前列腺素E1預處理對膽汁淤積大鼠肝缺血再灌注損傷的保護作用

徐 鋒， 劉曉琳， 王 超， 戴朝六

(中國醫科大學附屬盛京醫院 肝膽脾外科， 沈陽 110004)

前列腺素E1預處理對膽汁淤積大鼠肝缺血再灌注損傷的保護作用

徐 鋒， 劉曉琳， 王 超， 戴朝六

(中國醫科大學附屬盛京醫院 肝膽脾外科， 沈陽 110004)

目的 探討前列腺素E1(PGE1)對膽汁淤積肝臟缺血再灌注損傷的保護機制。方法 36只雄性Wistar大鼠隨機分為前列腺素E1組(PGE組)和生理鹽水組(NS組)。PGE組肝缺血前15 min至再灌注60 min經門靜脈持續泵入PGE1(0.5 μg·kg-1·min-1)，NS組給予等量生理鹽水。結扎膽總管，建立膽汁淤積模型。7 d后Pringle法阻斷入肝血流15 min，于再灌注1、6和24 h，檢測血清生化酶和膽紅素，以及肝組織髓過氧化物酶(MPO)、TNFα、Bcl-2、Bax、熱休克蛋白(HSP)70和病理組織學改變。結果 再灌注1、6和24 h，2組TBil和DBil水平比較，差異均無統計學意義(P值均>0.05)。再灌注1、6和24 h，PGE組ALT、AST、MPO和TNFα水平均顯著低于NS組，差異均有統計學意義(P值均<0.05)。再灌注1、6和24 h，PGE組Bcl-2水平顯著高于NS組，Bax水平顯著低于NS組，差異均有統計學意義(P值均<0.05)。再灌注1 h和6 h，PGE組HSP70 mRNA表達水平明顯高于NS組，差異均有統計學意義(P值均<0.05)。再灌注24 h，2組HSP70 mRNA表達水平差異無統計學意義(P>0.05)。PGE組肝組織損傷程度均較NS組輕，表現為肝細胞腫脹減輕，肝細胞壞死減少，肝細胞索及肝竇結構比較清晰，肝細胞索排列較規則，肝竇明顯增寬。結論 PGE1通過減少中性粒細胞浸潤和Bax表達，以及增強HSP70和Bcl-2表達保護膽汁淤積肝臟的缺血再灌注損傷。

膽汁淤積； 再灌注損傷； 前列地爾； 大鼠, Wistar

惡性膽道梗阻根治性手術有時需聯合切除部分肝臟，入肝血流阻斷是切肝時常用的控制術中出血的方法，隨之難免會引起肝臟缺血再灌注損傷。膽汁淤積會導致肝臟微循環障礙和缺血再灌注前后的能量代謝異常，加重肝損傷[1]。如何減輕膽汁淤積肝臟的缺血再灌注損傷一直是困擾肝臟外科醫生的一個難題。盡管動物實驗證實術前膽道引流能夠減輕缺血后肝臟再灌注損傷[2]，但薈萃分析顯示術前膽道引流并沒有提高惡性膽道梗阻患者術后療效和安全性[3]。因此，術前是否減黃至今仍存在爭議。

