/cAMP，和零星介導的c-Jun N末端激酶信號組件是重要的組成部分[17]。

有研究表明，Wnt/β-catenin 與平滑肌細胞的成骨分化密切相關，Kook等[18]研究發現，Wnt1刺激人主動脈平滑肌細胞（Human aortic smooth muscle cells，HASMC）的分化常常伴隨著糖原合酶激酶（GSK）-3β的磷酸化表達的增強，以及骨特異性因子（Runx2），Osterix2（Osx2），ALP，Ⅰ型膠原，骨橋蛋白和骨鈣蛋白等蛋白的表達增加，表明Wnt1刺激HASMC的成骨分化和鈣化，主要通過激活經典Wnt /β-catenin途徑，其中Runx2是關鍵的下游調節劑。

Runt相關轉錄因子2（Runx2）是軟骨細胞的成熟和成骨細胞的分化必不可少的關鍵因子[19]，Wnt信號通過刺激Runx2來誘導成骨細胞分化。直接將Runx2啟動子與TCF或LEF/b-連環蛋白相結合被認為是Wnt配體刺激Runx2蛋白表達的主要機制之一[20]。Wnt10b的過表達可以抑制骨丟失并驅動間充質干細胞通過上調Runx2向成骨細胞譜系分化[21]。

在Wnt的存在下，β-catenin的磷酸化被CK1和GSK-3所抑制，并且β-catenin可以與各種轉錄因子（例如TCF/LEF）相結合形成復合物，從而誘導許多基因的轉錄。同時，在Wnt的存在下，CK1和GSK-3可以磷酸化低密度脂蛋白受體相關蛋白（LRP5/6），促進黑素細胞信號轉導。在不存在Wnt受體卷曲（Fz）的配體的情況下，CK1只磷酸化β-catenin。這用作GSK-3在S41，S37和S33中使β-catenin磷酸化。磷酸化可以導致β-catenin的失穩和泛素化以及隨后的蛋白酶體降解。如果β-catenin在調節性殘基（S45，S41，S37和S33）處突變，則其可能不被CK1和GSK-3磷酸化[22]。

血管動脈中膜鈣化與糖尿病患者主要心血管并發癥及死亡率升高密切相關。血管鈣化逐漸成為心腦血管及周圍血管疾病發病率和致死率的一個強有力的預測指標。在眾多的糖尿病血管病變的發病機制中，AGEs異常激活Wnt/β-catenin信號通路與糖尿病血管鈣化存在著密切的聯系，這一點已經被眾多的學者所認可。但是在糖尿病血管病變中，晚期糖基化終末產物（AGEs）是通過何種機制去激活AKT/GSK-3β-Wnt/β-catenin信號通路仍不是很清楚，在未來的實驗研究中，定會進一步明確兩者之間的關系，為我們預防糖尿病血管鈣化及其周圍血管并發癥提供新的治療指導。

參考文獻

[1] Sage A P，Tintut Y，Demer L L.Regulatory mechanisms in vascular calcification[J].Nat Rev Cardiol，2010，7（9）：528-536.

[2] Proudfoot D，Skepper J N，Hegyi L，et al.Apoptosis regulates human vascular calcification in vitro：evidence for initiation of vascular calcification by apoptotic bodies[J].Circ Res， 2000，87（11）：1055-1062.

[3] Rajamannan N M，Subramaniam M，Caira F，et al.Atorvastatin inhibits hypercholesterolemia-induced calcification in the aortic valves via the Lrp5 receptor pathway[J].Circulation， 2005，112（9）：229-234.

[4] Trion A，Laarse A.Vascular smooth muscle cells and calcification in atherosclerosis[J].Am Heart J， 2004，147（5）：808-814.

[5] Toker A，Marmiroli S.Signaling specificity in the Akt pathway in biology and disease[J].Adv Biol Regul，2014，55（4）：28-38.

[6] Follo M Y，Manzoli L，Poli A，et al.PLC and PI3K/Akt/mTOR signalling in disease and cancer[J].Adv Biol Regul， 2015，57（55）：10-16.

[7] Banerji V，Frumm S M，Ross K N，et al.The intersection of genetic and chemical genomic screens identifies GSK-3alpha as a target in human acute myeloid leukemia[J].J Clin Invest，2012，122（3）：935-947.

[8] Bennecib M.Role of protein phosphatase-2A and -1 in the regulation of GSK-3，cdk5 and cdc2 and the phosphorylation of tau in rat forebrain[J].FEBS Lett，2000，485（1）：87-93.

[9] Inoki K，Kim J，GuanK L.AMPK and mTOR in cellular energy homeostasis and drug targets[J].Annu Rev Pharmacol Toxicol， 2012，52（52）：381-400.

[10] Han P，Ivanovski S，Crawford R，et al.Activation of the Canonical Wnt Signaling Pathway Induces Cementum Regeneration[J].J Bone Miner Res，2015，30（7）：1160-1174.

[11] Clevers H，Nusse R.Wnt/beta-catenin signaling and disease[J].Cell，2012，149（6）：1192-1205.

[12] Schans V A，Smits J F，Blankesteijn W M.The Wnt/frizzled pathway in cardiovascular development and disease：friend or foe？ [J].Eur J Pharmacol，2008，585（2-3）：338-345.

[13] Hartmann C.A Wnt canon orchestrating osteoblastogenesis[J].Trends Cell Biol，2006，16（3）：151-158.

[14] Hartmann C.Skeletal development-Wnts are in control[J].Mol Cells，2007，24（2）：177-184.

[15] Liu F，Kohlmeier S，Wang C Y.Wnt signaling and skeletal development[J].Cell Signal，2008，20（6）：999-1009.

[16] Gordon M D，Nusse R.Wnt signaling：multiple pathways， multiple receptors， and multiple transcription factors[J].J Biol Chem，2006，281（32）：22429-22433.

[17] Bodine P V，Komm B S.Wnt signaling and osteoblastogenesis[J].Rev Endocr Metab Disord，2006，7（1-2）：33-39.

[18] Kook S H，Heo J S，Lee J C.Crucial roles of canonical Runx2-dependent pathway on Wnt1-induced osteoblastic differentiation of human periodontal ligament fibroblasts[J].Mol Cell Biochem，2015，402（1-2）：213-223.

[19] Gao C，Holscher C，Liu Y，et al.GSK3：a key target for the development of novel treatments for type 2 diabetes mellitus and Alzheimer disease[J].Rev Neurosci，2011，23（1）：1-11.

[20] Amar S，Belmaker R H，Agam G.The possible involvement of glycogen synthase kinase-3 （GSK-3） in diabetes， cancer and central nervous system diseases[J].Curr Pharm Des，2011，17（22）：2264-2277.

[21] Forlenza O V，Paula V J，Machado V R，et al.Does lithium prevent Alzheimers disease？[J].Drugs Aging， 2012，29（5）：335-342.

[22] McCubrey J A，Rakus D，Gizak A，et al.Effects of mutations in Wnt/beta-catenin， hedgehog，Notch and PI3K pathways on GSK-3 activity-Diverse effects on cell growth，metabolism and cancer[J].Biochim Biophys Acta，2016，1863（12）：2942-2976.

（收稿日期：2016-12-16）

基金項目：2012年度國家自然科學基金資助項目

（項目編號：81270358）

①西南醫科大學附屬醫院 四川 瀘州 646000