藥物預處理則被證明是一種有效的防護手段。前列腺素E1(prostaglandin E1, PGE1)具有擴張血管、抗血小板聚集等作用，能夠改善肝臟的微循環，增加其能量代謝和膽汁的分泌，能夠防護肝臟缺血再灌注損傷[4]。但其在膽汁淤積肝臟缺血再灌注損傷中的防護機制尚未闡明，本研究就此機制進行初步探討。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 雄性Wistar大鼠36只，清潔級，體質量(270±20)g，購自中國醫科大學附屬盛京醫院動物實驗中心。PGE1購自北京賽生藥業有限公司。髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。TNFα ELISA試劑盒購自上海森雄科技實業有限公司。Bcl-2和Bax一抗購自SANTA CRUZ生物技術有限公司。即用型SP免疫試劑盒(SP9000)和DAB顯色試劑盒購自中國北京中山生物技術有限公司。逆轉錄PCR(RT-PCR)試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 動物模型制備及分組 用隨機數字表法將大鼠隨機分為PGE1組(PGE組)和生理鹽水組(NS組)，各組再隨機分為再灌注1、6和24 h亞組。參照文獻[5]將膽總管結扎后切斷，喂養1周，建立膽汁淤積肝臟模型。造模結束后離斷肝周韌帶，肝臟缺血前PGE組經門靜脈持續泵入PGE1(0.5 μg·kg-1·min-1)15 min，NS組給予等量生理鹽水。用無創傷動脈夾Pringle法完全阻斷入肝血流，15 min后恢復肝臟血供。于再灌注期間持續泵入PGE1或生理鹽水 60 min，并建立膽道內引流：將一外徑0.9 mm硬膜外導管插入膽總管，另一端插入十二指腸。分別于再灌注1、6和24 h時取腹主動脈血，靜置，離心，將血清置于-20 ℃冰箱保存，待測生化酶及膽紅素水平。取左外葉肝組織置于10%中性甲醛溶液固定，待做病理檢測。取右葉肝組織，置于液氮，再轉至-80 ℃冰箱保存，待測肝組織MPO、TNFα、Bcl-2、Bax和熱休克蛋白(heat shock protein,HSP)70。

1.3 血清生化酶和膽紅素檢測 用全自動生化分析儀檢測血清TBil、DBil、ALT和AST，由中國醫科大學附屬盛京醫院檢驗科協助完成。

1.4 肝組織病理檢測 肝組織塊常規石蠟包埋、切片，HE染色，光鏡下觀察肝臟病理組織學改變。

1.5 免疫組化檢測Bcl-2和Bax表達 取10%甲醛溶液固定的肝組織塊，石蠟包埋，常規4 μm切片，采用SP法測定肝組織中Bcl-2和Bax表達。兔抗鼠Bcl-2和Bax單克隆抗體均按1∶75稀釋，DAB顯色，蘇木素復染，樹膠封片。細胞漿出現棕黃色顆粒判斷為Bcl-2、Bax陽性表達細胞。用OLYMPUS-B5X型顯微鏡及圖像分析系統掃描，400倍鏡下隨機選擇5個視野采集圖像，用圖像分析軟件進行分析，測Bcl-2和Bax表達積分光密度值。

1.6 肝組織MPO活力檢測 稱取質量<100 mg的肝組織塊，冰水中勻漿，制成5%肝組織勻漿，4 ℃，16 000 r/min離心10 min，按照試劑盒說明書操作，用紫外分光光度計460 nm測定其吸光度，檢測MPO活力。1.7 ELISA檢測TNFα表達 稱取質量<100 mg的肝組織，冰水中勻漿，16 000 r/min離心10 min，取上清液。建立TNFα標準曲線，在每一待測品孔加樣品100 μl，混勻后37 ℃水浴120 min。洗滌5次，每孔加一抗50 μl，37 ℃水浴60 min。洗板后每孔加酶標抗體100 μl，37 ℃水浴60 min。洗板后每孔加底物100 μl，暗處37 ℃反應10 min后加終止液。用全自動酶標儀492 nm測定吸光值及TNFα水平。

1.8 RT-PCR檢測肝臟HSP70 mRNA表達 稱取0.5 g肝組織，加TRIzol提取總RNA。采用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定所提取RNA的質量。用紫外分光光度計測定RNA濃度和純度。將樣本RNA稀釋成為1 μg/μl，置于-80 ℃冰箱保存。RNA逆轉錄合成cDNA按照試劑盒說明書操作。采用PCR反應體系來檢測目的基因的表達情況。引物設計通過美國國立圖書館Medline基因庫進行基因檢索，由北京三博遠志生物技術有限責任公司協助合成。HSP70：上游引物，5′-GCGGGATGTATCGGGTTC-3′；下游引物，5′-TGGACAGGGAGTGCTTGG-3′。β-actin：上游引物，5′-CACCCTGTGCTGCTCACCGAGGCC-3′；下游引物，5′-CCACACAGATGACTTGCGCTCAGG-3′。將2 μl經逆轉錄合成的cDNA加入25 μl PCR反應體系內，95 ℃變性，55 ℃退火，72 ℃延伸，HSP70循環35個周期，β-actin循環30個周期。所有標本都重復檢測3次。以β-actin作為內對照擴增，在2%的瓊脂糖溴化乙錠凝膠上電泳，掃描測定PCR產物帶密度，對比HSP70產物帶和β-actin產物帶密度值，相對定量HSP70基因表達水平。

2 結果

2.1 血清TBil、DBil、ALT和AST水平 再灌注1、6和24 h，PGE組TBil、DBil水平與NS組比較，差異均無統計學意義(P值均>0.05)。再灌注1、6和24 h，PGE組ALT和AST水平均顯著低于NS組，差異均有統計學意義(P值均<0.05)(圖1)。

圖1 PGE組和NS組血清膽紅素和生化酶水平

2.2 肝組織病理形態學觀察 NS組再灌注1 h，肝細胞腫脹，肝竇變窄，肝細胞索和肝竇分界不清，中性粒細胞浸潤增加，肝竇內大量中性粒細胞聚集；尤其是再灌注6 h，肝組織結構更加紊亂不清，中央靜脈周圍出現大量壞死的肝細胞；再灌注24 h，肝細胞腫脹稍有減輕，肝竇間隙稍有增寬。PGE組再灌注不同時間點肝組織損傷程度均較NS組輕，表現為肝細胞腫脹減輕，肝細胞索及肝竇結構比較清晰，肝細胞索排列較規則，肝竇明顯增寬；尤其是再灌注6 h，肝細胞壞死明顯較少(圖2)。

圖2 PGE組與NS組肝組織形態學改變(HE染色，×400) a：NS組再灌注1 h；b：PGE組再灌注1 h；c：NS組再灌注6 h；d：PGE組再灌注6 h；e：NS組再灌注24 h；f：PGE組再灌注24 h

2.3 肝組織Bcl-2和Bax表達 再灌注1、6和24h，PGE組肝組織Bcl-2表達水平均顯著高于NS組，平均積分光密度分別為10.259±3.516 vs 3.133±0.588、13.542±1.682 vs 8.172±1.124和6.952±1.419 vs 2.028±0.738；t值分別為3.462、4.598和5.332；P值分別為0.026、0.010和0.006。PGE組Bax 表達水平均顯著低于NS組，平均積分光密度分別為6.196±1.827 vs 9.835±1.226、7.515±2.179 vs 13.943±3.145和10.375±2.408 vs 16.867±2.943；t值分別為2.865、2.910和2.957；P值分別為0.045、0.043和0.041(圖3，4)。

圖3 PGE組與NS組Bcl-2表達情況 a：NS組再灌注1h；b：PGE組再灌注1h；c：NS組再灌注6 h；d：PGE組再灌注6 h；e：NS組再灌注24 h；f：PGE組再灌注24 h

圖4 PGE組與NS組Bax表達情況 a：NS組再灌注1 h；b：PGE組再灌注1 h；c：NS組再灌注6 h；d：PGE組再灌注6 h；e：NS組再灌注24 h；f：PGE組再灌注24 h

2.4 肝組織MPO水平 再灌注1、6和24 h，PGE組肝組織MPO水平均顯著低于NS組，差異均有統計學意義(P值均<0.05)；且再灌注6 h肝組織MPO水平達峰值，此后2組MPO水平均有下降趨勢(P值均<0.05)(圖5)。

2.5 肝組織TNFα水平 PGE組再灌注1、6和24 h肝組織TNFα水平均顯著低于NS組，差異均有統計學意義(P值均<0.05)。再灌注6 h，2組肝組織TNFα水平達峰值，再灌注24 h時2組TNFα水平均有顯著下降(P值均<0.05)(圖6)。

圖5 PGE組與NS組肝組織MPO表達水平

圖6 PGE組與NS組肝組織TNFα表達水平

2.6 肝臟HSP70 mRNA表達 再灌注1 h和6 h，PGE組HSP70 mRNA表達水平明顯高于NS組，差異均有統計學意義(P值均<0.05)。再灌注24 h，2組HSP70 mRNA表達水平差異無統計學意義(P>0.05)。PGE組HSP70 mRNA表達水平隨再灌注時間延長呈逐漸下降趨勢(圖7)。

圖7 PGE組與NS組肝組織HSP70 mRNA表達水平

3 討論

膽汁淤積肝臟缺血再灌注損傷是肝臟外科時常面臨的一個重要臨床問題。缺血再灌注損傷不但會引起術后肝功能不全甚至衰竭，而且還能促使腫瘤發生肝轉移[4,6-7]。如何減輕缺血再灌注對膽汁淤積肝臟的損傷對提高惡性膽道梗阻肝切除患者的生存率具有重要作用。本研究旨在通過PGE1預處理來防護膽汁淤積肝臟的缺血再灌注損傷，以期為臨床提供一種可行的方法。

研究結果顯示：缺血再灌注后血清生化酶ALT和AST呈進行性升高，肝細胞損傷進行性加重，再灌注6 h達峰值，再灌注24 h肝組織損傷逐漸恢復。PGE1預處理能顯著降低再灌注后血清ALT和AST水平，減輕肝細胞損傷，改善肝組織病理改變。眾所周知，ALT和AST是評價肝細胞損傷程度的常用指標。肝臟缺血再灌注時ALT水平與肝細胞壞死程度和范圍呈正相關，尤其在再灌注24 h時二者相關性更加明顯[8]。本研究結果也進一步證實了ALT水平與肝細胞壞死程度的相關性，說明PGE1預處理對膽汁淤積肝臟缺血再灌注損傷具有保護作用。其保護機制與以下因素有關：

(1)減少肝臟中性粒細胞浸潤。MPO是反映中性粒細胞浸潤較為敏感的指標。TNFα則是浸潤的中性粒細胞釋放的一個重要細胞因子[9]。本研究結果顯示，再灌注后NS組肝組織MPO和TNFα表達水平均明顯增加，至再灌注6 h達峰值。這提示缺血再灌注后肝臟中性粒細胞浸潤增加。肝組織病理也證實肝竇內大量中性粒細胞聚集。PGE1預處理后MPO和TNFα表達水平均顯著下降，說明PGE1能夠減少中性粒細胞浸潤。這與先前研究[10]結果吻合。PGE1可通過抑制血小板聚集，改善微循環[11]；抑制肝竇內皮細胞分泌血管細胞黏附分子-1、細胞間黏附分子-1、P選擇素和E選擇素表達，從而抑制中性粒細胞-內皮細胞的相互作用，減少中性粒細胞與肝竇內皮細胞黏附和滲出[4,12]。還能抑制TNFα等炎性細胞因子釋放[11-12]。進而減少TNFα介導NF-κB或PGC-1α/Mfn2信號通路引起的肝損傷[13-14]。

(2)提高肝組織對缺血再灌注損傷的應激能力。本研究結果顯示，PGE1預處理能顯著提高缺血再灌注后肝組織HSP70 mRNA表達。有研究表明，HSP70 mRNA和蛋白在正常細胞和非缺血肝組織都檢測不到，只有在應激狀態下(如溫度升高、缺血再灌注、TNFα、內毒素和急性炎癥等)才能大量產生。HSP70 mRNA表達要先于HSP70蛋白，前者在肝缺血早期即有表達，再灌注后表達增強；而且隨著缺血時間延長、損傷加重，其表達也增強；隨著肝損傷逐漸修復，其表達也逐漸消退。HSP70蛋白直到再灌注12 h才能檢測到，48～72 h達高峰[15-16]。HSP70能作用于Kupffer細胞，抑制其產生活性氧自由基，或是通過抑制氧自由基關鍵酶NADPH 氧化酶，減少活性氧族的產生，增強肝細胞耐受力[17-18]。HSP70還能與缺血再灌注時產生的未折疊或變性蛋白結合，使其維持肽鏈伸展狀態，防止錯誤折疊聚集，恢復正確的折疊，對無法挽救的變形蛋白加速降解清除，保持肝細胞內穩態，減少肝細胞損傷破壞[19]。

(3)減少肝組織Bax表達，增強Bcl-2表達，減少肝細胞凋亡。本研究結果顯示，PGE組相對于NS組再灌注后肝組織致凋亡蛋白Bax表達減少、抗凋亡蛋白Bcl-2表達增加，說明PGE1預處理能減少肝細胞凋亡。當肝臟缺血再灌注時Bax表達被激活，導致羧基末端區域外露，與線粒體外膜結合，進一步促使線粒體釋放caspase3和凋亡誘導因子等[20]。Bax還能與Bcl-2形成異源二聚體，促使內質網釋放Ca2+，與細胞色素C相互作用激活caspase信號轉導通路，產生凋亡小體，誘導凋亡形成[21]。Bcl-2作為抗氧化物則能調節細胞的氧化還原狀態，阻止細胞成分發生氧化損傷和DNA斷裂，保護細胞核免于損傷；此外，還可以影響細胞膜轉運，改變Ca2+分布，抑制線粒體釋放細胞色素C[22]。從而抑制肝細胞凋亡的發生。

總的來說，PGE1通過減少肝內中性粒細胞浸潤和Bax表達，增強HSP70和Bcl-2表達，對膽汁淤積肝臟缺血再灌注損傷起到了保護作用，但其更深入的作用機制有待進一步研究。

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引證本文：XU F, LIU XL, WANG C, et al. Protective effect of prostaglandin E1 pretreatment against liver ischemia-reperfusion injury in rats with cholestasis[J]. J Clin Hepatol, 2017, 33(5): 899-904. (in Chinese) 徐鋒， 劉曉琳， 王超， 等. 前列腺素E1預處理對膽汁淤積大鼠肝缺血再灌注損傷的保護作用[J]. 臨床肝膽病雜志, 2017, 33(5): 899-904.

(本文編輯：朱 晶)

Protective effect of prostaglandin E1 pretreatment against liver ischemia-reperfusion injury in rats with cholestasis

XUFeng,LIUXiaolin,WANGChao,etal.

(DepartmentofHepatobiliaryandSplenicSurgery,ShengjingHospitalofChinaMedicalUniversity,Shenyang110004,China)

Objective To investigate the protective mechanism of prostaglandin E1 (PGE1) against liver ischemia-reperfusion injury in rats with cholestasis. Methods A total of 36 male Wistar rats were randomly divided into PGE1 group (PGE group) and normal saline group (NS group). The rats in the PGE group were treated with continuous pump of PGE1 (0.5 μg/kg/min) from 15 minutes before liver ischemia to 60 minutes of reperfusion, and those in the NS group were given normal saline of the same volume. Common bile duct ligation was performed to establish a rat model of cholestasis. Seven days later, Pringle maneuver was used to perform hepatic inflow occlusion for 15 minutes, and serum levels of enzymes and bilirubin were measured at 1, 6, and 24 hours of reperfusion, as well as the levels of myeloperoxidase (MPO), tumor necrosis factor α (TNFα), Bcl-2, Bax, and human heat shock protein 70 (HSP70) and histopathological changes. Results At 1, 6, and 24 hours of reperfusion, there were no significant differences in total bilirubin and direct bilirubin between the two groups (bothP>0.05), and the PGE group had significantly lower levels of alanine aminotransferase, aspartate aminotransferase, MPO, and TNFα than the NS group (allP<0.05). At 1, 6, and 24 hours of reperfusion, compared with the NS group, the PGE group had a significantly higher level of Bcl-2 and a significantly lower level of Bax (both P <0.05). At 1 and 6 hours of reperfusion, the PGE group had significantly higher mRNA expression of HSP70 than the NS group (P<0.05), and at 24 hours of reperfusion, there was no significant difference in mRNA expression of HSP70 between the two groups (P>0.05). Compared with the NS group, the PGE group had a lower degree of liver injury, which manifested as reduced hepatocyte swelling and necrosis, clear structures of the hepatic cords and the hepatic sinusoids, regular arrangement of hepatic cords, and widened hepatic sinusoids. Conclusion PGE1 protects the liver with cholestasis against ischemia-reperfusion injury by reducing neutrophil infiltration and Bax expression and upregulating the expression of HSP70 and Bcl-2. Key words：cholestasis； reperfusion injury； alprostadil； rats, wistar

10.3969/j.issn.1001-5256.2017.05.022

2016-10-20；

2016-12-05。

遼寧省自然科學基金項目(2013021068)

徐鋒(1976-)，男，副教授，博士，主要從事肝膽胰疾病基礎與臨床研究。

戴朝六，電子信箱：daicl@sj-hospital.org。

R575

A

1001-5256(2017)05-0899-06